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斑点-酶联免疫吸附试验

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发表时间:2019-08-07 15:18作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

斑点-酶联免疫吸附试验


斑点-酶联免疫吸附试验

Hawkes等(1982)根据某些固相载体具有较强吸附蛋白质能力的特点,研究建立了斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA),目前在医学及兽医工作中得以广泛应用。该试验以硝酸纤维素薄膜(NC)作固相载体,代替了聚苯乙烯反应板,从而克服了ELISA方法中包被好的酶标板保存运送不便及检测需仪器等缺点,在1cm2大的薄膜上即可检测1份样品,且其操作简便,即在NC膜上依次滴加标本液(待测的抗体或抗原)、已知抗原(抗体)、酶结合物,作用一定时间后,加底物显色,出现棕色斑点者为阳性,无色者为阴性。

因建立Dot-ELISA的原理与常规ELISA相同,故常规ELISA可用Dot-ELISA代替,用于抗原、抗体的定性和定量等方面的检测。

硝酸纤维素膜是很好的固相载体,故Dot-ELISA有以下优点:①吸附力强,在中性缓冲液条件下,一般蛋白质包括某些不易被酶标板吸附的大分子及核酸都能被膜吸附;②同时可测几种抗体(抗原)。把几种抗原或不同血清型的几种抗原包被在一条薄膜上,便可同时测定一份样品中的几种抗体。这是ELISA所不及的;③最适合做试剂盒。酶标板体积大,包被后,需4℃保存,运送不便,不适于制试剂盒。而包被好的膜如同pH值试纸,体积微小,携带方便,常温干燥可保存一个月,操作简便,目测判定结果比ELISA方便。故最适于做各种试剂盒;④快速,一般在4小时内可获得测定结果。

需要注意的是,在正式测样品之前,需认真做好Dot-ELISA标准化预备实验。实验内容包括:①确定酶结合物最佳稀释度。一般以阴性样品不显色而阳性样品显色最强的酶结合物稀释度为最佳稀释度。②确定最佳包被浓度。包被浓度过高或过低都会使显色减弱、灵敏度下降。③底物显色的最佳条件。在ELISA方法中,辣根过氧化物酶反应的最佳pH值在5.6左右,而在Dot-ELISA方法中,如以盐酸联苯胺和过氧化氢为底物时,无论以何种缓冲液配制,加底物后,溶液pH值应在 5.8~6.0,此时反应最灵敏,强阳性出现蓝黑色斑点,弱阳性出现淡绿色斑点。当pH值>6.5时斑点显色为棕黄色,灵敏度稍低。当pH值过高时,因过氧化氢自动氧化而显色减弱。当pH值过低时,底物生成可溶性沉淀,斑点退色。

Dot-ELISA在测定不同的样品时,其标准化的结果不同,只有在确定了每一步的最佳反应条件后,才能充分发挥本方法灵敏度高、特异性强的优点。


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