衰老过程中不对称细胞分裂形成朴素和虚拟记忆T细胞免疫

有效的免疫反应依赖于CD8中的异质性。+T细胞，包括其他机制，是通过不对称细胞分裂(ACD)来实现的。在这里，我们发现衰老会对免疫反应产生负面影响，会损害小鼠CD8中的ACD。+T细胞，这种表型可以通过短暂的mTOR抑制来挽救。衰老小鼠有丝分裂细胞中ACD率的增加恢复了其细胞后代的扩展和记忆能力。CD8组分的进一步表征+T细胞揭示了虚拟记忆细胞(T)VM细胞)，在衰老过程中积累，具有独特的增殖和代谢特征，并保持其不对称分裂的能力，这与增加记忆潜力相关。对于幼稚的CD8来说，情况正好相反。+老年小鼠T细胞。我们的数据提供了证据，说明ACD调节如何促进T细胞在衰老过程中的长期存活和功能，从而为免疫系统如何适应衰老提供了新的见解。

有效的T细胞反应依赖于异质性.在CD8的背景下+T细胞，这是通过一个多样化的幼稚T细胞储备和能力的单个细胞产生效应和记忆后代，负责清除细胞内病原体和长期保护免受再感染。摘要不对称细胞分裂(Acd)是产生T细胞多样性的重要机制，它的丢失导致免疫反应受损，特别是在记忆T细胞池的形成和维持方面。1,2,3,4。在ACD上，单个T细胞可通过细胞货物的两极分离，使子代细胞继承不同的命运决定因素，最终形成不同的潜在命运。我们曾报道过树干度与CD8能力之间的相关性。+T细胞通过显示短暂的效应和耗尽的CD8来进行acd。+T细胞主要是对称分裂，而幼稚记忆和中央记忆多能CD8。+T细胞具有不对称分裂的能力。3.

免疫系统老化是一种多方面的现象，也被称为免疫发光，由于胸腺退化和抗原暴露史，T细胞的多样性受到威胁。这最终导致免疫反应效率低下和自身免疫易感性增加。5,6,7。在其他类型的细胞中，如造血干细胞(HSCs)，衰老过程中观察到的多样性的丧失与其进行ACD的能力受损有关。在这种情况下，HSCs中不对称命运的丢失显然不利于造血和干细胞的维持。8.

老年人胸腺功能的下降导致T细胞组成的实质性变化，因为更少的幼稚T细胞迁移到边缘，记忆表型CD8。+T细胞由于细胞因子驱动的同质性增殖而开始发挥更多的主导作用。9,10,11。此前未接触外源抗原记忆表型CD8+T细胞通常被称为虚拟记忆T细胞(T细胞)。VM)12,13,14,15,16,17,18,19。如何TVM细胞的产生一直是一个长期的问题，特别是关于这是一个独立的TCR或TCR指导的过程。而TVM在tcr转基因Rag缺陷宿主中可以发现细胞。20无论是无病原体小鼠还是无菌小鼠21，最近的一份报告发现了一组胸腺前驱物，其自身反应的tcrs可引起记忆表型c88。+T细胞22。与同源抗原记忆T细胞相比，T细胞VMα4整合素CD49d在细胞中呈低表达。因此，cd49d可以作为鉴别真记忆淋巴细胞和虚拟记忆淋巴细胞的合适标记。15,23,24.

TVM细胞表现出自相矛盾的特征：它们的CD 122表达增加，这是记忆细胞的一个特征，赋予了它们在感知IL-15方面的竞争优势，从而促进了它们的长期生存。14,25，但它们也是干扰素γ的有效产生者，这是效应细胞的一种特征，对老年人的感染起着主要的保护作用。26尽管它们的增殖潜能较低27。的确，TVM在没有抗原暴露的情况下，细胞在IL-12、IL-15和IL-18刺激下很容易产生细胞因子。13,14,19,27，并构成性地表达T-bet(一种促进效应基因表达的转录因子)以及效应分子，如颗粒酶B和NKG2D(通常存在于NK细胞和活化的T淋巴细胞中)，这些特征促进了它们的效应和旁观者功能。28.

随着年龄的增长，T细胞的组成发生了深刻的变化，特别是由于幼稚T细胞的减少和T细胞的持续上升VM细胞，是否有CD8的能力还有待解决。+接受ACD的T细胞受衰老的影响。在这项研究中，我们发现衰老会导致CD8能力的全面下降。+T细胞进行ACD。这一现象是由于在幼稚的CD8中发现的较低的ACD率所致。+老年动物T细胞，CD8+ TVM细胞具有这一特征，而不受衰老的影响。而不是真正天真的CD8+老年小鼠T细胞VM细胞对mTOR抑制介导的ACD的执行没有反应，这是一种能促进adc和记忆CD8的记忆电位的策略。+小白鼠T细胞3。功能上，CD8+ TVM与原始CD8相比，过继转移实验显示出更好的再膨胀潜力。+来自老年小鼠的T细胞，提供了不对称分裂能力与记忆潜能之间相关性的新证据。我们的数据表明，ACD可能在对抗免疫反应中起重要作用，因为它在T中被保留。VM细胞在老化的幼稚细胞中丢失，从而保持T细胞接受差异命运的能力VM细胞。

CD8+来自老年小鼠的T细胞较难接受ACD。

考虑到免疫过程中幼稚T细胞形成记忆群体的能力降低，我们研究了CD8的能力是否降低。+T细胞的ACD受衰老的影响。为此，我们使用了大量CD8。+从幼稚幼仔(8~16周龄)、中年(>40周龄)和老年(>70周龄)的p14小鼠(携带针对淋巴细胞脉络膜炎病毒(Lcmv)糖蛋白33-41(Gp 33)的转基因T细胞受体)分离T细胞。b)。CD8+在包被人FC-ICAM-1、α-CD3和α-CD 28的平板上刺激T细胞36h，使其进入第一轮细胞分裂，共聚焦显微镜鉴定为有丝分裂的不同阶段。用有丝分裂细胞上的CD8极化作为ACD的可靠读数。4。幼稚CD8中ACD率的比较+从年轻或中年/老年P14小鼠分离的T细胞显示，衰老与不对称分裂能力受损有关。我们以前已经证明，雷帕霉素对mTOR通路的短暂抑制是提高或恢复CD8能力的有效策略。+T细胞不对称分裂3。有趣的是，ACD的比率与年轻的CD8相当。+T细胞，在中年/老年CD8时恢复。+T细胞受短暂的mTOR抑制。1)。在测量T-bet和磷酸化S6的极化遗传时，我们观察到了类似的趋势。29,30,31(补充图。1)。总之，我们的数据提供了衰老损害CD8能力的证据。+T细胞经ACD处理后，短暂的mTOR抑制可使衰老小鼠细胞内的ACD恢复。ACD与树干和记忆电位相关3,4,30,31，这些结果揭示了一种振兴CD8的可能策略。+老年人的记忆性T细胞反应。

A小鼠CD8共焦像+T细胞在体外刺激α-CD3、α-CD 28和人FC-ICAM-1涂层井后36~40h固定。n=59；年轻R，n=49；中年/老年，n=171；中年/老R，n=74)。雷帕霉素(R)(20 NM)对mTOR有短暂抑制作用。细胞从激活后12h开始接受药物处理，直到共聚焦显微镜观察固定为止。标尺=10m。BCD8中观察到的ACD率+雷帕霉素对中老年小鼠和幼鼠T细胞mTOR的瞬时抑制作用。数据用平均±扫描电镜表示。C不对称分裂细胞频率的饼形图B。CD8不对称遗传水平用黑色表示，CD8对称遗传水平用灰色表示。三个独立实验的汇总数据。实验1和实验2(40-43周)和实验3(71周)。使用未配对的双尾学生进行统计分析。t测试一下。精确性P数值如图所示(另见附图)。1).

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ACD的重新建立恢复记忆潜力

此前有报道称，不对称分裂的能力增强，可以促进新出现的CD8的记忆潜力。+T细胞后代3。因此，我们决定测试这是否也适用于老年小鼠的细胞，其中短暂的mTOR抑制提高了体外ACD率。CD8+从老年P14小鼠(>70周)分离的T细胞在ACD条件下(+ICAM)刺激或不经瞬时雷帕霉素处理，并将其后代过继转移到幼稚和幼龄野生型受体小鼠(图1)。2A)。然后，受体急性感染200 FU LCMV-我们>30天后过继转移，有利于维持长寿命的细胞，可以生存在没有抗原，这是记忆细胞的特点。我们监测了过继转移的P14细胞在受体小鼠血液、脾脏和淋巴结(LNS)中的扩张情况(见图)。2B、C、F)。我们观察到更高的频率和数量的后代来自刺激条件下，mTOR被暂时抑制雷帕霉素。在LNS中，只有P14细胞出现表型变化，在那里，在体外刺激过程中短暂的雷帕霉素处理会产生具有更高频率和更多细胞致力于记忆命运的后代，被定义为KLRG 1。罗氏IL-7Rα嗨表达细胞(图1.2D，G)。此外，在短暂的mTOR抑制作用下，由较高的不对称率条件产生的后代细胞因子产生增加(TNF；图1)。2E)。当雷帕霉素处理的细胞后代中P14细胞总数较高时，我们也可以观察到这组细胞中产生干扰素γ和肿瘤坏死因子的细胞数量显著增加。这些数据一起提供了进一步的证据，证明ACD率的增加和后代的记忆潜力增加之间的相关性，这取决于他们在再次挑战时的生存和回忆反应的增强。

A实验装置(以MB为例)。用α-CD3、α-CD 28和人FC-ICAM-1包被井体外刺激衰老小鼠的幼稚P14细胞，经瞬时雷帕霉素(R)处理，36h后收获，并过继转入幼稚野生型受体。每只接受者老鼠收到1×104细胞感染LCMV>30天。BCD8中P14细胞的频率+血液中的T细胞。CCD8内过继转移P14细胞的频率和数量+受体小鼠脾脏T细胞。DKLRG 1的频率和数目嗨IL-7Rα罗氏或KLRG 1罗氏IL-7Rα嗨受体小鼠脾脏中的p14细胞。E脾干扰素γ和肿瘤坏死因子P14产生细胞的频率和数量。FCD8内过继转移P14细胞的频率和数量+受体小鼠腹股沟淋巴结T细胞。GLCMV 30天后受体小鼠淋巴结中KLRG 1和IL-7Rα表达的代表流式细胞仪图-我们挑战(左)；KLRG 1的百分比和数目嗨IL-7Rα罗氏和KLRG 1罗氏IL-7Rα嗨受体小鼠淋巴结中的p14细胞(右侧)。有代表性的数据(n=每组5)来自两个实验中的一个。进行过继细胞移植的老年P14动物：95周(实验1)；71周(实验2)。数据描述为平均值+扫描电镜。使用未配对的双尾学生进行统计分析。t试验(B-E, G或当数据未通过正常值检验时，未配对的双尾曼恩惠特尼(mann-Whitney)U试验(F, G，#KLRG 1嗨IL-7Rα罗氏)。精确性P值如图所示。

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TVM细胞具有独特的增殖和代谢表型。

CD8分析+从年轻和老年P14小鼠分离的T细胞显示CD8的能力受损。+老年小鼠T细胞进行ACD。鉴于CD8的异质性+T细胞存在于“幼稚”小鼠中，我们决定评估幼鼠和老年小鼠细胞间的表型差异。为此，我们分析了CD 44在CD8中的表达。+从幼龄(<16周龄)和老年(>70周)的P14小鼠血液中提取T细胞，正如以前的工作所表明的那样，衰老会导致CD 44的增加。嗨/CD 44罗氏T细胞比率32,33,34。CD 44频率嗨CD8内细胞明显增多。+老年小鼠T细胞池(图1.3A)。先前的一项研究提供了证据，证明在衰老期间CD 44的高表达与疲惫的信号之间存在相关性。32。考虑到CD8中的不对称率较低+老年小鼠T细胞及T细胞衰竭对CD8能力的影响+T细胞不对称分裂3，我们描述了CD 44是否嗨细胞会表现出精疲力竭的表型。外周血CD8染色+青年组和老年P14小鼠T细胞共抑制分子pd-1的表达35,36,37，以及耗尽标记CD 3938。与最近的研究一致27尽管pd-1有增加的趋势嗨和CD 39+CD 44细胞嗨CD8+在老年动物中，这些细胞在CD 44中仍占少数。嗨舱室(附图)2)。这些数据不包括精疲力竭，这是CD8中观察到的ACD降低的直接或主要原因。+老年小鼠T细胞。

ACD 122、CXCR 3、NKG2D和CD49d在CD8上表达的典型流式细胞术图+P14小鼠血液中的T细胞。CD 44频率罗氏和CD 44嗨CD8+T细胞表达高CD 122、CXCR 3和NKG2D水平，低CD49d表达于条形图中。两个独立实验的汇总数据(年轻，n=4：旧，n=5；老年小鼠：70、90或100周龄)。B描述纯化朴素或T细胞增殖的直方图VMCD8+年轻或老年小鼠T细胞(ctv标记，刺激α-CD3，α-CD 28和人FC-ICAM-1涂层井)。42h后，用CTV稀释法(左板)分析细胞增殖曲线，或在含IL-2、IL-7和IL-15的培养基中再将细胞转移至未包膜井中30h，直至刺激后72h(右侧)检测其增殖动力学。有代表性的数据来自两个实验中的一个(老年小鼠：70或82周龄)。C活化CD8的耗氧率(OCR)(上面板)和细胞外酸化率(ECAR)(下面板)+在基础条件下测定T细胞，并对所指示的药物作出反应。有代表性的数据来自两个实验中的一个，其中数据点是技术复制(年轻的天真，n=10；老天真，n=5，旧TVM，n4；老龄小鼠均>100周龄)。数据用平均±扫描电镜表示。使用未配对的双尾学生进行统计分析。t测试一下。ExacTP值如图所示。

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CD 44嗨CD8+众所周知，T细胞是随着年龄增长而积累的。39，有几份报告指出，这些细胞中有很大一部分是虚拟记忆细胞(T)。VM)14,18,19,26,27。调查CD 44是否嗨在老年P14小鼠中发现的较高频率的细胞确实是T细胞。VM我们首先对细胞进行了表型鉴定16。我们收集了未免疫的P14小鼠的血液，分析了CD 44、CD 122、CXCR 3、NKG2D和CD49d在CD8中的表达情况。+T细胞确认TVMCD8细胞表型、CD 44表达+T细胞伴CD 122、CXCR 3、NKG2D高表达，CD 49d低表达(见图)。3A)。此外，作为CD 44嗨CD8+T细胞不是CD49d嗨无论是年轻的还是年老的未免疫的P14小鼠，我们都排除了它们是抗原驱动的记忆细胞.其他的研究也显示出真实记忆c88的积累。+具有多克隆淋巴细胞储备的野生型动物衰老后的T细胞(Quinn等人)。27)。天真的P14小鼠中没有这种种群，这与他们的年龄无关，这证实了T。VM细胞来源于原始细胞，其机制与同源抗原识别“真”记忆细胞的分化机制不同。

进一步刻画TVM对老年P14动物血液中存在的细胞群，分别分析了朴素和T细胞的增殖特征。VM脾CD8+活化后42或72h，从幼龄小鼠和老年小鼠中分离出T细胞。3B)。在早期时间点(激活后42小时)，TVM与它们天真的同类相比，来自幼龄动物和老年动物的细胞经历的分裂较少。然而，激活后72h，TVM从年轻宿主中分离出的细胞增殖能力最高，而T细胞的增殖能力最高。VM来自老年宿主的细胞的增殖速度最低，但仍与原始CD8中的情况相似。+T细胞来自幼龄动物或老年动物。真正天真的CD8+在分析的两个时间点，来自幼龄动物和老年动物的T细胞均表现出非常相似的增殖特征。这些数据证实了以前的观察，表明TVM与幼稚细胞相比，年轻宿主的细胞循环速度更快。27，但同时也暗示了T细胞分裂的独特动力学。VM细胞，作为第一次分裂的时间似乎被延长，特别是那些起源于一个老化的宿主。细胞循环速度可能是不同代谢活动的结果，在T细胞分化中起着重要作用。40,41,42。据报道，静息TVMCD8+T细胞与原始记忆细胞或真记忆细胞相比具有不同的代谢能力，表现出较高的备用呼吸能力(SRC)。25。因此，我们研究了激活的朴素和TVMCD8+T细胞表现出代谢差异。因为T的频率VM特别是在年轻的P14小鼠中，这些细胞是非常罕见的，这些细胞不用于代谢检测。我们评估了幼稚CD8的代谢表现。+幼年和老年动物的T细胞和T细胞VM细胞活化后36h(细胞没有分裂或进行第一轮有丝分裂)用海马试验。朴素与TVMCD8+老年动物的T细胞在其SRC方面的表现优于年轻个体的幼稚细胞(如图所示)。3C、上面板)。T型VM老年个体的细胞在糖酵解能力和糖酵解储备方面表现出与年轻的幼稚细胞相似的糖酵解能力，老年宿主的幼稚细胞表现出功能受损(图一)。3C，下面板)。这可能表明激活的TVM来自老年宿主的细胞通过代谢适应，通过使用糖酵解和氧化磷酸化(Oxphos)来维持它们的代谢需求，同时也是“慢分裂剂”，这是以前报道过的有利于add的特性，从而迅速响应环境的变化。3和记忆的形成42.

TVMCD8+T细胞表现出内在高的ACD率。

朴素与T表型、功能及代谢差异的观察VMCD8+T细胞导致我们研究他们的不对称分裂能力是否也会有差异。为此，我们对CD8进行了分类。+青年组P14小鼠脾和LNS T细胞分化为幼稚细胞(CD 44)罗氏)和TVM(CD 44)嗨、CD49d罗氏)人口。然后，在Acd条件下体外刺激细胞，并以雷帕霉素或Akt-激酶抑制剂抑制mTOR，已知这种抑制作用能提高原始和记忆CD8中的acd率。+青年T细胞3。朴素与T的分离VM刺激前的细胞可以直接比较它们进行ACD的能力，并区分哪些细胞对mTOR抑制有反应，诱发更高的ACD率，并在过继转移后表现出更好的记忆电位(图1)。1和2)。T型VMCD8+根据CD8的极化水平，年轻和老年小鼠的T细胞表现出内在的高ACD率(如图所示)。4B、C)。相比之下，幼稚的CD8+与未成熟的CD8相比，老年小鼠T细胞的ACD能力明显受损。+小白鼠的T细胞。4A，C)。AS TVM细胞第一次有丝分裂需要更长的时间，分裂T的频率很可能VM大量CD8中的细胞分析+刺激后36h的T细胞群(见图)。1)代表人数偏低。此外，我们不能排除被分析的有丝分裂细胞可能代表一个T的池VM保留其增殖潜能的细胞。然而，这些结果表明，天真的CD8+T细胞对c8s整体较低的ACD率起作用。+从老年P14小鼠中分离出T细胞，并与其幼鼠相比较(图1)。1)。T中固有的高ACD率VMCD8+雷帕霉素和Akt激酶抑制剂均不能进一步增加T细胞，而CD 44则不能进一步增加T细胞。罗氏幼稚CD8+在相同的条件下，幼鼠和老年小鼠的T细胞的ACD率都有增加(图1)。4C)。幼稚CD8的反应性+用雷帕霉素治疗老年小鼠的T细胞可解释在CD8总量时重新建立的不对称现象。+用雷帕霉素治疗老年P14小鼠T细胞。1)。我们推测T中ACD调制失败VMCD8+T细胞可能是由于其mTOR活性高于他们的幼稚细胞，以及抑制剂的作用，至少在他们所使用的浓度，在下调这种活性，特别是与下游目标的mTORC 2(补充图2)。3)。由于ACD依赖于稳定的免疫突触的形成，我们分析了CD3、CD 28和lfa-1在Naive和T中的表达。VMCD8+T细胞，并观察到后者表面LFA-1水平明显升高，可能是其内在高ACD率的原因之一(补充图1)。4)。在进行多克隆CD8实验时，我们得到了类似的结果。+野生型C57BL/6小鼠T细胞(附图)。5)。考虑到能够更不对称分裂的细胞后代所表现出的优越的记忆潜力，这些结果表明，老年人的免疫受损反应可以通过重新建立他们在原始CD8中进行acd的能力而部分恢复。+T细胞通过短暂的mTOR抑制。此外，由于ACD有助于建立免疫记忆，T的内在能力VMCD8+T细胞不对称分裂可能是维持衰老时有效T细胞反应的一种代偿机制。

A小鼠原始CD8共焦图像+T细胞B小鼠T的共焦图像VMCD8+T细胞细胞经体外刺激后36~40h固定在α-CD3、α-CD 28和人FC-ICAM-1包被井上.雷帕霉素(20 NM)或Akt-激酶抑制剂(5M)对mTOR有短暂的抑制作用。细胞从激活后12h开始接受药物处理，直到共聚焦显微镜观察固定为止。标尺=5m。C朴素和T细胞中CD8不对称率的研究VMCD8+从幼鼠或老年小鼠分离的T细胞(年轻的幼稚C，n=28；年轻的天真的Akt I，n=30；年轻的朴素R，n=38；年轻TVMC，n=23；年轻TVMAKT I，n=19；年轻TVMr，n=20；老天真C，n=51；老天真的Akt I，n=47；老天真R，n=42；旧TVMC，n=37；旧TVMAKT I，n=51；旧TVMr，n=52)。不对称分裂细胞的频率在每个图的右侧用饼形图来描述。D青年幼稚、老年幼稚、年轻T细胞CD8极化的比较VM老TVMCD8+T细胞(年轻的幼稚，n=28；老天真，n=51；年轻TVM, n=23；旧TVM, n=37)。数据显示为平均值±扫描电镜。来自五个独立实验(老年小鼠：71，95，97,102或108周)的汇总数据。在每个实验中，从至少两只动物中分离出细胞。使用未配对的双尾学生进行统计分析。t测试一下。精确性P值如图所示。

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ACD调制靶幼稚CD8+老年小鼠T细胞

在CD8之内+作为重建ACD的一种策略，P14小鼠的T细胞表现出较强的抗ACD能力，但同时对短暂的mTOR抑制反应最好。探讨通过调节这些幼稚的CD8中的ACD来提高免疫应答的潜力+T细胞，我们过继地转移了被刺激的朴素和T的后代。VMP14细胞从年轻的和年老的老鼠变成天真的野生型受体(图)。5A)。在ACD条件下进行刺激，雷帕霉素对mTOR有无短暂抑制作用。30天后，接受人感染LCMV-we，检测病毒攻击后30天脾脏中P14细胞的数量(图)。5B、C)。雷帕霉素处理的幼龄和老年P14小鼠的P14细胞的后代数量高于未处理的P14小鼠(图1)。5B)。CD8后代+ TVM在体外刺激过程中，无论是否存在mTOR抑制，幼鼠和老年小鼠的细胞都扩展到可比较的频率或总数。由于mTOR抑制不能增强他们的ACD能力，这些数据加强了ACD能力与形成记忆细胞池的潜力之间的相关性。雷帕霉素治疗后后代的表型没有明显变化，但至少对于幼鼠的幼稚细胞来说，KLRG 1的频率有上升的趋势。罗氏IL-7Rα嗨和较低频率的KLRG 1嗨IL-7Rα罗氏雷帕霉素治疗组细胞数见图。5C)，正如我们以前报告的那样3。有趣的是，成年CD8的后代+ TVM细胞KLRG 1的频率显著降低。罗氏IL-7Rα嗨细胞，伴随着klrg 1和IL-7Rα双阳性群体的出现，这是已知的效应器样记忆细胞，具有较强的细胞毒性活性。43(无花果)5C)。功能上，干扰素γ和肿瘤坏死因子产生的细胞频率不受细胞类型或老化的影响。5D)。幼稚CD8后代P14细胞总数较高+雷帕霉素和T的后代对T细胞的瞬时处理VM除雷帕霉素治疗外，我们还观察到在这些组中，干扰素γ和肿瘤坏死因子产生细胞的数量都显著增加。这些结果共同强调了ACD、记忆潜能和有效免疫反应之间的联系，并提供了关于ACD的能力如何受衰老影响的新见解。我们建议CD8+ TVM细胞可能代表对免疫功能的适应，并补偿幼稚细胞中ACD电位的丧失。此外，作为幼稚CD8的记忆潜力+短暂的mTOR抑制和ACD率的增加可以增加老年宿主的T细胞，这些数据增强了这种干预在再生医学中的应用潜力。

A实验装置(以MB为例)。朴素与TVMCD8+T细胞从幼龄和老年P14小鼠脾脏中分离，在不同条件下刺激，36h后收获，过继转入野生型受体。每只接受者老鼠收到1×10430天后用LCMV-we(200 FFU)静脉感染细胞。BCD8内过继转移的P14细胞数+受体小鼠脾脏T细胞。CKLRG 1的百分比和数目嗨IL-7Rα罗氏，KLRG 1罗氏IL-7Rα嗨和KLRG 1嗨IL-7Rα嗨受体小鼠脾脏p14细胞(左侧)。显示门控策略的典型图，用于访问KLRG 1和IL-7Rα(右面板)的表达。D受体小鼠脾脏中干扰素γ、肿瘤坏死因子和IL-2产生细胞的频率和数量。两个独立实验的汇总数据(年轻的天真，n=8；年轻的朴素R，n=8；年轻TVM, n=3；年轻TVMr，n=3；老天真，n=6；老天真R，n=6；旧TVM, n=7；旧TVMr，n=8)。P14代代细胞移植动物：92周或96周(实验1)；70周或75周(实验2)。数据描述为平均值+扫描电镜。使用未配对的双尾学生进行统计分析。t测试一下。精确性P值如图所示。

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衰老与增强有效和持久的免疫反应的效率逐渐下降有关，并导致小鼠和人类更容易受到感染。44。免疫的几乎所有方面都受到衰老的影响，从最初接触病原体到清除或与持续存在的病原体共存。7。关于T细胞反应，在衰老过程中观察到的最深刻的变化是胸腺退化。10,45导致外周T细胞维持机制发生明显变化。随着胸腺产量的降低，已经处于外周的T细胞会经历更多的同质性增殖。在尚未发现的其他因素中，这有助于它们的表型的幼稚到记忆的转换，这种转换与同源抗原的相遇无关，因此这些细胞被称为虚拟记忆细胞。13,14,15,17,18,19,27。T型VMCD8+T细胞随着衰老而积累，依赖于细胞因子来维持。除了通过T细胞受体激活发挥效应功能外，TVMCD8+T对细胞因子的激活也有反应。14,19,28.

在本研究中，我们的目的是研究衰老免疫系统的一个新方面，并对CD8的能力进行表征。+T细胞进行ACD。我们对大量CD8的研究结果+T细胞显示，来自老年小鼠的总幼稚细胞分裂的不对称程度比他们的年轻的对手。我们以前开发了一种策略，通过雷帕霉素或Akt-激酶抑制剂短暂抑制mTOR来提高Acd率，这是基于mTOR抑制记忆形成的据报道的好处。46,47。在体外刺激过程中，这种短暂的mTOR抑制对天真、记忆和pd-1后代的记忆电位的增强是有效的。INTTcf 1+精疲力竭的CD8+T细胞3。与此相关的是，mTOR是从酵母到哺乳动物等不同有机体衰老的关键调节因子。48，其抑制作用与老年小鼠和人的寿命延长和免疫功能的改善有关。49,50。此外，抑制酵母中的同源途径TOR，通过提高ACD率，有助于酵母细胞的再生。51。暂时性雷帕霉素治疗CD8+来自老年小鼠的T细胞确实导致了ACD率的增加，这证实了我们最初的假设，即ACD可以在这些细胞中被调节。这一显著的结果被证明是功能相关的，因为来自强制ACD条件的后代在病毒攻击模型中表现出更好的记忆潜力。

根据以前的报告，我们观察到CD 44显著增加。嗨/CD 44罗氏老化比32,33,34，并确定了新出现的CD 44嗨人口为TVM细胞。除了与幼稚T细胞在表面标记表达上的表型差异外，TVM细胞也表现出不同的增殖速率和代谢。体外刺激TVM与它们幼稚的同类相比，来自幼龄动物和老年动物的细胞需要更长的时间进行第一轮分裂。然而，在后来的时间点，当T的后代被观察到相反的情况。VM细胞有相似或更高的增殖率。活化TVM细胞/后代获得了独特的效应记忆混合代谢图谱，能够同时依赖糖酵解和OXPHOS。

朴素与T在观察表型、增殖动力学及代谢方面的差异VMCD8+T细胞导致我们研究哪一种细胞类型对c8s中发现的较低的acd率有影响。+T细胞来源于老年小鼠。令人惊讶的是CD 44的能力罗氏幼稚CD8+T细胞受CD8等衰老的影响很大。+与年轻小鼠相比，老年小鼠T细胞的ACD率较低。这种缺陷可以通过短暂的mTOR抑制来逆转。正如预期的那样，在体外观察到的ACD率的增加导致了功能的改善，并与体内抗原刺激下的更高的再膨胀潜能相关。相反，TVM细胞内有较高的ACD率，短暂的mTOR抑制不能进一步增加ACD率。由于ACD被认为有利于不同的T细胞反应，特别是传递记忆潜力，我们建议TVM细胞是免疫系统对免疫过程的适应。事实上，我们的结果可能解释了TVM最后，细胞构成了CD 44的大多数。嗨CD62L嗨 T厘米LCMV感染小鼠的细胞数量25，或者这些细胞是如何构成大部分中央记忆c88的。+T细胞(T)厘米)LM-OVA抗原挑战后的间隔，同时也能产生效应反应。19.

T的最佳膨胀势VMCD8+T细胞后代在过继转移实验和抗原挑战实验中与他们天真的后代相比，与以前的研究结果相矛盾，其中CD 44。罗氏幼稚CD8+在这种情况下，t细胞被描述为优越。27,32。然而，不同的实验装置可以解释不同的实验结果。在我们的研究中，过继转移的细胞是T的后代。VM接受ACD治疗的细胞在再次攻击前必须存活30天以上.在以前的研究中27,32，受体小鼠接受未受刺激的细胞，立即用同源抗原免疫，或不接受治疗，以评估幼稚CD8的差异存活。+T细胞和T细胞VMCD8+T细胞

综合起来，我们的结果表明T的延长时间VM细胞进行第一轮分裂有利于ACD，从而建立不对称的命运，这也有可能解释他们独有的增殖和混合代谢表型。ACD有助于同时增加(1)依赖OXPHOS的记忆细胞池，并显示出较高的src；(2)依赖糖酵解的效应细胞池，并在随后的时间点经历快速增殖。42。我们观察到VM来自老年动物的细胞，其CD 122的表达比他们的幼稚动物要高，在体外限制IL-15浓度的情况下，他们是更好的幸存者，这凸显了存活在观察到的过继转移细胞在重新刺激/再膨胀时的恢复中的潜在作用(补充图1)。6)。因此，CD8的虚拟内存池+T细胞可能表现出对衰老免疫系统的适应，在没有以前的抗原接触的情况下，维持一个类似记忆的细胞池，而不影响效应反应。

一个尚未解决的问题是T的耐折性的原因。VMCD8+T细胞对mTOR的抑制作用是通过调节ACD速率来测量的。已知，CD 44的参与会导致Akt下游磷酸化，从而使mTOR活性总体提高。52。当我们评估mTORC 1和mTORC 2活性时，用S6和NFκB磷酸化水平来衡量。53，我们的数据表明TVM与幼稚CD 44相比，细胞具有较高的基础mTOR活性。罗氏对应物和不耐mTORC2抑制(补充图。3)。由于有证据表明mTORC2的抑制是一种有效的ACD调制策略。3这些数据表明，mTORC2活性可能是T细胞缺乏ACD调制的原因之一。VM细胞及其有效的糖酵解代谢。此外，在TVM CD8中无法调节ACD。+通过雷帕霉素或Akt-激酶抑制剂治疗T细胞，可能是由于mTOR在CD8中的作用改变所致。+T细胞衰老，有可能导致下游目标的差异激活。54,55,56。然而，其内在不对称分裂能力较高的原因仍未解决，需要进一步研究。

暂时性mTOR抑制能有效恢复幼稚CD8的能力+老年小鼠T细胞进行ACD。这与LCMV挑战后转移细胞的再扩张有关，这证明了它们具有更好的生存能力和记忆潜力。因此，ACD的重新建立可能代表了一种恢复衰老的幼稚CD8的策略。+T细胞见于老年人。相反，TVM细胞内有较高的ACD率，短暂的mTOR抑制不能进一步提高ACD率。在功能上，这些特性最终通过过继转移实验显示出更大的记忆潜力，提供了ACD和有效免疫之间的进一步联系。T的积累VM因此，老化的细胞至少在某种程度上可以弥补幼稚细胞记忆能力的减弱。在老年人中增强这些幼稚细胞中的ACD可能为改善老年人的免疫功能提供新的视角，并为免疫系统如何适应衰老带来新的见解。