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BAS-酶联免疫吸附试验

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发表时间:2019-08-07 15:16作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

BAS-酶联免疫吸附试验


BAS-酶联免疫吸附试验(BAS-ELISA)是ELISA的一种改良技术,将BAS,即生物素-亲和素系统(biotinavidin system)引入ELISA,大大提高了ELISA的灵敏度。


(一) 亲和素和生物素


1. 亲和素(avidin) 给动物饲喂大量卵白蛋白后,可引起生物素缺乏症,此后证明,卵白蛋白中存在一种对生物素有异常亲和力的碱性蛋白,称之为抗生物素蛋白或卵白素,现今均称为亲和素。因为亲和素存在于卵白蛋白中,故可从鸡蛋白清中提取亲和素,它是由四个相同的亚基组成的碱性糖蛋白,分子量6.6~6.8万,等电点为10.5,由于每个亚基都可以结合一个生物素分子,所以亲和素呈四价反应性,在血清学反应中,可以产生新的放大作用;现规定凡结合1μg生物素所需亲和素的量,即为亲和素的一个活性单位,1mg纯亲和素约含13~15个活性单位。


2. 生物素(biotin) 即维生素H,主要存在于卵黄、肾、肝等组织中,除可提取外,也能人工合成,另外在动植物体内也广泛存在,系结构简单的小分子物质,分子量244.31,它不能直接与亲和素结合,需活化后,产生生物素衍生物(即生物素酰羟基丁二酰亚胺,BNHS,为白色结晶,熔点200~202℃)才能与亲和素结合。另外,它还能高比度地偶联抗体等反应物质和酶等标记材料,分别制成生物素化抗体和生物素化酶等,在免疫反应中起到一级稳定的放大作用。

因为亲和素对生物素有极强的特异性结合作用,且具有多价性,据此,可以建立生物素化抗体-亲和素-生物素化酶复合物酶联免疫吸附试验检测体系,利用亲和素为中介,一端通过生物素化抗体联接检测抗原的免疫反应系统,另一端通过生物素化酶等连接标记显示系统,可产生多极放大作用,从而明显地提高了检测的特异性和敏感性。


(二) BAS-ELISA的技术类型 该检测系统可分为以下两类:


1. BAB法 (biotin-avidin-biotin) 即以游离的亲和素分别桥联生物素化抗体和生物素

化酶的检测方法。目前最常用的是本法的改良法,即预先使亲和素与生物素化酶形成复合物(avidin-biotin-peroxidase complex, ABC),再使其与生物素化抗体反应,因而叫做ABC法,此法既减少了反应步骤,又因ABC网格结构可网络数量极为可观的酶分子,从而使BAS的灵敏度又得到了进一步的提高。

2. BA法 (Ab-biotin-avidin-HRP)即直接以酶标亲和素联接生物素化抗体,检测抗原的方法。

为简化反应程序,厂家试制了酶联BAS试剂,连接被检测的免疫反应系统是生物素化抗体,即生物素化抗抗体-羊抗兔(SARG-b)和兔抗小鼠(RAMG-b)及一种生物素化抗体-生物素化马抗人AFp。较常用的生物素化酶是生物素化辣根过氧化物酶(b-HRP)。


(三) BAS-ELISA在检测工作中的应用 该技术应用最多的一个方面是检测可溶性抗原如细菌和病毒等,以及它们的相应抗体,现举例如下:

1. 细菌性抗原的检测 Yolken等采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测流感杆菌b型、肺炎球菌和链球菌抗原等,先用相应抗体包被酶标板,然后分别加入细菌培养上清液、生物素化抗体和亲和素与生物素化酶复合物来实施反应;本法检测的灵敏度比常规ELISA和荧光抗体法高4~16倍。

2. 病毒性抗原的检测病毒性抗原也可用双抗体夹心法检测,如检出粪便中的轮状病毒,可用抗体包板,再相继加入待检标本、生物素化抗体、亲和素和3H标记的生物素,然后作放射免疫测定。国内已用此法检测单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、肺炎病毒及其相应抗体。


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