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急性住院患者流感病毒感染恢复的免疫细胞网络

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发表时间：2021-05-12 10:42作者：武汉新启迪Xinqidibio

摘要

在一项单一的研究中，先天和适应性免疫反应如何协同作用以解决流感疾病尚未得到充分的研究。在这里，我们利用来自急性流感住院患者的纵向样本来了解这些免疫反应。我们报告了18项与临床、遗传和病毒学因素有关的重要免疫参数在不同严重程度流感患者中的动态变化。流感病毒病与IL-6/IL-8/MIP-1α/β细胞因子升高及抗体应答降低有关。循环T滤泡辅助细胞的强激活与抗体分泌高峰细胞和流感病毒特异性记忆B细胞数量相关，这与免疫诱导的B细胞反应不同。流感特异性CD8数+或CD4+T细胞在疾病早期增加，并在病人康复过程中保持活跃的表型。我们报告了从流感感染中恢复的免疫细胞网络的特征，这些网络与其他传染病高度相关。

导言

每年有数以百万计的人因严重流感而住院。2017年，全球估计有950万人因流感病毒下呼吸道感染住院，共计8 150万天1。此外，估计每年有243,000至645,000宗季节性流感相关的呼吸系统死亡个案。2。虽然季节性流感病毒感染会导致虚弱的疾病，导致住院和死亡。3决定疾病严重程度的病毒、宿主和免疫因素尚不清楚，也不清楚为什么有些人出现轻度“无症状”感染，而另一些人，包括先前健康或接种疫苗的人，则死于严重病毒性肺炎和致命流感。流感病毒感染的易感性增加和疾病严重程度的加重可能反映了先天免疫系统的过度激活，导致细胞分裂症、肺泡水肿和肺部并发症，以及(或)体液和细胞免疫功能受损，延缓了恢复期。虽然中和抗体可以减少疾病的传播和病毒载量，但目前的疫苗接种方案都是针对抗体反应的。4通常是短命的，针对特定的流感毒株，因此对未预料的流感病毒没有保护作用.

根据人类对自然和实验性流感病毒感染的研究，可以确定在没有中和抗体的情况下，预先存在的记忆CD8。+T细胞和CD4+T细胞可减轻疾病的严重程度5,6,7,8,9,10,11,12,13,14。已发表的证据还表明，遗传宿主因素，如特定的HLA类型和干扰素诱导的跨膜蛋白3(IFITM 3)单核苷酸多态性(SNPs)，与临床预后不良有关。15,16,17,18,19。在我们2013年对住院H7N9感染患者的研究中，IFITM 3 rs12252-C/C基因型以及早期检测入院后48小时血液中的炎症介质IL-6、IL-8、IL-10和MIP-1β与致命性疾病的结局有关(n=18例，12例痊愈，6例死亡)18。高细胞分裂素血症(IL-8，MCP-1，ip-10)与致命结果的关联首次被报道为h5n1病毒。20。相反，从H7N9感染中恢复则与较低的细胞因子水平和显著的CD8有关。+T细胞反应18。炎症性血清细胞因子IL-6和IL-8也与住院成年患者的严重季节性和大流行性流感病毒感染有关。21并预测在一组自然感染的家庭中住院，其中包括婴儿、儿童和成人。22。危重患儿入院72h内血细胞因子(IL-6、IL-8、ip-10、gm-csf、mcp-1和mip-1α)水平升高与致死性流感病毒感染有关。23.

有关导致严重流感住院或死亡的主要因素，资料甚少。24,25。以往对流感患者队列的研究主要集中在特定数量的免疫学参数上，只有三项研究结合了先天(细胞因子/单核细胞/NK细胞)和适应性T细胞免疫。12,26,27，以及另外两项结合天然免疫、T细胞免疫和抗体反应的研究。10,28。测量的参数数量有限，通常是由于难以从急性感染患者获得纵向样本，再加上每次化验所需生物材料的数量。只有另外一项研究，颤抖报告28分析恢复期样本，2周后(与一个急性样本)，并显示长期免疫激活的先天和适应性细胞反应的住院病人相比，非住院病人。因此，我们对遗传学、先天免疫和适应性免疫反应之间的具体相互作用的理解明显不足，这推动了急性病毒性肺炎的恢复。

在此，我们利用从急性流感患者中获得的纵向样本来阐明先天免疫反应和适应性免疫反应是如何共同作用于解决流感疾病的。我们以很高的分辨率报告了18个关键免疫参数的总体宽度和动力学：抗病毒/炎症细胞因子和趋化因子、血凝素(HA)定向抗体、HA探针特异性B细胞、抗体分泌细胞(ASCs)、循环CD4。+T滤泡辅助(CTfh)细胞，流感肽/mhc特异性CD8+和CD4+T细胞，产生γ的CD8+T细胞，CD4+T细胞、自然杀伤细胞(NK)、黏膜相关不变T细胞(MAIT)、γδT细胞及CD8中颗粒酶A、B、K、M和穿孔素的表达+，CD4+、NK和MAIT细胞。这个全面的免疫参数小组，结合宿主遗传因素和病人的临床数据，能够详细分析导致季节性流感病毒住院患者的易感性、严重程度和康复的人为因素，这些因素与其他传染病，特别是新出现的呼吸道感染高度相关。

结果

病人DISI队列

在2014到2017年间，我们招募了64名患者到阿尔弗雷德医院(澳大利亚普拉兰)进行“流感特异性免疫剖析”(DISI)。DISI研究的纳入标准包括同意的成人流感样疾病(ILI)患者的住院治疗。纵向研究包括从流感-聚合酶链反应阳性患者(流感+，n=44)在入院后1-2天内出院和随访血样~30天后，允许对恢复阶段进行分析(如图所示)。1A)。流感-聚合酶链反应阴性(流感)的病人n20)包括在内，这是一组独特的其他呼吸道疾病患者，其中一些是由病毒感染引起的。DISI队列包括流感+组和流感组各一名死亡患者(分别为#11和#28)。剩下的一群人被送进了呼吸/普通病房，其中一名流感+病人需要重症监护病房(第62名)。53名病人有ILI，6名流感+和1名流感患者出现肺炎(补充表)1，补充数据1).

我们成功地召回了80%(35/44)的流感+患者在发病后41天的中位数和75%的我们的流感患者(15/20，中位数39天)。总的来说，流感+患者主要(55%)感染H3N2流感病毒(IAV)亚型(图)。1B和补充表1其次是2009年甲型H1N1流感大流行(Ph1n1)样株(16%)和两株共同循环的B型流感病毒(phuket/3073/2013(9%)和布里斯班/60/2008(7%)，是澳大利亚每年的优势株。IAV感染患者(中位数58岁，n=34)明显大于IBV感染年龄(45岁，n=10)和流感患者(47岁，n=20)(图1。1C)。除年龄外，流感+组和流感组患者的人口统计数据吻合良好，分别为86%和70%，有一种或多种严重流感疾病的高风险条件。两组住院天数中位数均为4天(补充表)1，补充数据1)。季节性流感+患者的住院时间明显低于病情较重的H7N9患者。18平均14天的康复时间(n=12，p < 0.0001, Kruskal–Wallis test) and a median of 33 days for those who died (n=6，p=0.0437，Kruskal-Wallis检验)(图1.1D)。较低的医院负担反映了季节性流感的严重程度低于A/H7N9禽流感。

细胞因子簇在流感病毒感染过程中相互正相关

早期炎症介质(IL-6、IL-8、IL-10、mcp-1、mip-1α和mip-1β)的高细胞分裂血症与一些住院队列中导致死亡的疾病严重程度的增加有关。18,21,22,23。急性典型流感+患者血液中的促炎细胞因子和趋化因子显示，轻、中度患者间细胞因子水平升高，尤以较低(0-1)或更高(2-6)序贯(脓毒症相关)器官衰竭评估(沙发)评分为标准，尤以IL-6和IL-8为主。29，和在更严重的病人需要重症监护病房的支持(如图所示)。1E)。升高的IL-6水平也与更严重的2013年H7N9感染患者有关(图一)。1E)18。在调整发病年龄和发病天数后，IL-6、IL-8、MIP-1α、MIP-1β和IFN-γ在感染后早期与V1时点呈显著正相关。除干扰素-γ外，这种相互关联的细胞因子簇在恢复期仍有很强的表达，同时也存在干扰素-α、IL-17和IL-10的融合(图1)。1F)。因此，我们的数据支持以前的报道，IL-6，IL-8，MIP 1α和MIP-1β可作为重症流感的生物标志物。

恢复期抗体反应的幅度和广度增加

根据国家免疫计划，每年向高危人群免费提供流感疫苗。尽管在这一组中流感+患者的比例很高，被定义为因疾病发生前的高危人群(86%)，但只有48%的患者在感染前接种了流感疫苗，而65%的流感患者接种了疫苗(补充表)。1)。在2014至2017年间，H3n2病毒的抗原迅速漂移，H3-HA疫苗组分的年度更新比较少变化的H1-HA和B-HA组分(补充表)更多。2)。H3N2组分的快速漂移在H3N2感染患者鼻拭子的病毒HA序列分析中表现出明显的快速漂移。从病人身上分离出的12种H3N2病毒，包括9种接种过疫苗的H3N2病毒，与目前的H3N2季节性疫苗株相比，都来自不同的H3N2毒株(图一)。2A)。相反，与WHO参考菌株相比，从感染患者中分离出的H1-HA和B-HA序列变异较少(补充图)。1)。有趣的是，尽管H3N2类错配，所有感染H3N2的患者(一名A/非亚型患者除外)都产生了40及以上的HA抑制(HAI)抗体滴度(相当于log)。2(海/10)>2)对H3疫苗株(与感染相同年份)的随访，与急性时点的54%(图1)相比，差异有显着性(P<0.05)。2B)，这可能是导致疫苗株滴度显著增加的原因之一。p < 0.0001, Mann–Whitney test). However, only marginal increases in antibody titres were observed in H1- and B-infected patients at follow-up (Fig. 2B)。在急性感染期间，H1、H3和B三种亚型的几何平均滴度(Gmt)都很低，但它们在随访时增强抗体反应的能力一般与健康人群中疫苗诱导的反应相当，但GMT的变化更大(图1)。2C，d)。正如预期的那样，抗体滴度很低，流感组抗体滴度保持不变。2C，d).

以往曾接触过受年龄影响的流感病毒株，会影响我们对现时流感病毒感染的免疫反应。30。为了研究抗体反应的广度，从上个世纪开始，针对病人可能遇到过的现有和较老的流感病毒株，产生了HAI抗体景观(补充表)。2)。在急性感染(V1和V2)期间，对过去菌株的抗体反应极小(图1和V2)。2E，f)。然而，在随访中，流感+患者对来自他们被感染的同一亚型的老毒株产生了强有力的抗体反应，这一现象被称为“背向增强”现象。30，但不是针对其他亚型(图1)。2E，f)。因此，与流感和健康人群相比，流感+患者在住院时抗体滴度较低，这可能是由于疫苗覆盖率较低，但在恢复期能够产生强有力和广泛的抗体反应。

CTfh、aSCs和流感特异性记忆B细胞在恢复前的激活

Tfh细胞是生发中心产生高亲和力记忆B细胞的必需细胞，位于次级淋巴器官。31。Ctfh细胞与gc tfh细胞具有共同的表型和功能特性，并且已经证明灭活的流感疫苗(Iiv)可诱导CD4的扩增和pd-1/icos-活化。+CXCR 5+CXCR 3+CTfh-1型(CTfh 1)细胞，与抗体和CD 19相关+CD 27++CD 38++ASC反应4,32.

在这里，我们展示了活化的pd-1+ICOS+Ctfh 1细胞与ASC反应并行出现在流感患者体内，在流感+组和流感组发病后第7天至第10天达到高峰，然后患者恢复(图1)。3A-d，补充图。2A)。活化的cTfh 1细胞在流感+组高于流感组，如95%可信区间的分离和个别患者的动态反应所示(图)。3C-d，补充图。2A)。急性感染时ASCs数量明显高于流感+组和流感组(2~8倍)。3E)。此外，急性期流感+患者的ASC数量高于我们先前描述的接种前健康人群(4.4倍)和疫苗接种后第7天(2.6倍中位数)，后者是疫苗应答的高峰。活化的cTfh 1细胞在急性时也比随访时高(~2倍)，p=0.0519，曼-惠特尼检验，图.3F)。急性流感+患者活化的cTfh 1细胞数量仅比正常人高1.5倍，而在健康人群中仅略低于接种后的d7。这在一定程度上可能是由于患者在急性疾病期间的淋巴细胞减少状态，其中CD 45的总量。+与随访相比，急性V1期淋巴细胞和亚群特异性细胞计数明显降低，但B细胞除外，这解释了在急性患者中观察到的较高的ASC数。细胞计数在流感患者中变化较小，在健康献血者中更稳定(附图)。3A-c).

然而，在急性和随访时间点，流感+患者活化的cTfh 1细胞数明显高于cTfh 2和cTfh 17亚群(图1)。3F)。此外，cTfh 1反应与ASC反应密切相关(rs=0.7060，p < 0.0001, Spearman test) during acute influenza virus infection, but less so for total cTfh (rs=0.5397，p=0.0003，Spearman检验)和cTfh 2细胞(rs=0.3741，p=0.0174，Spearman检验)，与cTfh 17亚群无相关性(图1)。第三代)。而急性ASC反应与流感患者的cTfh、cTfh 1和cTfh 2 T细胞亚群有很强的相关性(图一)。3H)。急性asc反应也与高抗体反应相关(Log)。2(海/10)>2或HAI>40，图4。3I)。然而，急性cTfh反应与抗体反应没有显著的相关性，这可能是由于某些患者在急性感染期间观察到的滴度较低，而免疫接种反应则是由iv诱导的cTfh 1反应与抗体滴度的重叠变化相关(d28超过d0基线)。4.

为了评估自然流感病毒感染时流感特异性记忆B细胞的反应，将与2014-2017年疫苗株相关的重组透明质酸探针用于检测类转换型gdd。–流感+患者的HA特异性B细胞(图)。4A，补充图。2B)。这些rha探针因其特异性而得到了广泛的验证。4,33,34。RHA数+IGD–在急性和随访时间点之间，B细胞总数和每个探针没有明显变化(如图所示)。4B)，并与在IIV之后观测到的震级相比较。4。总B细胞的表型和同型分布在急性和随访时间点之间保持稳定(如图所示)。4C，d)。具体来说，RHA+IGD−B细胞对H3和B探针的CD 21含量较高。罗氏CD 27嗨与随访时间相比，急性时点激活记忆(H3：p=0.0007，B：p=0.0017，图基的多重比较检验)，在成为更多的CD 21之前嗨CD 27嗨与急性时点相比，随访时的静息记忆(H3：p=0.0004，B：p <0.0001，图基的多重比较检验)。3C，e(顶板)。相反，在健康的接种队列中，静息记忆表型在基线时最为突出，在IIV后第7~28天变得更活跃的记忆(见图)。3F，顶板)。流感+患者IgG亚型分布的富集–IGM−细胞(主要为IgA)+)用于H3和IgA+B型探针在急性时点的细胞，在成为主要的IgG之前+每个探针的后续行动(图1)。3C，e(底部面板)。相反，RHA的同型分布+IGD−B细胞在IIV后在健康供者中没有变化(图1)。3F、底部面板)。因此，我们的分析显示，流感病毒感染后与招募的rha疫苗相比有显著差异。+IGD−B细胞具有表型和同型水平。

虽然患者的HA特异性B细胞反应与其急性抗体反应(一般较低)没有正相关，但激活或静息记忆HA特异性B细胞与其急性ASC反应以及静息记忆HA特异性B细胞与急性cTfh反应呈显著正相关(补充图)。4)。综上所述，我们发现在急性流感病毒感染时，在ASC和流感特异性记忆B细胞反应时，cTfh 1细胞明显激活。

流感特异性适应性CD8+和CD4+T细胞在感染后早期反应

我们先前的研究表明，从严重的A/H7N9中快速恢复与早期产生γ的CD8有关。+T细胞反应，而后期恢复涉及体液网络(Abs)和细胞网络(CD8)。+，CD4+、NK)反应12。在这里，流感+患者的PBMC与活的季节性h1n1，h3n2，b/yam和B/vib病毒共同孵育，以检测流感特有的先天(NK，γδ，cd 161)。+TRAV1-2+或MAIT细胞)和适应性(CD4)+和CD8+T细胞)在18h后通过产生干扰素-γ而引起的免疫应答(如图所示)。5A，b，补充图。5A)。流感特异性干扰素γ产生细胞在发病数天后的动力学显示，在病人入院时，所有细胞亚群中产生干扰素的群体数量较少。然而，在感染过程中，在恢复期稳定下来之前，这种情况有所增加(如图所示)。5C)。尽管淋巴细胞减少，但在实验中加入了一定数量的细胞，从而增强了对CD8的适应能力。+和CD4+T细胞产生干扰素-γ反应，作为一种频率，在急性感染期间持续增加，直到发病后15天(如图所示)。5D)。相反，对于先天细胞来说，他们产生干扰素-γ反应的能力并没有改变，进一步表明适应性T细胞在急性感染期间对病毒的反应越来越强，是早期恢复的主要驱动力。

MAIT、NK和CD8的杀伤潜能+流感+患者的T细胞

为了评估流感+患者细胞亚群中的细胞溶解潜能，我们测定了细胞毒性分子：颗粒酶(A，B，K和M)和穿孔素(补充图)。6A)。总体而言，MAIT细胞的总细胞毒性分子表达频率最高，其次是NK细胞和CD8。+T细胞，CD4生成极小+T细胞(图1.5E)。然而，对于MAIT细胞，急性和恢复期流感+患者的水平明显低于健康献血者(补充表中的人口统计数字)。3)，而NK细胞则相反，这可能是脱颗粒动力学上的差异。CD8无差异。+和CD4+T细胞亚群细胞溶解分子的个别表达揭示了细胞亚群和溶细胞分子之间的不同模式(如图所示)。5F)。患者NK细胞颗粒酶(A，B，M)和穿孔素水平明显高于健康供者，而颗粒酶K水平显著低于健康供者，而患者MAIT细胞表达颗粒酶A水平低于健康供者，而患者MAIT细胞表达颗粒酶A水平明显低于健康供者。+T细胞颗粒酶K和穿孔素表达均较低。急性组与随访组之间无显着性差异。此外，与所有细胞亚群(NK细胞：急性和健康)相比，流感+患者急性和随访时多个细胞溶解分子(4+)的共同表达显著降低。p=0.0002，p < 0.0001 for all comparisons, Permutation test) (Fig. 5G)，最有可能反映流感感染期间的脱颗粒活动。

活化记忆型流感特异性CD8的免疫动力学研究+和CD4+T细胞反应

解剖表位特异性CD8+和CD4+在急性IAV感染过程中，我们利用广泛的肽/MHCⅠ类和Ⅱ类四聚体进行了患者特异性四聚体染色，这些四聚体覆盖了最常见的HLA等位基因，在所有种族中的群体覆盖率估计为63-100%(如图所示)。6A，补充表4)。继四聚体相关磁富集(TAME)之后，强健的四聚体+CD8+对所有捐献者进行了T细胞群检测(n=19)以及直接在体内测试的特异性(图1)。6B，c，补充图。6B，c)，即使使用10-20%的细胞数，成功检测到抗原特异性CD8通常也是必需的。+健康供体T细胞35,36,37。在17例患者中，四聚体+CD8+在所有时间点均检测到T细胞群，而2例患者有四聚体。+CD8+T细胞定向于亚显性B7-NP表位，只有在随访时才能检测到。比较，A2-M1-四聚体+CD8+在流感患者中也测量了T细胞(n=4/4检测到)(如图所示)。6d)。除了CD8+T细胞，我们还鉴定了流感特异性的CD4。+5/5 H3N2感染患者的T细胞，HLA-DR*01：01-，DR*04：01或DR*11：01-HA-四聚体(图1)。6E，f)，尽管抗原特异性CD4的数量减少了10倍+T细胞体外培养。DR*15：02-HA四聚体也进行了检测，但2/2患者没有产生特异性细胞。

总体上，四聚体前体频率(其中10种)−3表示每1000个细胞中有1个细胞或1e-3细胞在不同时间点之间是稳定的，在急性和随访之间没有显著差异(如图所示)。6f)。混合四聚体+CD8+流感+患者T细胞前体频率(平均±SD，范围：2.62e-4±6.37e-4，8.07e-7~3.56e-3)和流感患者(7.00e-5±8.11e-5，8.38e-6~2.65e-4)显著高于对照组(79倍)(p < 0.0001, Kruskal–Wallis test) and 21-fold (p=0.0026，Kruskal-Wallis检验)+CD4+T细胞(3.30e-6±3.20e-6，6.19e-7~1.17e-5)(附图)。6d)。混合四聚体频率+CD8+T细胞在流感+和流感患者之间是相似的，并且在前面描述的HLA-A2的范围之内。+H7N9-流感+病人38,39.

虽然四聚体的频率+CD8+流感+患者急性和随访时间点T细胞相似，流感+与流感患者相比，T细胞活化表型明显不同。根据四种活化标记物(CD 38、HLA-DR、PD-1和CD 71)，在急性时点检测到较高水平的活化。6g，补充图。6E)。值得注意的是，在流感+患者中，A2-m1在发病第6-10天时，两种或更多的活化标记物的表达最为明显。+CD8+T细胞，与流感+随访样本中主要表达或非激活的pd-1表型形成鲜明对比(图一)。六小时)，以及父母CD8+T细胞群与后续样品相比，所有四聚体在急性时都有较高的活化水平。+CD8+T细胞特性，尽管数量有限，但以四聚体为单位+CD4+T细胞与亲本CD8比较+和CD4+T细胞群(图1.6I，补充图。7).

同样，CD 27/CD45RA/CD 95表型分析显示，四聚体的激活有显着性差异。+CD8+和CD4+流感+患者T细胞与亲本CD8的比较+和CD4+T细胞群在急性和随访时间点。一般来说，在流感+患者中，四聚体+CD8+T细胞由中央记忆样细胞(TCM，CD 27)组成。+CD45RA–)，在较小程度上是效应器类记忆(TEM，CD 27)。–CD45RA–)表型，而四聚体+CD4+T细胞主要为中医样细胞。(无花果)6J，补充图。6f)。这些比例在时间点上保持稳定，但在中医中与整体CD4相比有显著提高。+和CD8+T细胞群。

总的来说，我们展示了广泛的高度激活，非培养，非体内流感特异性记忆d4。+和CD8+在急性IAV感染过程中检测到T细胞，恢复后仍处于较低活化状态。

流感严重程度与免疫相关

我们还探讨了流感严重程度与患者康复的临床、遗传和免疫关系。我们发现流感严重程度(SOFA评分0-6，临床表现：Ili和/或肺炎)与临床参数(年龄、性别、流感株、发病天数、住院天数、危险因素和接种状况)和遗传宿主因素(IFITM 3 SNP等位基因)之间没有显著的相关性。这可能是因为大多数住院的DISI患者已经在高危人群中，根据其共患病/危险因素(86%流感+，70%流感-)，包括慢性呼吸道疾病(61%流感+，40%流感-)。此外，感染季节性流感病毒的病人病情较轻，住院时间短，不需要机械通气，只有一名病人需要加护病房一天，与较严重的禽流感h7n9感染病人不同。18.

探讨人流感病毒免疫反应的整体范围，包括细胞因子、抗体、aSCs、活化的cTfh1s、产生干扰素的先天(NK、γδT、mait细胞)和适应性(CD4)之间的任何潜在联系。+和CD8+T细胞)免疫细胞，以及重要的临床/遗传参数和SOFA评分作为疾病严重程度的衡量标准，我们用上述所有参数生成热图。两种流感+的急性和恢复期的无监督热图(图1)。7a，b，补充数据2和3)和流感组，以及整个队列(补充数据)2–6)。对于急性时点的流感+，IL-6、MIP-1α、IL-8、MIP-1β、MCP-1等细胞因子水平相对较低的区域与较高水平的功能性IFN-γ产生免疫细胞、ASCs和活化的cTfh1s有关。7A)。如图所示。1F这些细胞因子间呈强正相关。恢复期，较低的细胞因子区与较高的IFN-γ产生免疫细胞有关，而与ASCs或活化的cTfh 1细胞无关，后者在急性感染时达到高峰(图一)。7b)。在急性期和恢复期，细胞因子水平较高，产生干扰素γ的免疫细胞数量较低(急性时较低，cTfh 1细胞活性较低)。然而，这些观察区域并没有被SOFA评分或其他临床/遗传参数明确界定。

基于在此检测到的干扰素-γ产生细胞的功能意义，以及我们先前的h7n9研究。12，我们特别分析了急性(V1)和恢复期(F)的干扰素-γ产生细胞的数量。向上)作为患者疾病严重程度的一个函数，由于整个队列中的沙发评分不相等，导致患者的疾病严重程度偏低(0-1)，对最不严重的患者进行分类。在早期急性时点(V1)，先天产生γ的γδT细胞和MAIT细胞的减少与更严重的SOFA评分(2-6)显著相关(图2-6)。7C)，但不是针对NK细胞，CD4+和CD8+T细胞相反，在恢复期，低适应性的干扰素-γ产生CD4。+和CD8+T细胞反应与更严重程度有关(图1)。7C)。这些结果提示早期流感特异性NK，CD4。+和CD8+T细胞反应在流感患者康复过程中起重要作用，较轻的患者在恢复期有更强的反应，而早期先天γδT和MAIT细胞反应的缺失影响疾病的严重程度。

讨论

我们描述了一个完整的免疫细胞网络，结合临床和遗传特征，从流感感染中恢复，这与其他传染病高度相关。我们报告说，在病人康复之前，可以在外周血中测量对流感病毒的稳健免疫反应的广度。首先，活化的Tfh细胞与ASCs平行出现，在流感+组和流感组发病后第7天至第10天达到高峰，在患者康复之前，这在流感病毒感染期间和之后的血液中没有描述过。其次，住院流感患者白细胞介素-6、白细胞介素-8、mip-1α/β和干扰素-γ炎性细胞因子水平升高，两者呈强正相关，且与CD8特异性低反应有关。+T细胞，CD4+T细胞，NK细胞，MAIT和γδT细胞，ASC和Tfh反应降低。这是涉及先天细胞、适应性细胞和17种细胞因子/趋化因子的最广泛的研究。第三，流感特异性B细胞反应与asc和tfh反应呈正相关，但与疫苗诱导的B细胞反应不同，揭示了不同的表型和同型特征，这将为今后B细胞疫苗的设计提供参考，以促进两者的免疫。+IgA+答复。第四，病人特异性肽/mhc-四聚体染色捕捉到最广泛的表位特异性CD8。+和CD4+迄今为止，在一项研究中，T细胞在急性IAV感染期间使用了广泛的范围(n肽/MHC-Ⅰ类和Ⅱ类四聚体为21)。这些四聚体涵盖了最常见的HLA等位基因，估计在所有种族的人群覆盖率为63-100%，并为未来新出现的流感病毒的T细胞免疫监测提供了必要的工具。最后，较低的流感特异性γδT和mait细胞反应与更严重的患者的沙发评分较高有关，而不是NK细胞和CD4。+和CD8+T细胞，显示早期流感特异性NK，CD4+和CD8+T细胞反应是推动流感患者康复的重要因素。

同样，对于流感+和流感患者出院后30天后随访样本的广泛和早期免疫分析还没有报告。我们的工作扩展了颤抖研究，包括在2013年新西兰冬季季节(8月至10月)，对轻度非住院和严重住院流感感染患者的血液样本进行随访，包括急性期和入学后2周的血样。28。战栗组与DISI相似，27名住院病人主要感染H3N2病毒(83%)，76%有潜在症状。然而，我们的研究与寒战研究不同的是，在出现症状后(DISI：4.5±4.4天(平均±SD)，寒战(10.7±4.8天))，患者住院时间较长(DISI中位数为4天(1-38天)，而颤抖中位数为2天(1-10天)。快速招募和住院时间较长的连续抽样使得在感染的第一周，在确定病人结局的关键时刻，能够很早捕获到整体免疫反应动力学。

细胞因子分析表明，炎症细胞因子IL-6、IL-8、mip-1α、mip-1β和ip-10的诱导剂IFN-γ在调整发病年龄和取样天数后，相互间呈极显著正相关，并支持以往关于其作为流感严重程度生物标志物的集体作用的研究。18,20,21,22,23。这些细胞因子相关性在恢复期恢复后仍然是稳健的，此外还出现了IFN-α、IL-17和IL-10簇。此外，流感病毒感染后IL-6、IL-8、MIP-1α和MIP-1β的低表达与更高的IFN-γ产生免疫细胞以及ASCs和活化的cTfh 1细胞有关，反之亦然。

由于遗传宿主因素，如特定的HLA类型和IFITM 3 SNPs与流感的严重程度有关。15,16,17,18,19我们比较了流感+和流感患者的遗传因素。然而，考虑到我们的人群主要是澳大利亚白人(82%流感+，95%流感-)，基于对HLA-A*02：01/03：01和HLA-B*08：01/18：01/27：05/57：01分子结合的研究，我们发现“普遍”或“危险”等位基因的数量没有差异。40抗HLA-A*24：02/68：01型与pH1N1死亡率正相关15和发病率16。同样，在IFITM 3 SNP分析中，91%的流感+患者(其余为C/T杂合子)和100%的流感患者无危险rs12252-T/T纯合等位基因，而C/C纯合子等位基因不存在。Rs34481144SNP的A/G杂合等位基因频率较高(分别为41%和50%)，风险A/A和非危险G/G纯合等位基因所占比例相等或相似。进一步分析A/A+Rs34481144 SNP与流感+A/G杂合子等位基因及非危险G/G纯合等位基因患者的疾病严重程度无显着性差异(补充图G)。8).

在抗体反应方面，急性感染时流感+患者的HAI抗体滴度低于流感患者和健康对照组，但随着对同一亚型的感染株和以前菌株的恢复，HAI抗体滴度明显增加。目前尚不清楚寒战研究是否比较了轻度非住院和重症住院患者的急性和恢复期的抗体反应，尽管他们在急性和恢复期比较轻、重度组的抗体反应时并没有观察到任何差异。28。鉴于我们观察到感染后交叉反应性抗体反应在后续时间出现反向增强，我们假设与疫苗诱导的反应相比，自然流感病毒感染引起的病毒清除后更有效的交叉反应性抗体反应值得进一步研究。

在一项测量流感特异性B和T细胞反应的研究中，对健康人群进行季节性IIV治疗。4疫苗诱导的抗体反应与ASCs、流感特异性记忆B细胞和活化的cTfh细胞亚群的增加呈正相关。同样，在急性流感疾病中，我们发现cTfh 1细胞明显活化，这与ASC反应和记忆性流感特异性B细胞有关。相反，cTfh 1的数量与抗体滴度在急性、随访或折叠变化时不相关。只有ASC数与更高的40及以上的急性抗体滴度呈正相关，同样支持40的阻断效价作为一种保护措施。CXCR 5的一个非常小的子集+Pd-1高血液中的ctfh细胞与cxcr 5相对应。+Pd-1高Tfh细胞的转录和TCR序列分析41,42。我们分析了CXCR 5+Pd-1高CD4总表达+T细胞在一小部分流感+患者，也发现在血液中很低的水平，在急性和随访时间点(0-0.2%，补充图。9)。这与在淋巴结中发现的更为突出的人群形成了鲜明的对比。41扁桃体42。在登革热感染过程中，cTfh细胞作为生发中心Tfh细胞的替代物的作用已经被描述过。43最近一群人在新冠肺炎上44。然而，据我们所知，以前还没有关于人类cTfh细胞在自然流感病毒感染后的报道。

有趣的是，对记忆性流感特异性B细胞反应的表型分析显示了感染和接种引起的对比。在急性感染期间，流感特异性B细胞是由IgG和IgA亚型组成的激活记忆表型，但主要是静息记忆型IgG。+疗养人口。相反，IIV诱导活化记忆型流感特异性B细胞的增殖，但以IgG为主的亚型分布无明显变化。+B细胞，考虑到流感疫苗没有传递到粘膜部位。IGA+在流感病毒感染过程中，记忆B细胞能够定位于血液和粘膜炎症部位，如呼吸道，从而提供快速的免疫反应，而IgG则能提供快速的免疫反应。+记忆B细胞一般在全身循环45。因此，根据我们先前的抗体发现，我们建议未来基于B细胞的流感疫苗促进交叉反应的B细胞反应，包括两种激活记忆IgA。+和IgG+亚类可在感染地点提供进一步保护。

本研究采用全活病毒法检测NK细胞、γδT细胞和CD 161细胞中流感特异性应答的动力学。+TRAV1-2+MAIT细胞(先天样细胞)和CD8细胞+和CD4+T细胞(适应性)。我们观察到了适应性CD8的稳健性和不断增加的比例。+和CD4+T细胞反应在感染的前2周内，尽管病人的整体淋巴减少状态，说明这些细胞类型的能力驱动病人的恢复。与之相反，先天淋巴细胞对流感病毒感染的反应能力没有通过细胞因子的产生而增加，根据早期V1时间点的SOFA评分，低IFN-γ产生的γδT细胞和MAIT细胞与更高的疾病严重程度显著相关。类似地，一项H7N9研究显示了自适应CD8的鲁棒性。+和CD4+重型H7N9病恢复期T细胞免疫反应的研究12。这些发现对未来的流感疫苗有着重要的意义，因为除了CD4之外，+T细胞辅助室IIV不能诱导CD8+T细胞反应或来自NK细胞、γδT细胞和MAIT细胞的任何先天反应。4.

我们使用一系列肽/MHC I类和II类四聚体，包括最常见的HLA等位基因，对流感特异性T细胞进行了体外研究，估计在所有种族人群中的复盖率为63%至100%。四聚体+CD8+和CD4+与随访时相比，T细胞在急性时点高度活化，主要表达PD-1与CD 38、CD 71和HLA-DR的结合。与严重的H7N9流感形成对比13、埃博拉46新冠肺炎病44，与突出的CD 38+赫拉博士+在CD8/CD4细胞总数中，我们没有观察到有标记的CD 38群体。+赫拉博士+四聚体中的T细胞+或者父母群体，在我们的DISI研究中，可能反映了一组不那么严重的疾病患者。尽管如此，我们仍然提供罕见的HA的急性和恢复期人群。306-318-特异性CD4+H3n2感染者HLA-DR*01：01的T细胞+ (n3)，HLA-DR*04：01+ (n或HLA-DR*11：01+ (n(1)，这是对HLA-DR*04：01中评估细胞的其他研究的补充。+流感疫苗接种后健康供者及类风湿关节炎患者47,48。虽然我们可能忽略了对较罕见的表位和HLA呈现分子的强烈反应，但我们的结果代表了最广泛的流感特异性四聚体。+T细胞在急性流感感染期间的反应，为将来对新出现的流感病毒进行T细胞免疫监测提供了必要的工具。

有趣的是，流感特异性T细胞很少超过CD8总数的1%。+与恢复期相比，急性感染时血T细胞无明显增加。这与血液和淋巴感染(如EBV和HIV-1)形成鲜明对比，后者的血液水平可能很高(单一特异性>10%)。这是诱人的推测，也许他们可能是迁移到呼吸道在急性流感感染，虽然我们没有从流感+患者的BAL样本来验证这一假设。然而，用流感Ⅰ类四聚体(HLA-A2-m1)标记的已故器官供者的肺细胞。58和HLA-B57-NP199)表现出高达8%流感特异性CD8的高频率。+内存中的T细胞CD45RO+CD8+T细胞群49。我们推测，在急性感染期间，肺内的这些细胞可能会扩展到更多的数量。作为支持，一项rsv感染研究显示rsv特异性CD8的频率更高。+感染后第10天和第28天BAL中T细胞与血液中T细胞的比较50。血RSV特异性CD8+T细胞在第10天达到高峰(<CD8的0.5%)+T细胞)，然后在第28天收缩，而bal RSV特异性CD8。+恢复期T细胞从第10天(~1-2%)增加到第28天(~10%)。

这项研究有局限性。DISI队列包括流感+患者，他们的病情足以住院，因此代表了严重流感病例的倾斜人群。这些患者中的大多数也已经处于高风险状态，86%的患者有并存的疾病.因此，我们的一些研究结果可能不适用于患有轻微流感症状、无并发症或非常年轻健康的人群。我们承认，我们的DISI研究包括了一小群人(n=65：n=45流感+和n我们进行了一项综合研究，包括住院期间的纵向取样和出院后30天的随访。虽然我们不能轻易区分病因和效果，但有关流感疾病严重程度的免疫机制的不同假设仍然存在。然而，我们的DISI研究提供了一个有价值和重要的工作，为理解严重流感疾病期间的免疫反应提供了关键的见解。

追踪抗体、B和T细胞反应(以及其他免疫介质)可以预测患者的严重程度或需要住院治疗的流感病毒感染的恢复。我们目前在临床医院框架内对免疫学和病毒学参数的分析提供了一个独特而关键的数据集，说明了流感严重程度和易感性的机制。此外，这些努力代表了一个实质性的进展，以阐明宿主免疫反应的基础，从这种急性疾病，以及其他传染病，如新冠肺炎。44.

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文章分类：生物摘要

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