炎症关节增强的核心Treg细胞信号
探讨人Treg细胞在炎症环境中的基因表达谱是否与循环中的人Treg细胞CD3不同。+CD4+CD 25+CD 127低层Treg细胞和CD3+CD4+CD 25−CD 127+非Treg细胞分离自：幼年特发性关节炎(JIA)患者关节炎患者滑膜渗出液，JIA活动期和非活动性疾病患者外周血(PB)，健康儿童和健康成人PB(补充图)。1A选通策略)。90%以上的分类Treg细胞群体为FOXP 3阳性(补充图)。1B)。RNA测序法测定转录水平。采用非监督主成分分析法(PCA)研究了不同环境下Treg细胞间的差异。SF来源的Treg细胞明显地与PB来源的Treg细胞聚集在一起(如图所示)。1A)，表明与PB衍生Treg细胞相比，SF衍生Treg细胞具有特定的表达模式.
图1：人发炎细胞和外周Treg细胞的明显特征。a。无监督主成分分析(PCA)的所有Treg细胞组，滑液(SF)和外周血(PB)，从儿童。bCD4抑制(百分比)的定量研究+T细胞来自健康供者或幼年特发性关节炎(JIA)患者PB和JIA患者SF的Treg细胞。用50,000 ctViet标记的同种异体健康供体PBMC，用不同比例的Treg细胞在抗CD3包被板中培养4天。n=4，平均±SEM)。c人核心Treg细胞标志基因的基因集富集分析(由Ferraro等人鉴定)。31)对SF Treg细胞与非Treg细胞、SF Treg细胞和健康儿童PB Treg细胞进行配对比较，以归一化富集评分(NES)和FDR统计值(FDRq)为代表。dRPKM的mRNA表达(Log2RPKM)Foxp 3, CTLA 4和TIGIT健康成人(成人)从PB衍生出来的Treg细胞中，n=4)，健康儿童(儿童，n3)，JIA患者活动期(Ajia，n=3)或不活动(iajia，n=4)JIA患者的疾病，SF(JIA SF，n=4)和非Treg细胞(n健康成人的PB和JIA患者的SF(显示中位数+IQR，de=按log 2倍变化差异表达，≥0.6，经调整(Adj))p-数值≤0.05，所有归一化计数的平均值>10；p-价值观Foxp 3=1.1E−95，CTLA 4=2.3E−05，TIGIT=1.9E−17)eCD3中FOXP 3、CTLA 4和TIGIT的中位荧光强度(MFI)+CD4+CD 25+CD 127低层Treg细胞和CD3+CD4+CD 25−CD 127+非-5例JIA患者成对SFMC和PBMC的Treg细胞。采用双向方差分析和SIDAK校正进行统计学比较.b, e数据是两个独立实验的代表。源数据作为源数据文件提供，并保存在GSE 161426下。
根据以前的文献，我们通过体外抑制实验证实了SF衍生的Treg细胞具有功能(如图所示)。1B和补充图。2A)16,17。正如所料，与sfd4相比，sftreg细胞中Treg细胞标志基因显著富集。+非Treg细胞(图.1C，左面板)。与来自健康儿童和JIA患者的PBTreg细胞相比，Treg细胞标志基因在SF中也得到了丰富。1C、右面板和附图。2B)。这些基因包括对Treg细胞稳定性和功能非常重要的Treg细胞标记基因，例如Foxp 3, CTLA 4，和TIGIT，无论是转录水平还是蛋白质水平。1D，e和附图。1A和2C)18,19。在人类中，CD3+CD4+非Treg细胞可上调FOXP 3及相关标记物，这些标记可作为T细胞活化的标记物。3。我们确实观察到SF非Treg细胞FOXP 3、CTLA 4和TIGIT在mRNA和蛋白水平上略有上调，但未接近SF Treg细胞的水平(见图)。1D，e和附图。1B和2C)，进一步证实SF Treg细胞和非Treg细胞是不同的细胞群.这些数据表明炎症环境强化了Treg细胞相关程序.
发炎诱导的Treg细胞有一个特定的效应物轮廓。
对健康儿童的sf细胞和pb来源的Treg细胞进行配对比较，发现了许多差异表达的基因，包括核心Treg细胞标记，包括Foxp 3和CTLA 4，同时也能反映出分化程度更高的Treg细胞，如PRDM 1(编码Blimp-1)，ICOS、BATF，和巴奇2(无花果)2A，补充数据1)。摘要根据最近的文献，我们分析了与eTreg细胞分化相关的标记在小鼠体内的表达。3,13,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34。分层聚类分析证实Treg细胞与非Treg细胞是分开聚类的，并揭示了核心Treg细胞基因在所有Treg细胞组中的表达增加，包括CTLA 4, Foxp 3, IL2RA(编码CD 25)，TIGIT，和IKZF 2(编码Helios)(如图所示。2B，方框1)。此外，聚类还揭示了Treg细胞群中存在分子异质性的基因。一些标记几乎完全由SF Treg细胞表达(包括GMZB, ICOS，和IL 10而另一些细胞则由sf Treg细胞高表达，而sf非Treg细胞(包括PRDM 1, BATF, TNFRSF 18编码GITR，TNFRSF1B和HAVCR 2编码Tim-3)(如图所示。2B，方框2)。第三个簇涉及在非Treg细胞中高表达的基因(如图所示)。2B，方框3)。该簇中的一些基因与SF Treg细胞共享表达，如LAG 3, CXCR 3，和PDCD 1(编码pd-1)CD40LG, 巴奇2, SATB 1, CCR 7，和Tcf7在SF Treg细胞中明显降低(图1)。2B，方框2和3)。有趣的是，方框2和3中列出的更多异质表达的基因以前与eTreg细胞图谱相关，包括ICOS, IL 10, PRDM 1, TNRFSF 18，和PDCD 13,27,30,31,33。ICOS、GITR和Pd-1在蛋白水平的表达增强(图一)。2C和补充图。3A)。除了这些标记的差异表达外，我们还发现最近在小鼠中描述的SF Treg细胞内基因的显著富集在eTreg细胞中被上调或下调。35(无花果)二维空间和补充图。3B)，确认eTreg细胞配置文件。这些数据表明，自身免疫炎症衍生的人Treg细胞具有eTreg细胞的特征.
图2：炎症衍生的Treg细胞有一个特定的效应物。a滑液(SF)差异表达基因的Ma图n=4)和外周血(PB)，n=3)健康儿童的Treg细胞，黑点反映无变化，红色点转录本经调整p-数值<0.05(用Benjamin amini和Hochberg方法校正多次检验)，所有标准化计数的最小平均值>10，对数2倍变化>0.6。b热图的层次聚类分析，包括所有组测量的RNA测序选择的基因根据最近的文献(相对表达的log2RPKM)。c门控CD3中ICOS、GITR和PD-1的中位荧光强度(MFI)+CD4+CD 25+CD 127低层Treg细胞和CD3+CD4+CD 25−CD 127+5例JIA患者成对SFMC和PBMC的非Treg细胞。采用双向方差分析和SIDAK校正进行统计学比较.数据代表两个或两个以上的独立实验。d小鼠效应细胞基因集富集分析(Dias等人鉴定)53)在涉及SF Treg细胞的配对比较中(n=4)和PBTreg细胞(n=3)健康儿童，以标准化富集评分(NES)和FDR统计值(FDRq，样本置换多假设检验)为代表。源数据作为源数据文件提供，并保存在GSE 161426下。
SFTreg细胞适应干扰素介导的炎症环境
为探讨炎症环境源性细胞与PB源性细胞之间的关系，我们对健康儿童的SF、非Treg细胞和PB Treg细胞进行了非监督PCA分析。PBTreg细胞与SF衍生细胞明显分离，证实环境在决定转录景观中起主导作用(图1)。3A)。K均值聚类分析表明，SF Treg细胞和非Treg细胞与炎症相关通路相关基因的表达增加，包括与细胞因子反应相关的途径，如Interferon和IL-12(补充图1)。4A)。从儿童中提取的SF Treg细胞和所有PB Treg细胞的K-均值和随后的基因本体论分析表明，与Th1-倾斜相关的通路在SF Treg细胞中被特异性地上调(图1)。3B和补充图。4B，c)。事实上，Th1关键转录因子的表达Tbx 21(t-bet)，Th1相关的趋化因子受体CXCR 3，以及IL-12受体β2(IL12RB2在SF中，Treg细胞在mRNA和蛋白水平上均有增加(如图所示)。3C，d和补充图。4D)。表达Tbx 21和CXCR 3SF Treg细胞和非Treg细胞同样高，而IL12RB2在SF Treg细胞中有明显的高表达(经调整)p-价值=6.8E−10)。因此，与非Treg细胞相比，SF Treg细胞显示了T-bet和FOXP 3蛋白的共同表达，排除了对非Treg细胞的显著污染，这可能是SF Treg细胞中观察到的高T-bet水平的原因(见图)。3E)。这些结果表明，SF Treg细胞表现出功能特异性，可以在特定的组织部位调节特定的Th细胞反应，就像以前在小鼠身上所建立的那样。36,37,38。在此，我们发现了TIGIT转录信号在SF Treg细胞中的富集。+已鉴定为活化的Treg细胞选择性抑制小鼠Th1和Th17细胞19(补充图。4E)。SF中存在的记忆Treg细胞的频率高于PB，这并不能解释观察到的差异(补充图)。二维空间以及e、3c和4f)。
图3：SFTreg细胞适应干扰素偏斜的炎症环境.a滑膜液(SF)衍生Treg细胞和非Treg细胞(配对)的无监督主成分分析(PCA)n=4)和外周血(PB)来源的Treg细胞(n(3)健康儿童。b与SF中特异上调的1791个基因相关的基因本体论术语(n=4)与来自儿童的PBTreg细胞(活动性青少年特发性关节炎(JIA)，(n)，不活动的JIA(n=4)，以及健康的儿童(n)，按富集分数排列。基因本体术语中标注的基因数目与基因本体术语中注释的基因总数相比，被描述在术语之前。cRPKM的mRNA表达(Log2RPKM)Tbx 21, CXCR 3，和IL12RB2健康成人(成人)从PB衍生出来的Treg细胞中，n=4)，健康儿童(儿童，n3)，JIA患者活动期(Ajia，n=3)或不活动(iajia，n=4)JIA患者的疾病，SF(JIA SF，n健康成人PB中的非Treg细胞(4)和非Treg细胞(n=4)和JIA患者的SF(n=4)(所示为中位数+IQR，de=根据图中的描述差分表示。1D)。[医]p-价值Tbx 21=0.91，CXCR 3=0.44，IL12RB2=6.83E−10。dCD3中T-bet、CXCR 3和IL12Rβ2的中位荧光强度+CD4+CD 25+CD 127低层Treg细胞和CD3+CD4+CD 25−CD 127+5例JIA患者成对SFMC和PBMC的非Treg细胞。e两个独立实验的代表等值线图，T-bet和FOXP 3在CD3中+CD4+CD 25+Foxp 3+Treg细胞和CD3+CD4+CD 25INT/−Foxp 3−来自SFMC的非Treg细胞。fCD3中干扰素γ和IL-2阳性细胞百分比的测定+CD4+CD 25+Foxp 3+Treg细胞和CD3+CD4+CD 25INT/−Foxp 3−来自sfmc和pbc的非Treg细胞(IFNγ：n=11 PB，n=12 SF；IL-2：n=6 PB，n=7 SF，平均±SEM，p-价值：IFN-γPBp>0.9999，干扰素γSFp < 0.0001, IL-2 PB p=0.0051，IL-2 SFp < 0.0001). d, f数据是两个独立实验的代表。采用双向方差分析和SIDAK校正进行统计学比较.源数据作为源数据文件提供，并保存在GSE 161426下。
Th1相关蛋白的高表达引发了SF Treg细胞是否已获得Th1表型的问题。然而，SF Treg细胞不能同时产生IL-2和IFNγ(如图所示)。3F和补充图。4G)并随pSTAT 5水平的升高而剂量依赖于IL-2(补充图)。4H)，一种对Treg细胞存活和功能起关键作用的信号通路39。事实上，与PBTreg细胞相比，SFTreg细胞对IL-2的反应更强。总之，我们的发现显示SF Treg细胞适应其炎症环境，同时保持Treg细胞的关键特征。
超增强剂对效应细胞的调节作用
为了探讨炎症适应的eTreg细胞的机制，我们分析了SFTreg细胞的增强子景观。增强子是DNA中允许转录因子结合并协调基因表达的远端调控元件。摘要增强子的表观遗传调控对特定环境下的基因调控至关重要。40。增强子可以定义为组蛋白H3上赖氨酸4单甲基化(H3K4me1富集)和组蛋白H3上赖氨酸27乙酰化(H3K27ac富集)区域，其中H3K27ac识别活性增强子。41。用SF Treg细胞和健康成人PB Treg细胞分别对H3K27ac和H3K4me1细胞进行芯片-seq检测，结果表明，SF和PBTreg细胞分别对H3K27ac和H3K4me1的增强子谱和活性存在差异，分别为37307和970个不同峰(见图1)。4A，补充图。5B、上面板和补充数据2)。接下来，我们评估SFTreg细胞的转录组是否反映在表观遗传学水平上。H3K27ac和/或H3K4me1基因在mRNA水平上增加，反之亦然。4A，补充图。5B、中、最低面板和补充数据2)，证实在这些细胞中基因表达与染色质乙酰化和单甲基化是相互关联的。
图4：环境特异性效应因子Treg细胞轮廓由(超级)增强剂景观调节.aH3K27ac芯片-seq滑膜液(SF)与外周血(PB)Treg细胞差异表达增强子(fdr<0.0001)的Ma图显示SF和PB特异性增强子的数量(顶)。以标准化富集评分(NES)和FDR统计值(FDRq)为代表的SF Treg细胞和健康成人PB Treg细胞转录组数据的配对比较中，前250位上调(中间)和下调(底部)增强子的基因集富集分析(GSEA)。b同.a超增强剂(FDR<0.05)。cH3k27ac和h3k4me1芯片seq在sf Treg细胞和健康成人pb Treg细胞中选择上调和下调的超促进剂(fdr<0.0 5；两者的BOLD=上下和转录水平上的差异表达(DE)，另见补充数据2). d利用荷马预测的转录因子结合位点的基序，在SF Treg细胞中的上调(超)增强子中富集。n=3)与健康成人PBTreg细胞(n=3)用于H3K27ac和H3K4me1芯片-seq。p-数值：累积二项分布，以计算目标序列与背景序列的富集；BATFH3K27ac已知p=1e−15，de novop=1e−22,和VDRH3K4me1p=1e−19。e基因轨迹VDR和BATF(H3K27ac)显示芯片-seq信号，在健康成人PB Treg细胞、SF Treg细胞、VDR特异性(GSE 89431)和BATF特异性(GSE 32465)芯片-seq中，超增强子区域突出显示。Rna-seq信号VDR和BATF在儿童PBTreg细胞和SFTreg细胞也显示。成人铅的有代表性样本(n=3)，儿童PB(n=3)和SF(n=3表示芯片-seq和n4为RNA-seq)Treg细胞。对于所有面板，除另有说明外，FDR值均采用Benjamin amini Hochberg方法计算。源数据保存在GSE 161426和GSE 156426下。
超级促进剂是一大群增强子，专门调节在健康和疾病中决定细胞身份的基因。42,43。用ROSE算法确定超增强子相关基因是离增强子和超增强子位点中心最近的TSS。此外，在超增强子水平上，我们发现转录的基因明显富集，再次表明SFTreg细胞图谱是由表观遗传改变介导的。4B和补充图。5C，中间面板和最低面板)。对H3K27ac和H3K4me1差异超增强子相关基因的分析显示，在791和317个不同的基因位点中，分别有337个和317个(图1)。4B和补充图。5C、上面板)。具体来说，我们发现超增强子与与典型的Th1分化相关的基因相关，例如Tbx 21和IL12RB2，在SF Treg细胞中增加。4C)环境相关轮廓的表观遗传调控。核心Treg细胞基因编码效应分子ICOS, IL 10，CTLA 4, TNFRSF 18，和PDCD 1与超增强剂以及呋喃和ID2这些都是功能较强的Treg细胞标记物。ETreg细胞的分化也反映在sftreg细胞的增强子结构中，超增强子相关转录调节因子的差异表达包括BATF, 巴奇2, SATB 1，TRAF 3，和SOCS 1。此外，我们还发现了与先前与(E)Treg细胞分化无关的标记物相关的超级增强子，这些标记物大多对人Treg细胞具有特异性，包括VDR(编码维生素D受体)，RXRA(编码维甲酸受体RXR-α)，KAT2B(编码p 300/cbp相关因子(PCAF))，TOX 2(编码TOX高迁移组盒家族成员2)和IL12RB23,4,6,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53。炎症相关归巢标记(CCR 2, CCR 5, CCR 7)与SF Treg细胞中H3K27ac的差异水平有关。最后，与pb Treg细胞相比，sf的超增强因子也反映了细胞周期和凋亡的调节。DPH 5, MICAL 2，PHLDA 1，和CCND 2。总之，这些超增强子相关基因反映了Treg细胞在炎症环境中的适应和专业化.
序列分析表明，与PBTreg细胞相比，在SF中特异性上调的(超级)促进剂转录因子结合位点的预测，揭示了Treg细胞特异性转录因子的基序。其中包括STAT 5和Myb；后者最近被描述为eTreg细胞分化中的核心转录因子。53。最近的文章进一步证明batf和rela是小鼠eTreg细胞的关键调节因子。47,49。在此支持下，我们发现BATF，TF 65(编码rela)和VDR基序在SF Treg细胞(如图所示)增强子区域中明显富集。4D和补充图。5D)，从而进一步加强SFTreg细胞的eTreg细胞轮廓。最常见的基序属于激活蛋白1(AP-1)转录因子亚家族，是碱性亮氨酸拉链(BZIP)家族的一部分(补充图)。5D)如DiSpirito等人所提出的，表明这个亚家族在驱动eTreg细胞签名方面至关重要。54全组织Treg细胞。此外，在转录调节剂vdr和batf的超级增强子中，发现了它们各自的结合位点，表明batf(与其他蛋白质复杂)和vdr调节着自己的基因表达，也控制了其他eTreg细胞基因(图1)。4E)。这些观察表明，在转录水平上观察到的SF Treg细胞的炎症适应效应表型反映在表观遗传学水平上，具有超增强子特征和eTreg细胞基因结合位点的富集，在慢性炎症组织中显示出与其他Treg细胞共同的特征。
维生素D 3受体对eTreg细胞分化的调节作用
为了提取基于人类转录因子和辅助因子的关键基因调控因子，从健康的PB细胞分化为SFTreg细胞，采用数据驱动的网络和富集方法(RegEnrich)。建立了一个由调控者及其目标组成的网络(如图所示)。5A)在预测值最高的情况下，人们发现从PB向SFTreg细胞分化的调控因子是Tcf7, LEF 1, 君, 斯潘(否定)和ENO 1, THRAP 3，和VDR(正)(见图)。5A、b)。斯潘, THRAP 3，和VDR以前没有与eTreg细胞分化相关。VDR与核心Treg细胞基因相关的下游基因包括Foxp 3和STAT 3，但也Tbx 21(无花果)5A，c和补充数据3)。因此，FOXP 3和FOXP 3之间存在着很强的正相关关系(r=0.772，p < 0.0001) and T-bet (r=0.937，p < 0.0001) with VDR protein expression (Fig. 5D)加强预测的调整器网络。
图5：维生素D受体是效应细胞分化的预期调节因子。a基于非监督加权相关网络分析，在RNA水平上驱动外周血(PB)向滑膜液(SF)Treg细胞分化的关键调节因子(Pb)的网络推理，然后对转录因子和辅助因子(红色=上调，绿色=下调)进行Fisher‘s精确检验。紫色线描绘了监管机构与目标之间的联系。圆圈大小表示−log 10(p)对于每个比较，使用p(-值)来自差异表达式分析(log折叠变化>1)，文本大小表示RegEnrich分数；对于这两种情况，更大的表示更高的分数(另见补充数据)3). bRNA表达谱VDR从JIA sf Treg细胞样本1-4到成人pb Treg细胞样本1-4，其相关基因以灰色表示。Z-得分c所有与VDR相关的基因都由密钥调节器网络推理定义。dPB(圆)和SF(三角形)VDR与FOXP 3(左)和T-bet(右)中位荧光强度(MFI‘s)的Pearson相关图，用线性回归法拟合。n=12 PB HC和PB JIA(PBMC)，n=8 SF JIA(SFMC)。e相对e挤压褶皱变化(2)ΔΔCT)IL2RA, CTLA 4, TNFRSF 8, IL 10, Tbx 21, IRF 4，和VDR(左下角)培养50,000激活CD3的Treg细胞+CD4+CD 25+CD 127低层用10 NM维生素D从HCPB中分离Treg细胞，与不含维生素D 2天比较(n=4，平均±SEM)。f实验后CD 25(IL2RA)、CTLA 4和TNFRSF 8相对MFI的变化e用(n=7，平均数±扫描电镜(SEM)。d–f数据是两个独立实验的代表。源数据作为源数据文件提供。
探讨维生素D的直接作用3在推动Treg细胞向效应型方向发展的过程中，我们用维生素D孵育了CD3/CD 28刺激的PBTreg细胞。3(Calcitriol/1，25-二羟基玻璃体D3)，检测(E)Treg细胞功能相关基因的表达。与维生素D孵育3(10 NM；生理维生素D)3)，表达增加IL2RA, CTLA 4, TNFRSF 8(CD 30)，以及IL 10，以及eTreg细胞转录因子。Tbx 21和IRF 4被观察到(如图所示)。5E)。蛋白质水平上，维生素D还显著增加了CD 25、CTLA 4和TNFRSF 8。3孵化(图1.5F)。此外，与表观遗传数据一致的是维生素D3刺激诱发正反馈环VDR表达式(图1.5E)。这些发现支持了维生素D的假设3VDR信号转导促进eTreg细胞分化，同时与核心Treg细胞标记表达呈正相关。
类似的eTreg细胞在其他炎症和肿瘤环境中的分布
为了研究SFTreg细胞中所识别的程序是否对接触炎症的人Treg细胞更为普遍，我们将我们的结果与来自PB的Treg细胞和类风湿关节炎(RA)患者的炎症关节进行了比较。事实上，在RA患者炎症渗出液的Treg细胞中，类似的eTreg细胞基因也被上调(如图所示)。6A).
图6：效应细胞与人肿瘤Treg细胞信号重叠。a基于非监督层次聚类分析的外周血热图(PB)n=5)和(部分配对)滑液n=7)类风湿关节炎患者的Treg细胞用基因芯片进行检测，所选择的标记基因来源于幼年特发性关节炎(JIA)的SF Treg细胞和肿瘤浸润的Treg细胞。b肿瘤浸润Treg细胞标志基因的基因集富集分析(De Simone等人鉴定)。13)在涉及SF Treg细胞的配对比较中(n=4)和健康儿童PBTreg细胞(n=3)，以归一化富集评分(NES)和FDR统计值(FDRq，用样本置换进行多假设检验)表示。c热图采用层次聚类分析，包括对已鉴定的肿瘤浸润Treg细胞标记基因进行RNA序列测定(参考文献)。13)，具有log2RPKM的相对表达。右边的小热图显示SF Treg细胞中所选基因的log2RPKM值。dRPKM的mRNA表达(Log2RPKM)CCR 8, MAGEH 1和莱恩健康成人(成人)来自PB的Treg细胞n=4)，健康儿童(儿童，n3)，JIA患者活动期(Ajia，n=3)或不活动(iajia，n=4)JIA患者的疾病，SF(JIA SF，n健康成人PB中的非Treg细胞(4)和非Treg细胞(n=4)和JIA患者的SF(n=4)由RNA-测序分析(显示中位数+IQR，de=差异表示，根据图中的描述)。1D调整p-数值(Benjamin amini和Hochberg方法)CCR 8=2.2E−13，MAGEH 1=1.2E−07，莱恩=1.2E−33)。e根据JIA SF Treg细胞、RA SF Treg细胞和肿瘤浸润Treg细胞中上调的重叠基因鉴定人效应Treg细胞谱(见参考文献。13,14,15,89,90)，并对SFTreg细胞的(超)增强子景观进行了反思。源数据作为源数据文件提供，并保存在GSE 161426下。
然后，我们将我们的数据与最近发表的人类肿瘤浸润Treg细胞特异性信号进行了比较。13,14,15。引人注目的是，来自de Simone等人的肿瘤浸润Treg细胞信号。在SFTreg细胞中富集(标准化富集评分(NES)1.27，FDR统计值(FDRq)0.071)。6B)。反之，与正常组织Treg细胞相比，SFTreg细胞与PB Treg细胞的差异表达基因在肿瘤浸润中富集(Plitas等人，2016年：NES 1.69，FDRq 0.017，Magnuson等人，2018年：NES 1.88，FDRq 0.002；附图)。6a，b)。DeSimone等人肿瘤浸润基因信号的层次聚类分析。进一步揭示了SFTreg细胞的单独聚集现象(图1)。6C)，表明标记基因的高表达是人类Treg细胞在一个以免疫细胞浸润为特征的部位所特有的。我们还观察到一小部分基因在SFTreg细胞中没有被上调。CX3CR1, IL17REL, IL1RL1，和IL1RL2，暗示环境-受限制的适应(图1.6C)。这三个基因被描述为肿瘤浸润的Treg细胞中最丰富和最独特的基因，莱恩, MAGEH 1，和CCR 8，在SF Treg细胞中有选择性和高度上调。6d)。这些数据表明，我们观察到的Treg细胞图谱并不局限于JIA和RA患者的SF渗出液。事实上，它很可能代表了人类Treg细胞在炎症环境中的一个更全面的轮廓，可能是通过特定环境的适应来微调的。
为了探讨哪些提示可能是SF的特异性，我们探讨了SF中上调基因与肿瘤浸润Treg细胞之间的差异。相对较少发现明显的SF特异性基因。在基因水平上，细胞毒性标记包括GZMM, GZMA，和GNLY，与效应细胞溶解和自身诱导的Treg细胞凋亡有关。55是SF-特异性的(补充图)。6C)。基因本体论生物学过程分析进一步揭示了SF中活性细胞周期和凋亡途径均被上调，而在肿瘤微环境中，细胞激活和效应反应显著(附图)。6d)。此外，肿瘤浸润的Treg细胞表现出明显的趋化因子和趋化因子受体的表达，如IL-8(CXCL 8)、CX3CR1、CXCR 7和CCR 10(补充图10)。6C)，其中一些已被认为是癌症预后的指标和/或治疗的靶点。56.
从JIA、RA和肿瘤数据集中，我们可以推断出一组在eTreg细胞中普遍上调的基因，也可以反映在SFTreg细胞的(超级)增强因子中(如图所示)。6E). ICOS, BATF，MAF, TNFRSF 18，和SRGN也显示为与小鼠eTreg细胞相关的核心标记。此外,IL12RB2，VDR，和KAT2B，被确定为核心基因，以及PFKFB 3和LDHA参与糖酵解及凋亡相关基因的研究MICAL 2和TOX 2。后两者迄今尚未与人或小鼠的Treg细胞相关联，尽管两者都与人类癌症有着独立的联系。57,58。事实上，基因集富集和对活化、(共享)组织、炎症和肿瘤浸润的Treg细胞基因集的前沿分析等揭示了核心eTreg细胞基因的共享，包括BATF, CCND 2, CCR 8, TNFRSF 18，和VDR，(补充数据)4)。即使SFTreg细胞被高度激活，也不存在耗尽或exTreg细胞相关基因的富集。综上所述，我们的结果表明，人类Treg细胞在不同的炎症环境中有着共同的效应，并且强烈地表明炎症在不同的环境中以类似的方式驱动eTreg细胞的分化。
