表达VEGFA-经典和MSX 2非经典单核细胞mRNA在脊椎炎患者中的表达与周围性关节炎有关

脊椎关节炎(SpA)的特点是慢性炎症和结构损伤，涉及脊柱和周围关节。单核细胞作为天然免疫系统的一部分，迁移到受影响的组织中，可能在SpA的发病机制中起一定作用。在此，研究了骨形成相关基因表达谱(特别是单核细胞亚群)与SpA临床症状之间的潜在联系。20例轴位患者和16例外周SpA患者参加了研究。单核细胞亚群(经典-CD 14)++CD 16−，中间-CD 14++CD 16+和非经典CD 14+CD 16++)用流式细胞仪从血液中分离，用实时PCR法和TaqMan阵列、人成骨、快速96孔板进行基因表达分析。其次，结合三个单核细胞亚群中所选基因的表达情况，分析了轴向和外周SpA共同的临床特征。我们证明了VEGFA古典和MSX 2在非经典状态下，单核细胞与SpA患者周围关节肿胀和疼痛的数目有关。我们认为单核细胞可能与SpA患者周围性关节炎的发生有关。这可能是通过特定的亚群体效应，将发炎关节的数目与表达VEGFA在经典的单核细胞和MSX 2在非经典单核细胞中。

脊椎关节炎(SpA)是第二大最常见的炎症性风湿病(依地理区域而定，约占0.2%-1.6%)。1以慢性炎症和结构损伤为特征，累及轴向和周围骨骼。近年来，SpA的研究主要集中在SpA亚组的表型表现和病理生理学方面。非X线轴向性脊柱炎、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎、炎症性肠病及未分化的脊椎关节炎)的探讨，无论SpA是一种临床表现各异的单一疾病，还是一组有共同体征和症状的不同临床实体。2.

遗传、免疫病理和临床证据表明，尽管有共同的下游途径，如巨噬细胞源性肿瘤坏死因子α介导，水疗中的炎症是由不同的细胞和分子介质驱动和维持的。3,4。此外，有人认为SpA是一种由先天免疫细胞驱动的自身炎症性疾病，而不是由自身反应性T和/或B淋巴细胞触发的真正的自身免疫性疾病。5。SpA的表型分类通常基于关节外体征(银屑病和炎症性肠病)、病机(反应性关节炎)或结果(强直性脊柱炎)。2。然而，所有表型均有相似的轴向(骶髂炎、脊柱炎、背痛)或外周(关节炎、末梢炎、大疱炎)的表现，因此SpA可分为两种亚型之一，具有不同的病理生理，主要累及轴向或周围骨骼。1。换句话说，有人建议根据其病理生理学而不是其表型表现来定义SpA，因为来自免疫病理研究和临床试验的新数据表明，轴向(Axspa)和外周(Pspa)性脊柱炎可能是由不同的机制驱动的，并对治疗有不同的反应，支持根据轴向或周围疾病的存在对Spa进行分类。2。然而，考虑到SpA可能是一个单一的实体，问题在于axSpA和PSPA的共同临床特征是否有共同的触发因素，特别是在慢性代偿和治疗作用发生之前的早期。因此，探讨导致axSpA和PSPA共同的SpA表现的机制是很有意义的。在疾病的早期阶段，它们可能是最易变的，同时也是最能提供信息的。

在这种环境下，单核细胞亚群作为促炎和抗炎细胞因子、骨重塑蛋白和其他生物活性物质来源的病理生理学作用还没有完全阐明。此外，有证据表明单核细胞可能是新的骨形成细胞(“单骨细胞”)的来源。6.

本研究的目的是将axSpA和PSPA的特征性临床特征与SPA患者血单核细胞三个亚群中所选基因的不同表达联系起来。我们重点研究了在axSpA和PSPA中都能表达的表现，即关节炎、末梢炎、大疱炎和炎症性背痛。这可能有助于了解单核细胞(可能来自单核细胞)、巨噬细胞和破骨细胞如何驱动特定的病理过程，这些过程随后被解释为axSpA和PSPA的特征性临床症状。

人口、临床和实验室数据

表1呈现病人的特征。AXSpA患者的中位年龄(年龄，IQR)为33.5(29.7~39.7)，PSPA患者为35.5(31-38.5)。AXSpA患者的中位病程(IQR)为7(5-10.7)，PSPA患者为3(2-9.5)。95%的axSpA和38%的PSPA患者HLA-B27阳性.

15例患者符合强直性脊柱炎的MNY标准。

选择的基因和探针板在三个单核细胞亚群中有不同的表达。

为了探索SPA中单核细胞亚群中mRNAs的表达情况，我们利用Metcalas等人先前的一项研究中生成的微阵列表达数据。7(18人，每个样本3个单核细胞亚群)。我们确认了94个基因(154个探针)构成了我们的mRNA SPA面板，然后通过主成分分析，我们确定了3组样本--每个样本对应于不同的单核细胞亚群，如图所示。1.

对经典(黑点)、非经典(绿点)和中间(红色点)单核细胞的微阵列表达数据进行了计算机分析。只有在基因中进行初步检测(并在阵列上表达得很好)的探针才能进行这一分析。PC1和PC2是利用R中的prcomp函数对表达式数据进行估计的前两个主成分。49.

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MRNA与临床症状的关系

我们分析了不同单核细胞亚群中的mRNAs是否与axSpA和PSPA的临床表现相关。(1)炎症性背痛(全身背痛，BASDAI问题2，范围1~10)；(2)肿胀关节数(66个关节总数中，28个关节计数中DAS28分)；(3)疼痛关节数目(68个关节总数中，28个关节计数中有DAS 28分)，(4)Enthesitis和(5)Das 28评分中的dactylitis。

表达VEGFA在经典的单核细胞是与肿胀和疼痛的关节数目有关。

我们发现血管内皮生长因子A(VEGFA)经典单核细胞mRNA水平与关节受累程度呈正相关，即关节总数中的肿胀关节数和DAS 28评分中的肿胀和疼痛关节数，每项指标的假发现率(FDR)均<0.05。最有力的关联，FDR<0.001是观察到的肿胀关节数目从DAS 28评分(表)2).

表达MSX 2非经典单核细胞也与周围性关节炎有关。

我们鉴定了肌肉段Homeobox 2((MSX 2)非经典单核细胞中mRNA的表达与周围性关节炎的测量呈正相关，即关节总数中的肿胀关节数和das 28评分中的肿胀和疼痛关节数，在fdr<0.08下，每项指标均符合fdr<0.08(表)。2).

单核细胞中间亚群中所选基因的表达与关节肿胀和疼痛的数目之间没有显著的相关性。的表达式之间既没有关联，也没有关联。VEGFA或MSX 2在随后的单核细胞亚群中有其他水疗临床特征的mRNAs，例如炎症性背痛、末梢炎或大疱炎。

在这里，我们提供了证据，单核细胞是先天免疫系统的细胞，可能参与SPA周围关节炎的发展，因此在考虑慢性炎症时可能起作用，慢性炎症是本病最重要的特征之一。

有大量证据表明，先天免疫系统在各种水疗特征的发病机制中起着重要作用，包括慢性炎症、修复和新骨形成。8,9。SPA中的外周血单核细胞似乎在功能上启动和/或被尚未明确识别的因子重新编程，并表现出SpA的分子或细胞特征特征。10,11,12。单核细胞分为三个亚组：经典的(CD 14)。++CD 16−)、中间(CD 14)++CD 16+)和非经典(CD 14)+CD 16++后两个亚群体被称为“促炎”。13。“促炎”子集形成了应用程序。5-15%的循环单核细胞在多种因素的刺激下表达和分泌大量促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素-12和白细胞介素-1，但抗炎性白细胞介素-10的量不大。14。相反，经典的单核细胞产生的肿瘤坏死因子α相对较少，但它们是白细胞介素10的有力来源。15。在生理条件下，大多数经典单核细胞(约80%-90%)在循环1天后离开血液，而剩余部分则进一步成熟为中间细胞，并最终转化为APP。在离开循环前12天进入非经典单核细胞16。然后，外渗单核细胞补充静止组织巨噬细胞的数量，但它们在功能上可能有所不同。这些细胞可能通过血管内或局部释放的因素影响炎症过程。17.

目前，只有少数几项研究(基于对单个血液样本的分析)调查了从健康个体分离的单核细胞亚群的转录组/蛋白质组谱的差异。18,19,20,21,22,23,24,25]。这些研究表明，在分子基础上，这三个单核细胞亚群之间的遗传图谱存在显著差异，证实并扩展了大多数以前的表型和功能观察。然而，到目前为止还没有数据比较显示轴向或外周体征的水疗患者单核细胞亚群中的基因表达情况。

此外，我们以前已经证明，在经典，中间和非经典单核细胞数量在axSpA和PSPA患者之间没有差异。SpA患者和对照组在中间单核细胞和非经典单核细胞的数量上也没有差异。SPA患者与对照组在经典单核细胞方面的差异仅在统计学上有显着性差异。26.

血管内皮生长因子-A(VEGFA)是参与血管发育和血管生成的重要生长因子之一。由于骨是一个高度血管化的器官，血管生成在成骨过程中起着重要的作用，因此VEGFA也影响骨骼发育和生后骨修复。27。骨重塑的过程是建立在骨形成和吸收之间的平衡之上的。28。这种平衡的紊乱可能在很大程度上取决于破骨细胞和成骨细胞的活动。刘等人29提示血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子α可能直接参与成纤维细胞向成骨细胞的分化，抗VEGFA被认为是一种可能的预防Spa患者成骨的新疗法。28.

我们已经证明VEGFA-经典单核细胞mRNA表达与关节肿胀和疼痛的数目呈正相关。我们的结果也证实了水疗患者血清中VEGFA水平高于健康献血者(附图)。1)支持Lin等人先前的研究结果。30。这可能认为经典单核细胞亚群是VEGFA的主要来源，当移行到周围关节滑膜时，VEGFA可能会促进SpA患者的局部炎症反应。研究表明，强直性脊柱炎患者血清VEGFA和滑膜液水平明显升高，表现为周围性关节炎。31,32。此外，VEGFA可能由不同类型的细胞分泌，包括巨噬细胞，这些细胞存在于水疗患者的滑膜和血管内，但与特定单核细胞亚群(作为特定组织巨噬细胞的来源)没有明确的关联。32.

虽然VEGF在SpA发病机制中的作用可以在以前的科学观察和临床证明的基础上被实用化地解释，但是我们的第二个关于MSX 2的发现并不是那么容易解释。MSX 2是一种转录因子，具有同源盒结构域，可能与骨发育和异位钙化有关，尽管其在这些过程中的作用仍有争议。33,34,35,36,37,38,39,40,41,42。Furuichi等人通过序列筛选共检测了15个基因中的45个单核苷酸多态性(SNPs)，并报告了有前景的证据。MSX 2日本人群中SPA基因多态性的研究33。此外，在涉及动物模型的基础研究中，MSX 2敲除小鼠的轴向骨矿化明显减少，骨祖细胞的增殖减少，颅骨骨化和颅骨发育异常。34，而转基因小鼠过度表达MSX 2颅骨细胞增殖增强35,36。功能缺失突变MSX 2在人类中，这会降低DNA结合活性，导致颅骨骨化的缺陷。37。这些观测结果与MSX 2，这导致了一种常染色体显性遗传病--波士顿型颅结节病。38,39。这些发现表明MSX 2表达在颅骨发育中起着至关重要的作用，提示其在骨发育中具有积极的骨化作用。然而，MSX 2蛋白抑制骨标记基因的表达，包括RUNX 2(成骨细胞分化的主调节因子)和骨钙素，并负调控骨发育和异位钙化。40,41,42。MSX 2的作用可能因细胞类型和/或细胞分化阶段而异。

我们已经证明MSX 2-mRNA在非经典单核细胞中的过度表达与关节肿胀和疼痛的数目呈正相关，因此质疑这种蛋白在非经典单核细胞亚群中优先表达的规范作用。结果表明，肿瘤坏死因子α可诱导MSX 2肿瘤坏死因子α在成骨细胞分化中的作用及MSX 2的表达43,44。不排除MSX 2在非经典单核细胞中的表达与其促炎作用有关。此外，在移入软组织后，非经典单核细胞可能导致局部抑制BMP 2调节的成骨细胞在发炎周围关节的分化。44因此可能与新骨形成和关节重塑有关。这些概念必须通过适当的小鼠模型(例如SKG小鼠)来验证，该模型目前正在进行中。

我们的研究有一定的局限性。显然，病人的数量很少，但我们相信，这一试点观察是有趣的，尽管还需要进一步的研究。此外，这是一项横断面研究，我们不知道所发现的结果是否经久耐用，足以归因于PSPA的慢性疼痛和滑膜炎特征。最后，我们只是探索外周血单核细胞，没有匹配的数据，考虑到滑膜组织的局部环境。

我们的数据表明单核细胞可能在水疗患者周围关节炎的发展中起作用。这可能是由于亚群体的特殊效应，将肿胀和疼痛关节的数目与经典单核细胞中VEGFA的表达和MSX 2在非经典单核细胞中的表达联系起来。我们首次认为，在SPA患者中，单核细胞的经典和非经典亚群中两种蛋白的过度表达可能与外周关节的炎症过程有关。

病人

36例SpA患者(20例axSpA和16例PSPA)按国际协会分类标准评定45,46参加了这项研究。患者年龄在45岁以下，未接受合成、合成或生物疾病修饰抗风湿病药物(DMARDS)，不使用全身糖皮质激素。患者提供经签署的知情同意，研究方案得到当地生物伦理委员会的批准，所有方法均按照相关指南和条例进行。

单核细胞及其亚群的分离

从SpA患者外周血单个核细胞(PBMC)中分离出单核细胞亚群。用标准的Pancoll人密度梯度离心法从EDTA处理的全外周血中分离PBMC。PBMC用pbs(Sigma-Aldrich，美国圣路易斯)和单核细胞亚群(古典-CD 14)清洗。++CD 16−，中间-CD 14++CD 16+和非经典CD 14+CD 16++)采用流式细胞术分离细胞。用下列单克隆抗体对单核细胞进行染色：抗CD 14-fITC(克隆Mφp9，BD生物科学，美国圣何塞)，抗CD 16-PE(克隆3G8，BD生物科学)和抗HLA-DR-percp(克隆L 243，bd生物科学)，1：25稀释v/v染色和门控，如我们和其他人所述。47,48。染色后的单核细胞在4℃下孵育30 min，然后用FACSAriaⅡ细胞分类器(BD生物科学)进行分类。分选机配备488 nm激光激发FITC、PE和PerCP。荧光检测采用以下带通滤光片：FITC 530/30，PE 582/42，PerCP 695/40。分离后，用PBS洗涤细胞，350×离心10 min。g在−80°C下冷冻，直至RNA分离。

基因表达的实时PCR分析

基因表达分析采用实时PCR方法和TaqmanArray，人成骨，快速96孔板，#4418741(覆盖92条成骨相关基因和4个内源性对照基因，补充表)。1)(Thermo Fisher Science，Waltham，MA，USA)。用miRVana微RNA分离试剂盒(Thermo Fisher Science)分离RNA，用上标IV Vilo主混合(Thermo Fisher Science)将分离出来的RNA转录成cDNA。然后，利用TaqMan阵列人成骨板和QuantStudio 3实时PCR仪(Thermo Fisher Science)，根据制造商的协议，利用cDNA进行基因表达谱的评估。

统计方法

所有的统计分析，以及数据预处理、标准化和可视化都是用R语言进行的(3.5.2版)49。该表达式计算为CT值，并根据制造商的指示进行过滤(只有高置信度的值用于进一步分析)。随后，将数据分成三个面板，每个面板对应于不同的单核细胞亚群：(1)经典的，(2)中间的，(3)非经典的。表达式值使用分位数归一化方法进一步规范化，在包“preprocessCore”中实现了这种方法(版本1.44.0)。在目标统计分析中，只使用在给定面板中至少有5个观察结果的基因。作为回报，对37例非经典单核细胞、38例经典单核细胞和38例中间单核细胞进行了88个基因的进一步分析。用一个简单的线性模型(只含截距和一个预测因子)和经验Bayes校正(3.38.3版)，检测单核细胞轴向或外周体征与基因表达之间的关系。