Ige激活的肥大细胞增强TLR 4介导的抗原特异性CD4+T细胞反应

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发表时间：2021-05-07 09:42作者：武汉新启迪Xinqidibio

摘要

肥大细胞是变态反应和哮喘的有效介质，但其调节适应性免疫的作用仍不明确。在肥大细胞表面，与fcεRI结合的IgE被一种特异性抗原交联，从而触发免疫介质的释放，如组胺和能激活其他免疫细胞的细胞因子；然而，关于肥大细胞对诱导内源性抗原特异性CD4的作用知之甚少。+T细胞在这里，我们研究了体内特异性肥大细胞激活对抗原特异性CD4的启动的影响。+T细胞反应。而CD4+单独刺激FcεRI并不能增强T细胞的活性，FcεRI与TLR 4联合刺激可协同增强T细胞的活化。这种增强的激活依赖于整体TLR 4的刺激，但对表达TLR 4的肥大细胞的依赖性较小。本研究为支持肥大细胞作为抗原特异性适应性免疫应答介质的作用提供了重要的新证据。

导言

肥大细胞(MCs)是上皮和粘膜表面抵抗过敏原和入侵病原体的第一线捍卫者，因为它们存在于宿主-环境界面上。他们是已知的过敏和哮喘的发起者，通过激活高亲和力的IgE受体fcεRI，发现于细胞表面。1。IgE结合受体的抗原(Ag)交联导致预先形成的和新合成的促和抗炎细胞因子和介质的释放。2。除其已知的病理生理学作用外，MCs还表达多种受体，包括模式识别受体(Prrs)，如Toll样受体家族(TLRs)，使它们能够对病原体产生特定的反应。3,4。虽然在历史上被认为主要是免疫的早期中介，但越来越多的证据表明MCs在吸收中性粒细胞、诱导局部炎症和激活CD8方面起着重要作用。+T细胞5,6,7。此外，MCs还能启动抗原提呈细胞，如树突状细胞(DC)，然后将抗原呈递给T细胞。8,9。通过分泌颗粒和直接串扰，MCs还支持dc迁移到引流淋巴结，并在LPS诱导的炎症后启动T细胞。10。相反，研究表明MC基因产物和细胞因子可以通过CD4调节细胞(T)产生免疫抑制组织状态。雷格)功能11。这种在免疫过程中发挥促炎和抗炎作用的二分法导致了基于免疫环境的MCs是“可调节的”的假设。12。由于早期的证据显示IgE介导的mc在适应性免疫中的作用，我们试图找出这种启动是否会导致抗原特异性T细胞反应。13,14,15.

虽然MCs在适应性免疫的某些方面的作用已经被研究过，但MCs与内源性Ag特异性CD4之间的联系。+免疫后的T细胞免疫不太清楚。12。尽管最近的研究表明，在强烈的非特异性炎症反应面前烧蚀MC并没有CD4的作用。+T细胞活化，对mc的直接激活如何影响CD4的研究较少。+T细胞反应1,16。在此，使用IgE介导的真皮内MC激活与CD4模型相结合的体内模型。+T细胞抗原，我们试图探索高度特异性的mc激活如何激活CD4。+T细胞这与人类疾病有关，人们知道，在特应性皮炎或支气管哮喘期间，对革兰氏阳性和阴性细菌病原体特异性的IgE是普遍存在的。17,18,19,20,21。这也促使我们研究fcεRI在mcs上的参与是如何影响抗原特异性CD4的。+T细胞在细菌病原体相关分子模式下的反应，如Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR 4)激动剂脂多糖(LPS)可能存在于这些特应性患者中。我们发现，虽然单是特异性的MC激活不足以扩大内源性的抗原特异性CD4。+T细胞在TLR 4配体LPS存在下激活MC，与单纯MC激活或LPS刺激相比，T细胞活化明显增强。以前的研究已经评估了CD4。+化学激活剂化合物48/80或疫苗诱导的炎症刺激对T细胞的反应均缺乏MC激活的特异性。16。为了避免旁观者激活其他免疫细胞的可能性，我们使用了一种系统，其中MCs通过在其细胞表面交联Ag特异性IgE，通过注入Ag本身，以高度特异性的方式被激活。综合起来，这些数据提供了对MCs微调适应性T细胞反应的能力的洞察力，这种能力是基于感染过程中经常发现的外部刺激。这些结果也解决了近年来备受争议的mc领域的一个基本空白，即mcs可能不会对适应性免疫反应产生根本性影响。22。了解MCs作为变阻器的作用方式，不仅提高了我们对MCs如何参与适应性免疫反应的理解，而且还使我们能够利用它们获得更好的疫苗效果。23.

结果

体内IgE介导的MC激活不增强内源性Ag特异性T细胞应答。

最初，我们确定IgE介导的mc激活是否促进内源性抗原特异性CD4的诱导。+T细胞反应。为此，C57BL/6小鼠经皮内注射鸡卵卵清蛋白特异性IgE，并在耳皮内负载MC FCεRI。一天后，这些致敏MC被皮内注射OVA特异性激活，以交联MC表面的IgE。这种激活是在C57BL/6小鼠体内被内源性CD4 T细胞承认为外源性的模型Ag2W1S存在的情况下进行的，在那里我们可以准确地检测2W1S特异性T细胞的存在和激活，从而对抗原作出反应(补充图)。1)。我们推测MC活化与2W1S结合会使2W1S特异性CD4 T细胞增殖。对照组在IgE未致敏的情况下注射OVA+2W1S，或在IgE致敏小鼠中单独注射不含OVA的2W1S，以证实注射过程无旁观者效应(图一)。1a)。然后我们量化了内源性2W1S特异性CD4的数量。+2W1SMHCⅡ类四聚体标记和富集注射部位引流颈淋巴结(CLN)的T细胞24。内源性2W1S-特异性抗原性CD4+T细胞经鉴定为CD 44。+/I-Ab*2W1S+细胞(图1.1b)。与单用IgE致敏或单用OVA相比，FCεRI交联不改变CLN或脾脏中2W1S特异性T细胞的数量(图1)。1c，D)。提示特异性IgE介导的mc激活不足以诱导抗原特异性CD4。+T细胞免疫。我们的发现并不排除MCs在其他危险信号存在的情况下作为T细胞反应的潜在贡献者的作用，这些危险信号可能会在感染期间出现。MCS通过这些受体表达功能性TLRs和刺激，被认为是防止病毒、细菌和寄生虫感染的部分原因。25。由于MCs被认为是“可调的”，因为它们能够根据刺激的类型释放特定的介质，所以我们接下来就研究在tll样受体4(TLR 4)激动剂lps的存在下，mc激活是否会对抗原特异性CD4产生影响。+T细胞扩张。

在体内，在LPS存在下，IgE介导的MC激活导致内源性抗原特异性CD4增加。+T细胞

Fc、ε、RI和TLR 4对鼠原代和永生化MC系体外MC细胞因子释放有协同作用。26。骨髓源性MCs(BMMCs)经OVA特异性IgE致敏后，经OVA和LPS联合刺激后，IL-6细胞因子的释放与LPS暴露或IgE受体交联未见明显的协同作用(图1)。2a)。用加权最小二乘法对IgE、OVA和LPS之间的协同效应进行了额外的检验。在饱和模型中R2在0.99中，10μg/mL的LPS联合IgE可显著提高IL-6的表达水平，达124.0 pg/mL(P<0.01)。PIgE与OVA的相互作用使IL-6的表达增加了1372.8 pg/mL(P<0.01)。P < 0.001) and the interactions between IgE, OVA and LPS of levels 0.1, 1, and 10 were found to increase IL-6 expression by 604.1 pg/mL (P < 0.001), 3864.3 pg/mL (P < 0.001) and 6274.7 pg/mL (P < 0.001) respectively, confirming the synergistic effect of combined treatments. (Full equation in Materials and Methods). Further, when we tested the ability of IgE, OVA, and LPS to activate BMMCs derived from TLR4 knockout mouse bone marrow, we found that the synergistic effect was lost in the knockout cells compared to WT BMMC (Supplemental Fig. 2)证实TLR 4信号通路对MC IL-6释放的联合作用是必不可少的.小鼠mc IL-6和组胺分泌，以及Ox 40/OX40L信号通路的参与，已被证明能抑制Treg功能，从而提高效应分子CD4的活性。+和CD8+T细胞27,28,29。体外白细胞介素-6分泌的增加使我们推测，通过fcεRI和tLR 4在体内共刺激可导致抗原特异性CD4的增加。+依赖TLR 4信号的T细胞反应。

利用上述模型，我们首先用皮内注射OVA特异性IgE致敏小鼠耳.第二天，小鼠皮内注射2W1S和OVA(刺激致敏MCs)或LPS，或联合OVA和LPS。如先前所观察到的(如图所示)。1C，D)，MC激活并不能促进2W1S特异性T细胞在引流淋巴结和脾脏中的进一步扩张(图1)。2b、c)。在接受LPS的小鼠中，2W1S特异性T细胞的数量略有增加，与作为免疫原的LPS相一致。30,31,32。然而，当MCs在LPS存在下被激活时，与单独治疗相比，CLN和脾脏中2W1S特异性T细胞的数量显著增加(图1)。2b、c)。用线性回归法检测IgE、OVA和LPS对T细胞计数的协同作用。在一个经过调整的模型中R2在0.64中，IgE和LPS联合治疗可使T细胞数增加约1289个。P结果表明，IgE、OVA和LPS之间的相互作用可使T细胞总数增加约2675个。P(=0.001)，证实了联合处理的协同效应。(材料和方法的完整方程式)。这些结果表明，在LPS存在下，IgE介导的MC激活可导致抗原特异性T细胞的协同扩增。T细胞增加的一个可能原因是LPS能促进过敏性哮喘小鼠MC脱颗粒，从而增加细胞因子的释放，从而激活T细胞。33。也有证据表明，脂多糖可以抑制IgE介导的MC反应，并可能通过降低fcεRI的表面表达和相关的IL-10增加来调节随后的T细胞反应。34。此外，我们的结果没有证实脂多糖是否与FCεRI直接交联在MCs上或通过另一种细胞类型的共刺激作用。因此，我们进一步研究了单核细胞本身是否需要提高抗原特异性T细胞反应.

增强的抗原特异性T细胞反应需要MCS。

为了确定MCs是否直接参与内源性抗原特异性T细胞反应，我们利用Mcpt 5-CRE x iDTR白喉毒素(DT)可有条件消融MCs的小鼠35,36,37。这个Mcpt 5-CRE x iDTR选择的小鼠是因为他们完整的c-kit表达，粘膜MCs的滞留，以及与WT小鼠相似的嗜碱性细胞数。38,39,40,41。小鼠静脉注射2 0 0ng DT 5天，以确保在抗原传递和MC活化前结缔组织MC消融(图1)。3a)。免疫荧光(IF)显微图像显示，在IgE致敏日，在最后一次注射dT后的一天，CRE+小鼠的MC数量比CRE-少白蚁对照组减少(如图所示)。3b)。MCs消融显著减少2W1S特异性CD4。+T细胞对LPS加IgE交联的反应(图1)。3c)。这种差异在脾脏中不太明显(见图)。3d)。这些结果表明，MCs通过其IgE受体致敏和激活后，是放大LPS提供的炎症信号，导致皮肤滤过性淋巴结内内源性Ag特异性T细胞增殖的重要因素。

TLR 4介导LPS与IgE介导的MC激活共刺激作用增强内源性Ag特异性T细胞应答

为了确保我们观察到的LPS共刺激作用是由其受体TLR 4介导的，我们评估了2W1S特异性CD4的数量。+T细胞TLR 4-/-小鼠IgE/OVA和LPS共刺激42。与LPS通过TLR 4刺激适应性免疫反应相一致，LPS处理的TLR 4缺乏小鼠的2W1S特异性T细胞明显减少(图1)。4A，B)43。此外，当MCs在LPS存在下被特异性激活时，TLR 4基因敲除小鼠正常情况下检测到的2W1S特异性T细胞的扩增量明显减少(图1)。4(A)证明TLR 4对MC对CD4的放大作用是必不可少的。+T细胞脾脏也有类似的变化(图一)。4b)。我们的发现表明，IgE介导的MC激活所产生的特异性适应性免疫反应可能依赖于TLR激动剂的存在，可能只有LPS与TLR 4结合。

Mc TLR 4的表达与增强的内源性抗原特异性CD4无关。+T细胞反应

多项研究表明，MCs表达多种TLRs，包括鼠和人的TLR 4。44,45,46,47,48。我们的研究结果表明，通过其IgE受体的特异性MC激活促进了同时暴露于LPS的小鼠的抗原特异性T细胞反应；然而，这种增强是由于MCs上的FCεRI和TLR 4直接共刺激导致MC介质释放上调，还是由于LPS对激活的MCs产生旁观者效应而引起的。为了确定LPS是否特异性地针对MC TLR 4，我们通过交叉Mcpt 5-CRE带着TLR 4-浮标仅在结缔组织MCs中TLR 4表达被删除的小鼠。TLR 4和MCs的免疫荧光显微镜观察证实TLR 4在真皮MCs上没有表达(如图所示)。5a)。

应用先前的免疫策略，无论MC是否被特异性激活，在注射LPS的情况下，我们都检测到了2W1S特异性T细胞的增殖，无论TLR 4是否由皮肤中的MCs表达。5b、c)。这种扩张在排水CLN和脾脏中都是相似的。我们的结果表明，虽然TLR 4的表达和激活是全T细胞扩增所必需的，但MCs上的TLR 4本身对此可能并不重要，尽管我们不能完全排除MC表达的TLR 4在我们的系统中所起的作用。在这里，MCs可以作为LPS传递给其他细胞类型的信号的放大器，这些细胞类型参与形成抗原特异性T细胞反应的大小，同时也可能对这种反应贡献一些TLR 4衍生的信号。我们的研究首次在体内提供了直接证据，证明MCs可以通过感知和响应局部环境中的信号组合来调节适应性T细胞结果的大小。

讨论

越来越多的证据支持MCs在形成适应性免疫反应方面发挥作用，但最近在这方面的争议更大。一些早期的研究，包括我们自己的研究，表明MCs是细菌清除的重要媒介，并能激发先天和适应性的免疫反应，主要是通过细胞因子TNF-a的作用来介导的。9,49,50,51,52,53,54。其他的研究使用了多种mc耗竭或缺乏的模型，表明mcs在诱导抗病毒感染的免疫方面起着重要的作用。55,56,57,58。许多早期研究依赖于c-kit缺陷小鼠(W-sash或W/W)。v)，这可能会使MCs的作用变得复杂。59,60,61,62,63。最近的研究使用了靶向的MC消融模型，在不影响其他细胞类型的情况下，MCs可以被专门删除。16,38。这些研究表明，MCs在诱导免疫方面所起的作用较小，甚至没有作用，特别是，化合物48/80等MC激活物对MCs的特异性比最初观察到的要小。我们试图了解在没有这些潜在的混杂因素的情况下，MCs在调节T细胞反应中的更精确的作用。为此，我们研究了IgE介导的刺激，一种比以前更特异、更生理的mc激活，是否会影响内源性的、抗原特异性的CD4。+T细胞反应。与最近的研究相一致，我们发现特异性MC激活对T细胞反应没有影响，但与TLR 4激动剂LPS联合作用时，MCs是T细胞反应的重要放大器。这一结果在mc激活部位最明显--引流的颈部淋巴结，而在相同小鼠的脾脏中则不那么明显，这一点以前就已经证明过了。64。这可能是由于抗原特异性T细胞在引流淋巴结中的浓度，而这种差异可能是最明显的。脾脏作为一种较远的组织，更有可能反映T细胞逃避引流淋巴结进入循环。我们的结果提供了进一步的证据来支持MCs作为一个协调者而不是诱导T细胞反应的主要驱动力的新观点。我们在野生型小鼠体内发现LPS与IgE介导的激活有明显的协同作用，但这种差异在失去协同效应的MC消融模型中不太明显，尽管MC明显需要激活T细胞。这种差异的一个解释是DT除了Mcpt5-cre DTR小鼠外，还可能对小白鼠有潜在的影响。虽然DTR工程小鼠模型在研究免疫和疾病状态方面具有重要价值，但消耗特定细胞类型的DT并不是免疫惰性的。例如，Chapman等人在研究肺内耐受性的起始和破坏时。发现气管内注射DT可引起野生型和转基因小鼠的炎症反应。65。同样，在肺部真菌感染模型中，cd11c-dtr小鼠局部和全身注射dt可导致致命性暴发性心肌炎，这可能是由于放射性抗药性的非造血细胞型所致。66。我们推测，潜在的DT诱导的炎症，再加上强烈的刺激信号，如LPS(IgE/LPS组)，会导致抗原特异性T细胞反应增强，而IgE受体交联则不会进一步升高。尽管如此，我们的数据显示，抗原特异性T细胞应答的协同增加需要肥大细胞，也可能是另一种表达TLR 4的细胞类型。

在生理上，这些发现在人类疾病中有着各种各样的含义，特别是在特应性疾病方面。众所周知，特应性皮炎和过敏性哮喘的病例有时与细菌感染有关，并因细菌感染而加重。17,19。在这种情况下，人们会发现两种IgE激活的MCs结合细菌产品，如LPS。我们的发现提供了机械和病理学的洞察为什么病理增加在这些病例。此外，已知MCs是细菌清除的重要介质，IgE介导的MCs激活与LPS的存在相结合可以提高细菌的特异性适应性免疫，从而产生细菌清除。虽然TLR 4是这种增强反应所必需的，但我们也发现TLR 4在MCs上的表达本身不太明确，我们不能完全排除TLR 4在我们的模型系统中对MCs的可能贡献。虽然多项研究表明tLR 4在MCs上表达，但最近的一项研究发现MCs可能不表达模式识别受体，这意味着其他表达TLR 4的细胞可能协同MCs来扩增T细胞反应。44,48,67。虽然TLR 4的主要特征与先天免疫系统有关，但研究表明，TLR 4的激活可导致T细胞介导的免疫反应和不同的T辅助反应，使该受体成为疫苗佐剂最受欢迎的靶点。68,69,70,71,72。值得注意的是，CD4 T细胞本身在表面上表达TLR 4。73因此，我们观察到的LPS效应除了涉及T细胞对MC衍生因子的反应外，还可能涉及T细胞对TLR 4连接的直接反应。MCs在适应性免疫系统中的tLR 4激活中所起的作用，除了在MC表面刺激时释放的促炎细胞因子外，尚不清楚。74。我们在这里表明，在体内，MCs似乎与tLR 4的连接有特殊的协同作用，从而诱导抗原特异性CD4的更大的扩展。+T细胞未来的研究将探索其他可能介导这种效应的TLR 4表达细胞。

众所周知，MC产品可以调节DC的成熟、迁移和随后的T细胞表型，MCs可以与DC形成突触，以促进抗原转移和随后的T细胞活化。9,10,75,76,77,78。Dcs表达较高水平的tLR 4，因此LPS很可能作用于dc，而dcs则接收来自mcs的增强信号，进而激活cd4。+T细胞事实上，dcs的tLR 4激活是连接先天和适应性免疫反应的关键途径，因为TLR 4的刺激通过上调共刺激分子和产生促炎细胞因子来诱导dc成熟。79,80。综上所述，我们的结果表明，暴露在变态反应环境中的细菌病原体，如IgE介导的mc激活，可以导致更强的和协同的抗原特异性CD4。+T细胞反应，这一结果既有利于防御病原体，又能在变态反应性疾病的恶化中产生问题。对无害的过敏原和致病性信号都以特定刺激的方式作出反应的能力使MCs处于一个独特的位置，对宿主对外部环境的反应是有益的，也是有害的。了解MCs作为效应者和调节者在先天和适应性反应中的多功能作用，将导致更好的策略，以对抗疾病的过敏倾向是普遍存在的。