工程化沙门氏菌多基因小鼠肿瘤模型对肿瘤转移的抑制作用
我们观察到沙门氏菌Yb1，一种基于野生型的氧敏感工程菌株。[医]斑疹伤寒菌SL 72076，对BALB/c小鼠乳腺癌4T1细胞株所建立的两种不同转移模型的肺转移有相似的抑制作用(图一)。1A-E)。YB1处理的原位转移模型在原发肿瘤生长中仅表现出轻微的延迟，但肺转移明显减少(图一)。1A，b)。治疗后1周手术切除原发肿瘤时，44%的YB1处理小鼠存活60天以上无转移，而对照组小鼠均于26天内死于肺转移(图1)。1C和补充图。1A)。小鼠经YB1预处理后，静脉注射癌细胞(i.v.)通过尾静脉建立肺转移瘤。1D表明YB1治疗完全抑制了肺内转移的形成(图一)。1E)。值得注意的是，单剂量YB1激发的抗转移活性至少可以持续2周(补充图)。1B，c).
图1：沙门氏菌YB1治疗抑制多基因小鼠肿瘤模型的肿瘤转移。a建立4T1-BALB/c原位转移模型的全过程。肿瘤细胞接种后用YB1或PBS治疗。b4T1原发肿瘤大小的量化(双面倍数)t-试验)和相关的肺转移(未配对双尾)t-试验)YB1治疗后4T1-BALB/c原位转移模型(n=6 PBS，n=7 YB1)。c小鼠肿瘤大小测量(未配对双尾)t-实验)切除4T1原发肿瘤及相关的Kaplan-Meier生存曲线(对数秩试验)。n=8 PBS，n=9 YB1)。d建立4T1-BALB/c转移模型的程序。4T1细胞为i.v。用YB1或PBS预处理BALB/c小鼠。e布林溶液固定肺图及定量(未配对双尾)t-测试、显示是三个独立实验的综合结果，n在4T1-BALB/c实验转移模型中，YB1治疗后的4T1肺转移瘤为16例(每组16例)。f肺图和定量(未配对双尾)t-测试，n在BALB/c小鼠结肠癌模型(CT26)中，YB1治疗后肺转移率为11/(每组)。gC57BL/6J小鼠膀胱癌模型(MB 49)4%PFA固定肺图像及典型肺组织H&E染色(英文)n=每组4只)。标尺，3毫米。用PBS标本中的H&E染色法对浓缩的肿瘤结节进行染色。h肺图和定量(未配对双尾)t-在C57BL/6J小鼠接种黑色素瘤(B16F10)建立的实验性转移模型中，YB1治疗后肺转移的实验研究(英文)n=8 PBS，n=9 YB1)。i不同剂量YB1治疗后4T1~BALB/c肺转移模型中4T1肺转移的定量研究n=每组5人)。P-无yb_1处理与不成对双尾处理不同剂量yb_1的数值比较。t-测试。图和图像是两个独立实验的一个有代表性的实验(b, c, g, i)。图是两个独立实验的综合结果(f, h)。所有数据均以平均值±扫描电镜表示。源数据作为源数据文件提供。
为了确定YB 1对肺转移的抑制作用是肿瘤类型依赖性的还是宿主遗传背景依赖性的，我们将分析扩展到其他几种基于不同癌细胞株和小鼠株的实验转移模型。在BALB/c背景下，除了具有上皮细胞形态的小鼠乳腺癌4T1细胞外，16，我们用BALB/c背景下成纤维细胞形态的小鼠结肠癌CT 26细胞系。17在相同的背景下代表不同的肿瘤类型，对YB1治疗的肺转移有相似的抑制作用(图一)。1F)。除了来自实体肿瘤的细胞系外，我们还测试了一株小鼠淋巴细胞白血病L 1210细胞株，该细胞系向骨髓、血液和其他器官转移。18,19。静脉滴注后第6天用YB1治疗。接种L 1210细胞能有效地抑制癌细胞向骨髓的归巢(补充图)。1D-f)。我们将BALB/c小鼠的转移模型扩展到C57BL/6小鼠株，以代表不同的小鼠遗传背景。C57BL/6小鼠膀胱癌MB 49细胞株和黑色素瘤B16F10细胞株20在C57BL/6小鼠上建立实验转移模型，YB1对小鼠的肺转移几乎完全抑制(图1)。1g，h)。总之，我们发现YB_1治疗所致的抗转移活性与YB_1的剂量有关(如图1所示)。1I)。虽然父母沙门氏菌SL 7207菌株表现出类似的抗转移作用。沙门氏菌YB1(附图)1g)YB1对宿主的毒性要小得多，几乎没有副作用。6,21(补充图。1H，I)。总之，这些发现提示了一种可能的一般机制，即沙门氏菌是剂量依赖性的，但与癌症类型和宿主遗传背景无关。
沙门氏菌治疗干预早期转移级联，抑制肺癌细胞的早期存活。
复杂的转移过程包括局部侵袭、血管内、循环、外渗和定植。2。任何阶段的干扰沙门氏菌可能导致肺转移减少。因此，我们评估了沙门氏菌转移级联的不同阶段。4T1原位转移小鼠模型于第0天在脂肪垫上植入4T1后不同时间点(7、12、19天)用YB1处理。如图所示。2A-fYB1治疗第7天的抗转移效果最好，第19天的治疗对肺转移无明显抑制作用。为了监测转移状态，不使用YB1治疗的小鼠在每个时间点被处死，以检测肺转移，这种转移仅在第19天才能看到(图1)。2E提示YB1在转移早期有干扰作用，但在转移建立后不起作用。我们推测原发肿瘤细胞的侵袭力可能受YB1的影响。令人惊讶的是，肿瘤切片对上皮间充质转换(EMT)标记物进行了染色。22感染后54h，波形蛋白表达升高，E-钙粘蛋白表达下调，第7天恢复。2)，建议沙门氏菌YB1治疗甚至可能在短时间内诱发EMT，而不是抑制EMT。
图2：沙门氏菌YB1处理会影响新沉积的癌细胞的存活和早期定植。a第0天，将4T1细胞植入BALB/c小鼠的脂肪垫内。两组小鼠于第7天给予YB1(YB1_D7)，n=10)或12(YB1_D12，n分别=9)。PBS作为对照治疗(无YB1，n=10)。第26天测定肺转移情况。在YB1治疗的各个时间点，用H&E染色法检测肺转移情况。b代表H&E染色的小鼠在第7天或第12天死亡，没有YB1处理的小鼠和第26天死亡的小鼠指示的处理。c4T1肺转移瘤的定量研究(未配对双尾)t-从老鼠身上进行的试验a. dYB1在第19天(YB1_D 19，n=10)4T1植入BALB/c小鼠后。PBS作为对照治疗(编号YB1，n=9)。肺转移在第28天量化。f)。第19天和第26天用H&E染色法检测小鼠肺转移情况，不加YB 1处理。e有代表性的小鼠肺H&E染色。f量化(未配对双尾)t-第28天检测4T1肺转移。g, h4T1-Luci细胞(双面倍数)的跟踪与定量t-测试，p腹腔注射荧光素酶活显像=0.0163(30 Min)、0.0039(40 Min)、0.0024(50 Min)、0.0019(60 Min)、0.0015(70 Min)、0.0004(90 Min)、0.0023(100 Min)、0.0004(110 Min)、0.0002(120 Min)、0.0001(130 Min)和0.00006(140 Min)。YB1或PBS预处理BALB/c小鼠3天前注射4T1-Luci(n=每组5人)。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. i跟踪和量化(双尾未配对)t-腹腔注射后3h用荧光素酶活成像法检测MB 49-Luci细胞。YB1或PBS预处理C57BL/6J小鼠3天前注射MB49-Luci(n=每组4人)。b, e红色箭头表示肿瘤组织。标尺，300μm。c, f显示是两个独立实验的综合结果。g–i展示的是两个独立实验中的一个有代表性的实验。所有数据均以平均值±扫描电镜表示。源数据作为源数据文件提供。
尽管观察到肺转移明显减少，但没有迹象表明YB1治疗后癌细胞的侵袭性降低。因此，我们接下来检查转移定植步骤。为了追踪肺转移的定植过程，我们。将荧光素酶标记的4T1细胞(4T1-Luci)注射到经YB1或磷酸盐缓冲液(PBS)预处理的BALB/c小鼠体内，用荧光素酶活体显像对其进行监测。注射后不久，4T1-Luci癌细胞聚集在两组小鼠的肺中，但YB1预处理后小鼠的荧光素酶信号迅速减弱(如图所示)。2G，h)。MB49-Luci-C57BL/6J模型也存在类似的转移现象。注射3h后，MB49-Luci癌细胞在对照组小鼠肺内积聚，而YB1预处理小鼠的荧光素酶信号再次减弱(图一)。2I)。总之，这些数据表明转移级联的定植过程受到YB1治疗的影响，特别是对癌细胞的早期存活有影响。癌细胞仍能在肺内积聚，但未能在肺内建立转移。沙门氏菌治疗。
干扰素-γ是生活所必需的。沙门氏菌抑制肿瘤转移
在实验转移模型中，小鼠接种肿瘤细胞后，沙门氏菌已获批准(附图)。3A)，表示之间的直接交互作用。沙门氏菌癌细胞也不太可能。我们假设沙门氏菌-诱导的免疫反应负责阻断转移级联。与以前的研究一致14,23, 沙门氏菌治疗引起全身和肿瘤局部的促炎免疫反应。沙门氏菌肿瘤原位转移模型的治疗导致肿瘤中肿瘤坏死因子-α、IL-6和IL-1α水平升高(补充图1)。3B)。细菌脂多糖(lipopoly糖类)是一种经过广泛研究的能够诱导炎症反应的免疫原，可作为抑制肿瘤转移的媒介。沙门氏菌。然而，vpp 20009，一种减毒的msbb缺陷。[医]斑疹伤寒菌低脂多糖毒性菌株24，具有相当的抗转移能力。沙门氏菌YB1与脂多糖治疗沙门氏菌甚至促进肺转移(附图)。3C)。此外，与对照组(pbs，热杀)比较。沙门氏菌，非致病性大肠杆菌DH10B菌株)，仅活沙门氏菌YB1细胞能有效抑制肿瘤细胞的转移，并能诱导较强的细胞因子作用，如IL-6、IL-12p70、IL-1β、TNF-α、IL-18和IFN-γ等。3A，b)。类固醇药物泼尼松龙抑制炎症反应部分损害YB1的抗转移活性(图1)。3C)，证实了以下假设：沙门氏菌炎症反应在抑制肿瘤转移中起着重要作用。
图3：干扰素-γ依赖性炎症沙门氏菌YB1感染有助于抑制肿瘤转移。a量化(双尾未配对)t-pbs，yb 1，热杀yb 1，小鼠4t1肺转移试验，每组8例。大肠杆菌DH10B分别在第0天。4T1细胞于第13天静脉接种，第27天检测肺转移情况。观察BALB/c小鼠血清中细胞因子水平的动态变化。n=每组4人)(b)。集中注意力。c量化(双尾未配对)t用泼尼松龙抑制YB1所致炎症后4T1肺转移的实验研究(4T1-BALB/c)。n=6 PRED/YB1，n=5其他)。普雷德，强的松龙。d量化(双尾未配对)t抗体介导的肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ在4T1-BALB/c实验转移模型中耗竭后的4T1肺转移试验。nPBS和YB1/IgG=5；nYB1/抗TNF-α和YB 1/抗IFN-γ=6)。e跟踪和量化(双尾未配对)t用荧光素酶活酶成像法检测4T1-Luci细胞在腹腔注射后3h的变化。用PBS、YB1+同型IgG或YB1+IFN-γ耗竭抗体分别在BALB/c小鼠体内注射4T1-Luci。Balb/c小鼠预先用PBS或YB1预处理3天(n=每组5人)。fYB1对野生型C57BL/6J小鼠和干扰素-γ-基因敲除(IFN-γKO)小鼠的抗转移活性比较n=每组5只)。每组均显示有代表性的肺片、H&E染色的全肺和放大的H&E染色肺组织。红色箭头表示部分肿瘤组织。用pBS或YB1处理的IFN-γ基因敲除小鼠和野生型小鼠的肺内均发现大量MB 49瘤结节。g4T1肺转移瘤的定量研究(双尾未配对)t-试验)用重组干扰素-γ治疗后，与YB1或PBS治疗比较。本实验以4T1-BALB/c模型为基础。n=每组5人)。所有数据均以平均值±扫描电镜表示。所有展示的都是两个独立实验的一个代表性实验。源数据作为源数据文件提供。
其次，我们试图确定抑制YB1治疗后转移所需的免疫因子。在增加的全身促炎细胞因子中，肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ常被报道具有抗肿瘤活性。因此，我们推测它们可能在YB1的抗转移活性中发挥重要作用。我们用特异性中和抗体在体内耗尽肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ。有趣的是，缺乏干扰素-γ，而不是肿瘤坏死因子-α，完全消除了YB1的抗转移活性。三维空间)。接下来，我们在4T1-Luci建立的小鼠转移瘤模型中，用活体成像技术将IFN-γ耗尽.我们发现，干扰素-γ的缺失显着地降低了YB1对肺癌细胞转移的抑制作用(如图1所示)。3E)。为了证实干扰素-γ在介导yb_1抗转移活性中的作用，我们将mb_(49)细胞注射到γ基因敲除小鼠体内，建立了小鼠转移瘤模型。25野生型C57BL/6J小鼠。正如预期的那样，YB1只抑制野生型小鼠的癌细胞转移，而不抑制IFN-γ基因敲除小鼠的癌细胞转移，提示IFN-γ是YB1诱导的肿瘤转移抑制所必需的细胞因子。3F和补充图。3D，e)。然而，I.V.给野生型小鼠注射干扰素-γ未能减少实验性转移模型中的肺转移。第三代表明单用干扰素-γ并不足以抑制肿瘤的转移。YB1诱导的局部IFN-γ反应呈组织依赖性。在YB1治疗后的第5天，我们发现肿瘤组织中IFN-γ水平降低，而肺组织中IFN-水平升高(补充图5)。3F)。YB1诱导的IFN-γ在体内的时空动力学不可能被i.v所概括。注射，除了组织特异性水平的干扰素-γ还不可能与目前的技术.总之，这些结果表明，干扰素-γ是抗转移活性的必要因素之一。沙门氏菌YB1.
先天免疫沙门氏菌-抑制肿瘤转移
为了探讨免疫系统哪个分支对YB1治疗后的转移有抑制作用，我们首先对肿瘤浸润的T细胞进行了研究。有趣的是，我们发现在4T1原位转移模型中，YB1治疗后第1天和第5天肿瘤浸润T细胞水平显著下降，而肺组织T细胞水平没有改变(补充图1)。4A-C)。此外，脾脏CD4+和CD8+T细胞均明显减少(附图)。4D)和CD4+T细胞减少在肿瘤引流淋巴结(LNS；补充图.4E)。我们怀疑适应性免疫可能不是YB1诱导的抑制癌细胞转移的关键。因此，我们用免疫缺陷的NOD SCID(NOD.CB17-Prkdc)建立了原位转移模型和实验性转移模型。SCID/J)小鼠，没有产生功能B和T细胞26,27。与BALB/c小鼠的观察结果相似，YB1治疗明显抑制了肺转移，而在4T1-NOD SCID原位转移实验中，仅轻微延迟了原发肿瘤的生长。4A)。同样，在4T1-NOD SCID实验转移模型中也观察到明显的转移抑制作用。4B)。此外，NOD SCID小鼠经YB1预处理后，肺癌细胞在肺内的定植也受到了影响(图1)。4C)。总之，这些数据表明先天免疫系统足以沙门氏菌YB1诱导的肿瘤细胞转移抑制。
图4：先天免疫反应足以沙门氏菌YB1抑制肿瘤转移。a4T1原发肿瘤大小及相关肺转移的定量研究(双尾未配对)t-试验)经YB1处理后(n(4)4T1-NOD SCID原位转移模型。PBS作为对照治疗(n=5)。b量化(双尾未配对)tYB1治疗4T1-NOD SCID模型中4T1肺转移的实验研究(英文)nPBS组=4；n=6(YB1组)。c跟踪和量化(双尾未配对)t-腹腔注射后3h用荧光素酶活成像法检测4T1-Luci细胞。NOD SCID小鼠预注射PBS或YB1 3天前注射4T1-Luci(n=每组8只)。利用LiveImage4.0软件的感兴趣区域(ROI)工具测量了生物发光的表面强度。所有数据均以平均值±扫描电镜表示。所有展示的都是两个独立实验的一个代表性实验。源数据作为源数据文件提供。
大鼠肺中性粒细胞和NK细胞的IFN-γ依赖性蓄积沙门氏菌-NOD SCID小鼠
为了确定哪些细胞的先天免疫有助于抑制转移，我们检测了干扰素-γ-依赖性的天然免疫后的变化。沙门氏菌NOD SCID小鼠治疗。我们使用高维最先进的流式细胞仪平台Cytof来分析天然免疫细胞及其分泌的细胞因子。用PBS、YB1(YB1/IgG对照)和YB1+IFN-γ耗竭抗体(YB1/抗IFN-γ)分别从NOSCID小鼠肺中分离出免疫细胞(图1/抗IFN-γ)。5A)。监测体重变化(附图)。5A)。值得注意的是，与PBS组相比，YB1治疗后免疫细胞总数明显增加，而IFN-γ耗竭则减少了肺内免疫细胞的数量(补充图)。5B)。提示IFN-γ可能促进肺内免疫细胞的聚集.细胞TOF分析中使用的染色小组包括一系列广泛的表型标记和细胞因子，这些标记和细胞因子可以对天然免疫细胞的亚型进行详细分类，并对其活动状态进行表征(补充表)。1)。采用t-分布随机邻居嵌入(t-SNE)维数约简和特征图聚类分析方法，对肺浸润免疫细胞进行聚类分析，共鉴定出18种免疫细胞簇。
图5：干扰素-γ促进NODSCID小鼠肺环境中性粒细胞和NK细胞的积累。沙门氏菌YB1治疗。a小鼠治疗时间进行细胞TOF分析。NOD SCID小鼠分为PBS组、YB1组(YB1/IgG组)和YB1+IFN-γ耗竭抗体组(YB1/抗IFN-γ组)。第5天处死小鼠，分离肺浸润免疫细胞，制备细胞TOF分析。b每组小鼠具有代表性的t-SNE曲线。免疫细胞簇13，14，15和18由圆圈突出。c样本间每个肺组织中每个免疫细胞簇的百分比(n=每组4人)。d每个肺组织中每个免疫细胞簇的总细胞数(n=每组4人)。YB1组免疫细胞团群13、14、15和18较其他两组明显升高。c, d所有数据均以平均值±扫描电镜表示。e每个免疫细胞簇的特征。根据不同表型标记物和细胞因子的表达，将NOD SCID小鼠肺浸润免疫细胞的CytoF分析结果与三种方法进行融合，进行t-SNE降维和显影聚类分析，并将其分为18个免疫细胞簇。展示了所有面板两个独立实验的一个有代表性的实验。源数据作为源数据文件提供。
我们分析了所有样本的18个免疫细胞簇的特征(补充图)。5C)。图形5B显示每个组的有代表性的t-SNE配置文件。聚类分析将来自同一处理的样本聚类在一起，验证了t-SNE维数约简和酚图聚类分析(补充图)。5D)。为了比较三个处理组间18个免疫细胞簇的分布和丰度，我们总结了每组样本的百分比和总细胞数(图)。5C，d)。正如我们所怀疑的，干扰素依赖于γ的天然免疫改变沙门氏菌YB1治疗可促进肿瘤转移的抑制，主要集中在YB1诱导的转移抑制和干扰素-γ耗竭恢复的变化上。我们观察到YB1处理后，13、14、15和18团簇高度上调，但经IFN-γ耗竭后，对照组几乎恢复到正常水平。为了表征每个免疫细胞簇，我们收集了所有样本的细胞TOF数据，并分析了表面标记物和细胞因子在每个细胞簇中的表达水平(见图)。5E)。簇13、14和18为三种NK亚型(CD3−NKp 46+CD49b+)，15为中性粒细胞亚型(CD 45+CD11b+Ly6G)。高Ly6C低层)。NOD SCID小鼠肺组织中检测到5种NK细胞亚型(第2、13、14、16和18群)，其中NK细胞活性以前被认为明显降低。26。在5种NK亚型中，13、14和16被认为更活跃，因为CD 38和CD 44的高表达，表明免疫细胞的激活和迁移增强。28,29,30。此外，簇13是唯一产生干扰素-γ的NK细胞类型.鉴于分泌IL-10的中性粒细胞在黑色素瘤患者中具有免疫抑制活性。31中性粒细胞集落15的特征是产生高水平的IL-10，并低表达细胞活化标记CD 38，它可能是引起免疫应答的负调节因子。沙门氏菌对其抗转移作用几乎没有贡献。我们发现四种免疫细胞簇，包括三种NK亚型(13、14和18)和一种中性粒细胞亚型，可能与YB1的抗转移活性有关。
沙门氏菌-激发的NK细胞是抑制肿瘤转移所必需的。
为了证实中性粒细胞和NK细胞在抑制转移中的作用，我们用特异性抗体去除了中性粒细胞和NK细胞。每隔一天注射抗Ly6G抗体可消耗90%以上的外周中性粒细胞。32(补充图。6a，b)，但是沙门氏菌治疗仍能抑制转移，提示中性粒细胞不是参与YB1诱导的转移抑制的关键免疫细胞(附图)。6C)。如前所述，注射抗Asialo-gm1抗体可使BALb/c小鼠的NK细胞耗竭，但只需稍作修改。33,34。外周血CD3、−、NKp 46+细胞的缺失证实了NK细胞的耗竭效应。6a，b)。活NK细胞鉴定的门控策略和随后的相关检测在补充图中讨论。6d-f。与PBS组相比，NK细胞的减少消除了YB1对转移的抑制作用，甚至导致肺内转移结节增多(图1)。6C)。我们之前的研究表明，YB1可以诱导肺癌细胞的清除(图一)。2G-I)。在此，我们发现NK细胞的耗竭可以完全消除YB1诱导的效应(图一)。6d，e)。2011年报道了抗Asialo-gm1抗体的非靶标效应，主要关注的是嗜碱细胞也受到影响。35。嗜碱性细胞约占循环白细胞的0.4%。然后，我们检测了它们在免疫活性(BALB/c)和免疫缺陷(NOSCID和NSG)中的存在(NOD.Cg-Prkdc)。SCIDIL2RGTm1Wjl(/SzJ)小鼠。在YB1治疗后第6天，我们首先检测了BALB/c小鼠肺中嗜碱性粒细胞的百分比。与YB 1处理后NK细胞的变化相比，YB 1处理后嗜碱性细胞百分比无显着性差异(补充图)。7a，b)。此外，嗜碱性细胞只占肺内所有免疫细胞的0.2%左右(补充图)。7a，b)。我们进一步研究了NOD、SCID和NSG小鼠嗜碱细胞和NK细胞的存在。NOD SCID小鼠和NSG小鼠的嗜碱性细胞较少(<0.05%)，而NK细胞仅存在于BALB/c小鼠和NOD SCID(补充图)。7C-e)。结合我们的数据显示YB1能有效地抑制NOD SCID小鼠的转移(图一)。4)，我们可以得出结论，嗜碱细胞不太可能是介导肿瘤转移的关键免疫细胞。沙门氏菌YB1.此外，我们还检测了YB1在NSG小鼠体内的抗转移能力，以替代抗体介导的NK细胞耗竭。NOD SCID小鼠与IL2RG交叉产生NSG小鼠−/−小鼠，导致NK细胞、T细胞和B细胞完全缺乏，但有功能性中性粒细胞36。EGFP标记的4T1细胞(4T1-EGFP；5×10)4)是I.V.。在NSG小鼠体内注射，建立肺转移模型。与抗体耗竭结果相似，YB1未能明显抑制NSG小鼠的肺转移(附图)。7F)。总之，结果表明NK细胞，但不是中性粒细胞或嗜碱性细胞，是必不可少的。沙门氏菌YB1诱导的转移抑制。
图6：沙门氏菌YB1激发的NK细胞是肿瘤转移抑制的重要组成部分。a分别用PBS、YB1和YB1+NK细胞耗竭抗体治疗Balb/c小鼠。流式细胞仪检测NK细胞在第2、8、14天的耗竭率。4T1肿瘤细胞为i.v。在第4天植入。b三组在指定时间点外周血NK细胞百分比(n=每组3只)。第14天，PBS组样本不可用。c图片和量化(nPBS或YB1组=10；nYB1-NK耗竭组，2项独立实验的联合结果)：3组4T1肺转移灶。d, e腹腔注射后3h荧光素酶活体显像对4T1-Luci细胞的追踪和定量。用PBS、YB1或YB1+NK耗竭抗体预先给BALB/c小鼠注射4T1-Luci。n=每组5人)。fPbs或YB1预处理小鼠肺浸润NK细胞的t-SNE图谱覆盖于肺器官采收前5天(n=每组4人)。流程数据采集后，随机抽取每个样本中的6000个NK细胞，在Flowjo软件中进行t-SNE分析。PBS或YB1处理的小鼠NK细胞根据FSC(前向散射)、SSC(侧散射)和不同标记物(CD11b、CD11c、CD 38、NKG2D、NKp 46和CD 27)有两种不同的NK细胞亚型。g肺浸润NK细胞体外共培养5 h后产生IFN-γ的流式细胞术分析(英文)n=每组3人)。hYAC-1细胞体外共培养5h后肺浸润NK细胞CD107a表达的流式细胞术分析(英文)n=每组3人)。i肺浸润NK细胞对YAC-1靶细胞的杀伤作用n=3个生物复制体)。治疗5天后，分离小鼠肺浸润免疫细胞。所有数据均以平均值±扫描电镜表示。全P-数值是用双尾不成对的方法得出的。t-测试。显示两个独立实验的一个有代表性的实验，除了c。门控策略在补充图中讨论过。6d-f。源数据作为源数据文件提供。
在本研究中，我们将CD3-NKp 46+细胞定义为经典的NK细胞，而CD3-NKp 46+细胞也包括ILC1s，这是一种罕见的无细胞毒性的先天淋巴样细胞类型，能够产生干扰素-γ，并与经典的NK细胞在组织间有许多共同的标记物。37。除了细胞毒性外，Eomes的表达还可以用来区分NK细胞和ILC1s。38。然而，我们发现96%以上的LIN-NKp 46+细胞(包括CD3-NKp 46+细胞)是Eomes+，表明它们是经典的细胞毒性NK细胞。此外，LIN-NKp 46+Eomes−细胞(定义为ILC1s)没有显示出更高的产生干扰素-γ(补充图1)的能力。8A-c)。我们进一步检测了小鼠肺浸润CD3-NKp 46+免疫细胞中颗粒酶B和穿孔素的水平。沙门氏菌YB1和发现YB1处理的小鼠CD3-NKp 46+细胞中颗粒酶B和穿孔素水平显著升高(附图)。8D，e)。这些结果表明，YB1处理后的大多数CD3-NKp 46+细胞，如果不是全部的话，都是传统的细胞毒性NK细胞。虽然我们不能完全排除ILC1s在沙门氏菌-诱发转移抑制，目前的数据尚未为其提供有力的支持。用流式细胞仪检测小鼠肺浸润NK细胞的表型变化。沙门氏菌YB1治疗。分离经PBS或YB1处理的小鼠肺浸润NK细胞，并进行表面标记分析。我们进行了t-SNE分析，发现来自PBS和YB1两组的NK细胞形成了两个不同的群体(图一)。6f)。我们发现从YB1处理的小鼠中分离到的NK细胞体积较大(前向散射率较高)，SSC(侧散射)较高，CD 38和NKG2D的表达水平较高，提示NK细胞处于激活状态。YB1激活的NK细胞也有较高的CD11b和CD11c的表达水平，与CytoF在NOD SCID小鼠中鉴定的NK细胞簇13和14相一致。5C-E和6f)。其次，比较了PBS和YB1对小鼠NK细胞活性的影响。IFN-γ的产生和CD107a的表达被认为是评价NK细胞产生细胞因子和脱颗粒的功能指标。39。事实上，YB1处理的小鼠NK细胞产生更多的IFN-γ，并在体内表现出较高的CD107a表达(如图所示)。6g，h)。按上述方法，对分离的NK细胞对YAC-1癌细胞进行了细胞毒性试验。34。我们测定了3：1、2：1和1：1的效应/靶点比值，发现YB1处理的小鼠NK细胞对YAC-1有较高的细胞毒性(图一)。6I)，与YB1处理后颗粒酶B和穿孔素水平的升高相一致(附图)。8D，e)。结果表明，YB1刺激的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用较强，CD11b、CD11c、NKG2D和CD 38的表达水平高于PBS处理小鼠的NK细胞。
NK细胞和干扰素-γ是不可缺少的沙门氏菌-抑制肿瘤转移
我们发现YB1的抗转移活性同时需要IFN-γ和NK细胞。NK细胞沙门氏菌治疗产生大量的干扰素-γ，但干扰素-γ能否直接或间接作用于NK细胞尚不清楚。为了观察NK细胞对IFN-γ血清动力学的影响，我们用NK细胞耗竭抗体治疗小鼠，外周血CD3−NKp 46+细胞缺失证实了这一作用。7a，b)。在NK细胞耗竭后的指定时间点测定血清IFN-γ(见图).7A，c)。YB1处理后3h未检测到NK细胞耗竭抗体小鼠产生IFN-γ，而YB1治疗组未见NK细胞耗竭，提示NK细胞是YB1治疗后早期产生IFN-γ的主要原因。但在第2~4天，即使NK细胞仍未出现，IFN-γ浓度也逐渐升高，提示其他细胞在YB1治疗后后期产生IFN-γ(如图1所示)。7C)。NK耗尽后血浆TNF-α的动态变化与IFN-γ相当(补充图)。8F)。当4T1-Luci细胞为i.v时。在第4天注射建立肺转移，在没有NK细胞的情况下，YB1治疗不能消除肺内累积的癌细胞，即使有高水平的IFN-γ(见图)。7C-e)。这些结果表明，干扰素-γ通过NK细胞介导转移抑制，NK细胞是IFN-γ早期的主要来源。沙门氏菌YB1感染，但IFN-γ后可由其他免疫细胞产生.
图7：NK细胞和干扰素-γ是不可缺少的。沙门氏菌YB1抑制肿瘤转移。a将Balb/c小鼠分为3组，分别给予PBS、YB1和YB1+NK耗竭抗体治疗。n=每组4人)。b, cNK细胞耗竭效率(n=3只小鼠/组)和血浆干扰素-γ浓度(n第3、1、2、4、6天分别监测小鼠(每组4只)。d, e第4天早晨，4T1-Luci癌细胞出现。注射BALB/c小鼠并进行活体成像(n=每组4只)。数据归一化为YB1-NK耗竭组。f–i将Balb/c小鼠分为3组，分别给予PBS、YB1(YB1/IgG)或YB1+IFN-γ耗竭抗体(YB1/抗IFN-γ)治疗。所有小鼠于YB1或PBS治疗后第5天处死，肺浸润免疫细胞进行流式细胞分析。fNK细胞占肺内所有免疫细胞的百分比(n=每组7人)。g样本间每肺NK细胞的绝对总数(n=每组7人)。用台盼蓝拒染法测定总免疫细胞数，然后用流式细胞仪测定NK细胞百分率进行增殖，得出每个肺NK细胞的绝对值。h肺浸润NK细胞体外共培养5 h后产生IFN-γ的流式细胞分析(英文)n=5(PBS组)，nYB1/IgG组和YB1/抗IFN-γ组=4)。iYAC-1细胞体外共培养5h后肺浸润NK细胞CD107a表达的流式细胞术分析(英文)n=每组4只)。j肺浸润NK细胞对YAC-1靶细胞的杀伤作用n=3个生物复制体)。所有数据均以平均值±扫描电镜表示。全p-数值是用双尾不成对的方法得出的。t-测试。显示的是两个独立实验中的一个有代表性的实验，除了f, g(两个独立实验的综合结果)。源数据作为源数据文件提供。
最后，我们研究了干扰素-γ耗竭是否影响NK细胞的活化和细胞毒性.用YB1处理的BALB/c小鼠，在初始IFN-γ耗竭后5d分离出肺浸润NK细胞。干扰素-γ耗竭显着地减少了NK细胞在肺中的数量，无论是用NK细胞百分比来衡量，还是用细胞总数来衡量(如图所示)。7F，g)。体外刺激后产生IFN-γ的NK细胞也明显减少，说明在没有IFN-γ的情况下激活的NK细胞较少。7H)。IFN-γ耗竭后NK细胞脱颗粒标记CD107a的表达水平也下降到PBS组的水平(图1)。7I)。从缺乏干扰素的γ小鼠中分离到的NK细胞的细胞毒性一直在很大程度上降低，如YAC-1裂解实验所示(图1所示)。7J)。这些结果表明，干扰素-γ促进了NK细胞的蓄积、活化，特别是对NK细胞的杀伤作用。沙门氏菌YB1治疗。
总的来说，沙门氏菌YB1刺激可诱导NK细胞在感染早期大量分泌IFN-γ。然而，干扰素-γ也是由其他细胞在2天后产生的。沙门氏菌感染，这与以前的工作是一致的。40,41。反过来，全身性高水平的干扰素-γ促进NK细胞在肺中的积累和/或激活，我们的发现表明，干扰素-γ和NK细胞都是必需的。沙门氏菌-诱导抑制肿瘤转移。
