晚期NSCLC细胞图谱的建立
我们应用scRNA-seq分析了42例具有不同组织学和分子表型及治疗史的晚期非小细胞肺癌患者的活检标本(见图)。1A，补充表1)。经过多个质量控制和过滤步骤，共分析了90,406个细胞的转录。根据典型细胞特征标记物，检测出11种主要细胞类型，即癌细胞类型、除癌细胞外的上皮细胞、免疫细胞类型(T细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、中性粒细胞、肥大细胞和滤泡树突状细胞)和基质细胞类型(成纤维细胞和内皮细胞)。1B，c还有无花果。斯1)。与以前的研究相似，不同患者的间质细胞和免疫细胞按细胞类型聚集在一起，而癌细胞表现出更高的异质性和患者特异性的表达特征(图一)。1D)14,15。类似于以前研究的观察结果8,12，肿瘤、基质细胞和免疫细胞的部分在样本间差异很大，这可能是不同的肿瘤表型所固有的，也可能与进行活检的肿瘤内的部位有关(图一)。1E和补充数据1)。例如，P42(肺腺癌合并肉瘤样癌)和P7表现出强烈的炎症微环境，几乎有50%的T细胞，而P2、P3和P17的T细胞几乎耗尽。
图1：晚期非小细胞肺癌单细胞图谱。a图示42例患者的基线信息，包括亚型、分期、突变状态和吸烟史。b42例患者90,406个细胞的UMAP图，按其11种主要细胞类型着色。c11个主要细胞型典型细胞型标记的热图。d所有细胞的UMAP图，由病人着色。e每个病人的主要细胞类型组成。活检都是从原发性肺肿瘤中提取的。源数据作为源数据文件提供。
肺鳞癌与肺腺癌相比具有更高的瘤间异质性和癌内异质性。
根据常用基因的单细胞表达水平进行免疫组织化学的非小细胞肺癌分类，即NAPSA、专题信托基金-1(Nkx 2-1)肺腺癌(LUAD)，以及TP 63、CK5(Krt 5)对于肺鳞状细胞癌(LUSC)，亚型分类与组织病理学分类一致(如图所示)。斯2)。接下来，我们使用scRNA-seq数据推断癌细胞群体中的拷贝数改变(CNA).42例患者的CNA图谱显示患者间和病人内部的异质性(图1)。2A)。对于LUAD患者，7号和8q染色体存在明显的臂位插入，10号染色体缺失。值得注意的是，已知驱动突变的LUAD在1q和5p臂上有额外的扩增。相反，LUSC患者大多有3Q插入和5q缺失。有趣的是，一些没有司机突变的LUAD患者与LUSC有相似的CNA图谱。虽然癌细胞转录体的表达谱和组成主要是患者特有的，但一些患者的癌细胞比其他患者更相似(图1)。2B还有无花果。斯3A，B)。在大多数情况下，LUAD和LUSC患者的癌细胞被分成不同的簇。超过一半的LUAD患者聚集成一组，而大多数LUSC肿瘤形成患者特异性簇，表明LUSC的肿瘤间差异高于LUAD。大多数患者，特别是LUAD患者，如P16、P20和P32具有优势克隆，而在少数LUSC(如P27和P37)中，恶性细胞分布于多个簇(图1)。2B还有无花果。斯3C)。LUSC患者的克隆性明显高于LUAD患者(图1)。斯三维空间).
图2：肿瘤细胞间和瘤内异质性。a从患者肿瘤细胞的scRNA-seq推断CNA谱的热图。红色表示基因组扩增，蓝色表示基因组缺失。这个x-轴以数字顺序显示所有染色体。这个y-轴由两个亚组标记。b热图显示癌症集群中每个病人癌细胞的比例。在Seurat中，利用分辨率为0.4的分辨率生成癌细胞的聚类结果。病人的安排y-轴基于它们的相似性，采用层次聚类。c肿瘤细胞簇的UMAP可视化。中所示的群集ID对应于b. dITH相关性CNA和ITH盖克斯42名病人。阴影区域对应于用双边分析的0.95置信区间t-测试。eITH统计检验CNA和ITH盖克斯在不同组患者之间，LUSCn、LUADM和LUADn(LUSCn：n=16，LUADn：n=6，LUADM：n=12个生物独立样本。*p≤0.05；ns：p>0.05)。采用双面非配对Wilcoxon检验，比较各组间的差异。盒形图的下铰链、中线和上Hinger表示分布的第一、第二和第三四分位数。上下晶须对应于1.5四分位数范围内最大和最小的数据点。所有实际数据值也被绘制成与方框图一起的点。
为了量化瘤内异质性，我们定义了基于cna的和基于表达的肿瘤内异质性评分，表示为ith。CNA和ITH盖克斯(其定义见方法)。我们观察到肿瘤内不同程度的异质性。斯4A，B)。艾斯CNA和ITH盖克斯呈中等相关性(图一)。二维空间)，可能是由于非驱动基因的改变或微环境形成的肿瘤表型。根据肿瘤类型和突变情况，我们进一步将患者分为三组：LUAD患者伴驱动突变(n=12)，表示为LUADm，LUAD患者无司机突变(n=6)，表示为LUADn和LUSC患者，没有司机突变(n=16)，表示为LUSCn。有趣的是，LUSCn患者ITH显著升高。CNA与LUADm患者比较，ITH无统计学意义。盖克斯(无花果)2E)。这一发现还表明，司机突变的患者可能会受到基因变异以外的表型影响。将这一队列与公共数据中的队列进行比较，发现ITH有所增加。盖克斯晚期患者12(无花果)S4C).
肺上皮细胞的可塑性及其向恶性肿瘤细胞的发育轨迹
所有已鉴定的肺泡细胞均表达标准标记(CLDN 18, SFTPA 1, SFTPC)不表达肺泡1型细胞标记的肺泡型2型细胞(AT2)。CAV 1, 老总)。进一步的聚类分析揭示了AT2细胞的两个不同的簇，分别表示为AT2-1和AT2-2。3A)。AT2-2类似于一个正常的at2表型，具有共同的at2标记。SFTPA和运输机ABCA 3被放大(图1.3B)。相反，at2-1表达细胞增殖和细胞迁移相关基因，如CEACAM 6, KITLG，和FOXC 1意味着恶性的表型改变。上皮细胞可进一步分离成纤毛上皮细胞、俱乐部细胞和基底细胞。3C，d).
图3：肺上皮细胞的表型及其向癌细胞的演化轨迹。a肺泡细胞的UMAP投射。肺泡细胞可进一步分为两组，即AT2细胞。他们被命名为AT2-1和AT2-2。bAT2-1和AT2-2细胞差异表达基因的火山图谱。两组细胞表达率的差异与平均表达的对数倍变化相对应。cUMAP显示上皮细胞亚型。上皮细胞可进一步注释为基底细胞、俱乐部细胞和纤毛细胞。d肺上皮亚型典型标记基因热图。eAT2细胞、俱乐部细胞和LUAD肿瘤细胞的发育轨迹。每种类型的正常细胞作为一个整体显示，每个病人的癌细胞分别显示。f基底细胞、俱乐部细胞和LUSC肿瘤细胞的发育轨迹。
以前的研究表明，AT2细胞和俱乐部细胞都能发育成LUAD细胞，而基底细胞和俱乐部细胞是LUSC的潜在祖细胞。16,17。因此，我们根据AT2细胞、俱乐部细胞和LUAD癌细胞的发育轨迹来组织它们(如图所示)。3E)。推测的假时程显示AT2细胞和俱乐部细胞独立地转化为LUAD肿瘤。相反，基底细胞似乎是俱乐部细胞和LUSC肿瘤细胞之间的过渡状态。3F)。除了这些明显的特征外，我们还发现一些患者的肿瘤细胞紧密聚集在分支的末端，这意味着肿瘤细胞具有同质和终末的表型，而另一些患者的肿瘤细胞则在肿瘤的发展轨迹上具有更多的多样性和异质性。
晚期非小细胞肺癌TME显示了丰富的基质和免疫成分。
为了进一步识别每种基质细胞和免疫细胞类型的亚组，我们对它们进行了聚类和注释。我们鉴定了内皮细胞(EC)的五种亚型，包括淋巴、静脉和动脉内皮细胞(LEC、VECs和AECs)、TIP细胞和富含干扰素诱导基因的EC簇。斯5和补充数据2)。此外，我们将成纤维细胞分为周细胞和成纤维细胞，包括6个成纤维细胞亚组。斯6和补充数据3)。对于免疫细胞，我们的数据显示了两个B细胞亚群和七个不同的血浆细胞(图一)。斯7)。髓系细胞，特别是巨噬细胞，具有广泛的表型，可分为10个不同的组(图1)。斯8)。树突状细胞(DC)包括浆细胞样树突状细胞(PDC)、常规的1型和2型树突状细胞(cDC 1和cDC 2)和成熟DC。中性粒细胞有两个不同的簇，表达潜在的多形核髓源性抑制细胞(pmn-mdscs)相关基因，如LOX-1(OLR 1)在不同程度上(如图所示。斯9).
T细胞未发现Th17样细胞及其与Tregs相互转化的详细分析
在肿瘤浸润性T细胞中，根据CD4+T细胞、CD4+Tregs、CD4+T辅助17样T细胞(Th17样)、CD8+效应T细胞、CD8+耗竭T细胞和自然杀伤细胞(NK)的表达，我们对其进行了鉴定。4A)。在前人研究的T细胞亚型表达谱的基础上，通过监督细胞类型标注确定了T细胞亚型。9(无花果)4A)。进一步确定两个NK集群的特性(CD3D−，KLRD 1+, NKG 7)，我们指的是CD 16+(FCGR3A)以NK-1和CD 16−为NK-2。4B)。NK-1含有编码Fractalkine受体的上调转录本(CX3CR1)和成纤维细胞生长因子结合蛋白2(FGFBP 2)，均参与淋巴细胞的细胞毒性功能。NK-2具有较高的CD49a等组织内标记物的表达。ITGA 1)、CD 103(ITGAE)，以及ZNF 683。共抑制性免疫检查点包括CTLA 4和TIGITCD4+Tregs和CD8+耗竭T细胞富集。4C)。然而，LAG 3主要表达于CD8+精疲力竭的T细胞，这与以前的发现是一致的9.
图4：T细胞的亚型和发育轨迹。aUMAP显示6种T细胞亚型和2种NK细胞亚型(左)，用Singler(右)预测T细胞亚型。b2个NK细胞群选择标记的热图。cT亚型标记和功能基因的热图。dSling其一预测的CD4 T细胞之间的过渡关系。彩虹的颜色从红色到蓝色代表着轨迹的开始和结束。e图示CD4 T细胞分化途径，由Monocle推断，以及每种CD4 T亚型在发育过程中的相对位置。红蓝箭头表示细胞发育的两个伪时间方向。灰色部分代表分支点之前轨迹的开始。f热图显示CD4 T细胞典型标记沿推断轨迹的相对表达。红、蓝枝对应于中国的两个发展方向。e.
然后我们对CD4进行弹道分析。+T细胞在TME中的发育途径18和Monocle19。弹弓显示Tregs和Th17样细胞之间存在一种过渡关系，起源于幼稚细胞(图1)。4D)。由Monocle发现，天真的细胞分化为两个主要分支，Tregs和一个增殖的群体(图)。4E，f)。有趣的是，Th17样细胞，被它们的主转录因子的表达所证实。RORC，表现为一种从幼稚细胞到Tregs的发育途径的过渡性表型(如图所示)。4F)。CD4+以基因高表达为标志的Th17样群体KLRB120据我们所知，在非小细胞肺癌肿瘤环境中发现的Th17样细胞的第一次报告是用scRNA-seq。得到文学的支持21，天然Tregs(NTregs)是Tregs的一个子集，被认为与Th17样细胞相互转化。这个结果揭示了tregs和Th17样细胞之间复杂而微妙的相互作用，并强调了它们在对肿瘤抗原的适应性免疫反应中的重要性。22.
非小细胞肺癌亚型和ITH都形成了TME的免疫景观。
为了研究肿瘤亚型及其ITH水平是否影响其微环境，我们通过组织学和驱动突变状态比较了非小细胞肺癌的细胞型组成。我们发现在所有LUAD患者中，中性粒细胞明显减少(如图所示)。5A)。在比较LUAD患者有和不存在致癌基因突变时，巨噬细胞群高表达。CCL 13在突变肿瘤组中富集(图1)。5B)。组织内巨噬细胞簇表达清道夫受体的比例马可和CXCL 5，CDCs在三组间也有显着性差异(图一)。5B)。有趣的是，cdc 2显示了Langerin(CD 207)表达式，它被推断为受环境支配。23。TCGA生存分析表明：CD 207是LUAD的预后指标，而不是LUSC的预后指标(图)。5C)。然而，马可与LUSC和LUAD的临床结果无关。因为我们确定了马可+肺泡巨噬细胞，这些结果共同提示了组织驻留髓系细胞的多功能作用。接下来我们研究了ITH评分与免疫细胞组成的相关性。我们发现中性粒细胞和两种类型的巨噬细胞与ITH呈正相关。盖克斯，血浆细胞与ITH呈负相关。盖克斯(无花果)5D)。这一发现提示高ITH患者具有较高的免疫抑制环境和较低的肿瘤杀伤能力。盖克斯。总之，我们发现髓系室主要受肿瘤亚型和ITH水平的影响，而不是肿瘤浸润的淋巴细胞。
图5：细胞组成、肿瘤亚型和ITH的相关分析。患者群体间细胞类型的细胞组成分析a中性粒细胞和b巨噬细胞亚型采用双面不成对的Wilcoxon检验，比较各组间的差异。a和b(LUSCn：n=16，LUADn：n=6，LUADM：n=12a和b. **p≤0.01；*p≤0.05；ns：p>0.05)。盒形图的下铰链、中线和上Hinger表示分布的第一、第二和第三四分位数。上下晶须对应于1.5四分位数范围内最大和最小的数据点。所有实际数据值也被绘制成与方框图一起的点。c组织内巨噬细胞标记物的存活分析(英文)马可和CD 207)LUAD和LUSC。dITH之间的相关分析盖克斯以及病人的细胞组成。仅显示明显相关的细胞类型。肿瘤亚型(LUAD、LUSC和NSCLC)以不同的颜色显示，p-数值是由双方获得的。t-测试(LUAD)：n=18，LUSC：n=22，NSCLC：n=2)。
在LUADn、LUADm和LUSC之间观察到发散的细胞间网络
为了探讨肿瘤微环境中细胞类型之间的相互作用，我们进行了细胞-细胞相互作用分析，发现肿瘤细胞与内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞之间存在显著的相互作用。6A)。对细胞间相互作用分子的分析表明，EGFR、Notch、WNT等致癌通路与PDGF和炎症信号通路相互作用，尤其是影响TNF-α和趋化因子反应通路(图1)。6B)。值得注意的是，VEGFA介导的蛋白-蛋白质相互作用和两个类似的免疫检查点途径CD 226-TIGIT-CD 96和CD 274(PD-L1)-CTLA4-CD 28也在相互作用网络中被发现。
图6：细胞与基因相互作用网络。aNSCLC患者细胞类型间的细胞相互作用网络。线宽和颜色与细胞类型间的相互作用数成正比。b相互作用的分子网络。在每个连接网络中，节点(基因)大小与每个节点的相邻(相互作用的基因)数目成正比。热图显示LUADm、LUADn和LUSCn组中所选单元格类型的选定交互对。Z-积分的表达水平以颜色表示，点大小显示在给定的配体-受体对中有显著相互作用的患者比例。c肿瘤细胞、T细胞和DC之间的趋化因子和趋化因子受体。d肿瘤细胞与基质细胞间的特定生长因子。e癌细胞、巨噬细胞和T细胞之间的特定检查点。
癌细胞表达高水平的配体CXCL 1, CXCL 2, CXCL 3，以及CXCL 8，向受体发送信号。CXCR 1和CXCR 2由中性粒细胞表达。6C)。一些LUSCn和LUADn患者显示DC与T细胞(包括CXCR 3及其合作伙伴)之间的相互作用增加，表明T细胞贩运和招募具有强大的效应。24。我们还证实了CXCL12-CXCR 4通路在肿瘤和发芽内皮细胞(AECs和TIP细胞)之间的激活，如图所示。斯5。关于生长因子，大多数肿瘤，无论是亚型，都有非常强烈的信号，VEGF相互作用之间的肿瘤和各种类型的内皮细胞(图一)。6d)。另一方面，PDGF信号在肿瘤细胞和癌相关成纤维细胞(CAF)之间被激活.对于LUSC患者来说，一个独特的模式是在基质细胞和肿瘤细胞之间激活FGF通路，这也得到了先前的研究的支持。25。由于只有一部分LUSC患者激活了FGF通路，患者分层可能对靶向FGF通路的药物的使用很重要。
对于患者的免疫环境，我们发现巨噬细胞，而不是癌细胞，在通过检查点途径抑制T细胞功能方面起主要作用(图1)。6E)。不同的亚类群表现出不同的优势途径。例如，LUADm具有较高的TIGIT通路激活水平，而TIM3的激活水平较低(HAVCR 2)通路。除了少数LUSC患者外，我们没有检测到PD1/PD-L1轴的任何明显激活，这可能是由于PD1/PD-L1在转录水平上的低表达所致。在公共数据集上进行的交互分析证实了晚期LUAD检查点通路的类似激活状态(图)。斯10A)。有趣的是，同一数据集中的早期LUAD患者显示了相反的激活状态。TIGIT与晚期患者有关的TIM3(如图所示)。斯10b)。然而，通过对scRNA-seq数据的细胞网络分析，我们对患者的TME进行了全面的观察，包括血管生成、CAF激活、免疫抑制细胞的募集、T细胞活化以及检查点通路的详细激活。治疗相关的相互作用是异质的，即使在同一亚型肺癌，突出了需要更精确的生物标记物，以提高药物的有效性。
