安布拉1缺乏症促进黑色素瘤的发展BRAF V600E/+ ；Pten −/−小鼠
评估.的作用安布拉1在……里面BRAF/PTEN-驱动性黑色素瘤，安布拉1浮标/浮标小鼠16与携带BRAFV600E突变和PTEN删除(BRAFV600E/+；Pten浮标/浮标)15，一种诱导小鼠100%外显黑色素瘤的遗传组合17,18。在这种基因工程小鼠模型(GEMM)中，黑素细胞特异性cre重组由酪氨酸酶启动子(Tyr：：CreerT2/+)，仅在4-羟基他莫昔芬(4-OHT)给药时发生.三周大Tyr：：CreerT2/+BRAFV600E/+；Pten−/−安布拉1+/+ (双酚A+/+), Tyr：：CreerT2/+BRAFV600E/+；Pten−/−安布拉1+/− (双酚A+/−)和Tyr：：CreerT2/+BRAFV600E/+；Pten−/−安布拉1−/− (双酚A−/−用4-OHT局部治疗小鼠下背部皮肤，以诱发黑色素瘤(补充图)。1A和2A)。值得注意的是，双酚A−/−小鼠出现更大的肿瘤(见图)。1A，b)具有较高的增长率(如图所示)。1C)超过双酚A+/+老鼠。中位生存期双酚A−/−小鼠也从56天显著减少到42天(见图)。1D)。然而，这些肿瘤的形态与粘液样，S 100没有差别。+和色素细胞(附图)。2B，c)。值得注意的是，我们观察到安布拉1剂量依赖性影响黑色素瘤的发展，如肿瘤生长和中位生存期安布拉1杂合子(双酚A+/−)小鼠(图1.1A、c、d)。尽管如此，安布拉1结果产生了更大的影响，双酚A+/−肿瘤被排除在进一步的分析之外。
图1：安布拉1缺失促进黑色素瘤的发展BRAFV600E/+；Pten−/−老鼠。a肿瘤的代表性图片双酚A+/+, 双酚A+/−和双酚A−/−小鼠治疗后32d。b重量双酚A+/+ (n=12)和双酚A−/−(n=10)终点肿瘤(42天)(**)p=0.0053，双尾未配对t-测试，双酚A−/−诉BPA+/+). c肿瘤生长动力学双酚A+/+ (n=12)，双酚A+/− (n=10)和双酚A−/− (n=10)老鼠。每个数据点对应于每个实验组的平均肿瘤体积±扫描电镜。*p=0.0128；*p=0.001，单因素方差分析)。d卡普兰-梅耶整体生存曲线双酚A+/+ (n=11)，双酚A+/− (n=8)和双酚A−/− (n=8)小鼠(p < 0.0001双面对数等级测试，双酚A−/−V.V.双酚A+/+)和e小鼠皮下注射2×106 双酚A+/+- (SbpA+/+; n=16)或双酚A−/−- (SbpA−/−; n16)肿瘤源性细胞。对肿瘤的出现进行了60天的监测(p < 0.0001双面对数等级测试，SbpA−/−V.V.SbpA+/+). f皮肤增生症(黑色箭头)和色素沉着区巴+/+ (n=9)和巴−/− (n=7)老鼠g量化。每个数据点代表一只鼠标，对应于色素区的平均百分比±扫描电镜(每个鼠标至少分析了四个区域)：**p=0.0033，双尾未配对t-测试，巴−/−VS。巴+/+). h年皮肤切片中Ki 67免疫染色(红色)的代表图像巴+/+ (n=7)和巴−/− (n=7)小鼠。原子核以蓝色(Hoechst)表示。白色箭头表示发球。i中所示信号的量化h。每个数据点代表一个鼠标，对应于Ki 67的平均比±SEM。+细胞核上的细胞计数(每只老鼠至少分析三个字段)(**p=0.006，双尾未配对t-测试，巴−/−V.V.巴+/+)。图中显示的盒子和胡须情节b, g, i)表示从最小到最大的值。顶部和底部晶须表示上部(Q)3)和更低(Q)1)四分位数。方框指四分位数范围。中间线表示为框中的水平线。
此外，在同基因小鼠模型中证实了更快的生长动力学，在该模型中，小鼠皮下注射两种不同数量的细胞。双酚A+/+ (SbpA+/+)和双酚A−/− (SbpA−/−)肿瘤，随访60天。1E)和120天(补充图。二维空间)。在这个时间框架内，87.5%和80%SbpA−/−小鼠分别发生肿瘤，而未见肿瘤。SbpA+/+老鼠。
测试是否损失了.安布拉1足以导致黑色素瘤的形成BRAFV600E-突变的黑素细胞18, Tyr：：CreerT2/+BRAFV600E/+安布拉1+/+ (巴+/+)和Tyr：：CreerT2/+BRAFV600E/+安布拉1−/− (巴−/−)小鼠出生后第1、3、5天在背侧皮肤上注射4-OHT(补充图)。1B)。4-OHT诱导后13周，皮肤切片巴−/−在高放大率下，小鼠的色素沉着(黑素细胞痣)和增生性区域明显增加(如图所示)。1F，g)。这些表型与Ki 67免疫染色显著增加有关，表明巴−/−黑素细胞增殖巴+/+对应方(图1.1H，I)。基67+细胞主要位于巴−/−皮肤切片，而Ki 67阳性率主要见于巴+/+小鼠(附图)2E)。通过与PP2A的相互作用考虑Ambra1在c-Myc降解中的作用11及其新发现的调节Cyclin D1稳定性的调控细胞周期进展的功能12，我们试图调查是否观察到BRAF-突变的黑色素细胞安布拉1可能与c-Myc和Cyclin D1的调控有关。有趣的是，安布拉1-缺乏症痣中Cyclin D1水平显著升高，磷酸化c-Myc(p-c-Myc-S62)略有上调(附图)。2F-h). 巴+/+和巴−/−观察小鼠长时间(高达350天)监测黑色素瘤的发病情况。肿瘤外显率低巴−/−小鼠(12.5%)(附图)。2K，补充表1)，没有发现肿瘤。巴+/+小鼠(补充表)1).
这些结果表明安布拉1缺乏症促进黑色素瘤生长BRAFV600E/+;PTEN−/−遗传背景。同时，它还会影响色素沉着，引起皮肤增生。BRAFV600E单独突变。
安布拉1缺乏症影响细胞增殖BRAF V600E/+ ；Pten −/−小鼠
尽管有更快的生长动力学安布拉1-缺乏肿瘤，增殖率双酚A−/−在最终终点(即42天后，达到最大耐受性肿瘤大小)分析的小鼠略有下降，但明显减少(图一)。2A，b)。Ki 67的相对数量+细胞安布拉1-与其相比，缺陷性肿瘤确实减少了野生型在同一时间点(42天)的对应方(如图所示)。2A，b)。为了评估这种表面上减少的细胞增殖是否是由于细胞死亡增加所致，我们对凋亡标记物casp3进行了TUNEL和WB分析。双酚A+/+和双酚A−/−肿瘤切片和提取物。两种基因型间无显着性差异(附图)。2L，m)，但总核数目较少的情况除外。双酚A−/−肿瘤(附图)2N)，这与细胞增殖率的降低是一致的。然而，当Ki 67分析是在双酚A+/+和双酚A−/−在肿瘤出现后(≤2mm)或肿瘤达到最大允许大小(≥4mm)时，相同大小的肿瘤(如Breslow厚度)，两组之间无明显差异(图2)。2C，d)，建议双酚A+/+和双酚A−/−肿瘤实际上有相似的增殖率。然而，值得注意的是，在基因型上，大肿瘤(即≥4mm)的总体增殖率低于小肿瘤(≤2mm)(图2)。2C，d)。这些结果清楚地表明，增殖的黑色素瘤细胞的数量并没有改变，如果按肿瘤的大小。因此，更大的体积双酚A−/−肿瘤(如图所示)。1C)只能归因于损失的损失所赋予的增殖优势。安布拉1，这使它们能够在较短的时间内达到最大尺寸。为了支持这一假设，我们观察到双酚A−/−肿瘤显示c-Myc磷酸化和Cyclin D1水平增加(如图所示)。2e-g)。这一补充证据与其他地方提供的结果一致。11,12，并表明.的损失安布拉1可能通过促进细胞增殖来促进黑色素瘤的生长。
图2：细胞增殖安布拉1删除。aKi 67在FFPE肿瘤切片上的代表性IHC染色双酚A+/+ (n=7)和双酚A−/− (n=7)小鼠。bKi 67的量化+细胞显示在a。每个数据点代表一个鼠标，对应于Ki 67的平均比±SEM。+细胞核计数上的细胞(每只老鼠至少分析三节)(*p=0.0262，双尾未配对t-测试，双酚A−/−V.V.双酚A+/+). cBreslow≤2mm组织中Ki 67的典型染色(平均=1.79±0.28mm)；双酚A+/+ n=3，双酚A−/− n≥4mm(平均=4.24±0.69mm)；双酚A+/+ n=7，双酚A−/− n=7)。dKi 67的量化+细胞显示在c。每个数据点代表一个鼠标，对应于Ki 67的平均比±SEM。+每只小鼠细胞核上的细胞数(**p=0.0045双酚A+/+≥4 mm V.双酚A+/+≤2 mm；**p=0.0015双酚A−/−≥4 mm V.双酚A−/−≤2毫米，双向变异)。e年Cyclin D1的代表性WB分析与定量(盒图)双酚A+/+ (n=4)和双酚A−/−(n(4)块状肿瘤裂解物。微管蛋白用作装载控制(*p < 0.0001, two-tailed unpaired t-测试，双酚A−/−V.V.双酚A+/+). fFPE肿瘤切片中Cyclin D1和p-c-Myc-S62的代表IHC染色双酚A+/+ (n=6)和双酚A−/− (n=6)小鼠。g中所示Cyclin D1和p-c-Myc-S62信号的定量f (*p=0.0117；*p=0.0002，双尾未配对t-测试，双酚A−/−VS。双酚A+/+)。图中显示的盒子和胡须情节b, e, g表示从最小到最大的值。顶部和底部晶须表示上部(Q)3)和更低(Q)1)四分位数。方框指四分位数范围。中间线表示为框中的水平线。
安布拉1缺乏症促进了一种侵袭性表型的形成。BRAF V600E/+;PTEN −/−小鼠
接下来，进一步了解受安布拉1缺乏症，我们进行了RNA测序双酚A+/+和双酚A−/−肿瘤在42天的终点。基因本体论分析表明，细胞外基质组织(ECM)、整合素信号转导、神经系统发育和粘着斑基因等多种过程均显著上调。双酚A−/−肿瘤，由各种本体论库(p < 0.01) (Fig. 3A；补充图。3A-d和补充数据1)。基因集富集分析(GSEA)也显示了与侵袭性相关的基因集的丰富(Verfaillie等人的侵袭性黑色素瘤信号)。19组织(GO：0030198)，上皮间充质转化(Emt)(hallmark基因集)和灶性粘连组装(go：0005925)。双酚A−/−黑色素瘤3B)。在这些发现的推动下，我们评估了双酚A+/+和双酚A−/−肿瘤切片用Pmicrosirius Red(PR)染色。一般情况下，肿瘤主要表现为胶原纤维汇合较厚的区域，类似于正常的网状真皮，厚厚的胶原纤维被细纤维间质分离和分离的区域，以及仅有细纤维间质的区域。组织病理学分析显示双酚A−/−黑色素瘤有一个占主导地位的细纤维间质，而双酚A+/+肿瘤更多的表现为更长更厚的胶原纤维(如图所示)。3C，d)。Rna seq分析显示，包括ECM降解蛋白酶在内的ECM相关基因也有上调作用。双酚A−/−黑色素瘤3E)，通过定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)进一步验证所选择的基因(补充图)。4A)。值得注意的是，明胶检测显示人SK-Mel-5黑色素瘤细胞对AMBRA 1(SiAMBRA 1)与对照相比，其降解明胶基质的能力更强。西斯克尔)细胞(图1.3F)，从而强调AMBRA 1缺失对黑色素瘤细胞侵袭和迁移能力的可能影响。为了进一步解决这方面的问题，我们进行了伤口愈合和跨井迁移试验，这两种方法都是在体内进行的，即从体外分离出的黑色素瘤细胞。双酚A+/+和双酚A−/−小鼠(Bdmc)+/+和Bdmc−/−分别)(附图。4B，c)，以及体外,也就是说，在人黑色素瘤细胞株上SiAMBRA 1-介导的击倒(图1.3G，h和补充图。4D-g)。在所有不同的环境组合中，我们观察到AMBRA 1缺乏引起更快的伤口关闭动力学和增加迁移能力。侵袭能力的增加也与EMT基因的表达增加有关(例如，CdH 2, FN1, 维姆, Snai 1)，如RT-qPCR和WB分析显示的体积肿瘤(图)。3i，j；补充图。4H)、Bdmc+/+和Bdmc−/−细胞(附图)4I)和SiAMBRA 1人黑色素瘤SK-MEL-5(图5)。3K，l和补充图。4J)，MeWo和SK-Mel-2细胞(附图)。4K-m).
图3：安布拉1缺失引起的侵袭性表型BRAFV600E/+；Pten−/−老鼠。
a提升过程(p < 0.01) and b谷胱甘肽其他，标准化富集评分；FDR，错误发现率)双酚A−/− (n=3)；双酚A+/+ (n(3)肿瘤。c有代表性的图像和d组织病理学评价小天狼星红染色双酚A+/+ (N)=6)和双酚A−/− (n(6)肿瘤。e部分ECM相关基因在肿瘤中的差异表达(英文)n=每组3人，FC>2，帕迪 < 0.05.) fAMBRA 1-沉默SK-Mel-5细胞中明胶降解的研究。F-肌动蛋白和细胞核用Phalloidin和Hoechst染色。图像是有代表性的。每个点表示每个字段的平均计数±sd(n=3；**p=0.0022；*p < 0.0001, one-way ANOVA). gAMBRA 1的伤口闭合区-沉默的SK-Mel-5。定量显示为百分比±SD比。T0在指定的时间。白色和黄色线条轮廓伤口边缘T0在指定的时间。图片具有代表性(n=4；**p=0.0021 6 h；*p=0.026 9h；*p < 0.0001 12 h, 18 h and 24 h, SiAMBRA 1#1V.V.西斯克尔. n=3；°p=0.0234 6 h；°°p < 0.0001 9 h, 12 h, 18 h and 24 h, SiAMBRA 1#2VS。西斯克尔、双向方差分析(ANOVA)。hAMBRA 1-沉默SK-Mel-5细胞迁移计数。数据表示为平均值±SD，图像代表(n=3；*p=0.0289SiAMBRA 1#1VS。西斯克尔, *p=0.0454SiAMBRA 1#2V.V.西斯克尔、单向方差分析)。世行f–h表示沉默的效率。iRt-qPCR分析Cdh 1, CdH 2, 泽布-1, Snai 1, 维姆, Fn1和CTNNB 1在……里面双酚A−/− (n=4–8)和双酚A+/+ (n=4-8)。数据归一化为L34表示为折叠变化(*p=0.0158Chd1；*p=0.0417CHD 2；**p=0.0096Zeb-1；*p=0.0006Snai 1；*p=0.0239VIM；*p=0.0458Fn1，双尾未配对t-测试，双酚A−/−V.V.双酚A+/+). j大体积肿瘤中Cdh 1、Cdh 2、-catenin、Vimentin和Snai 1的WB分析(n=每组3人)。kRt-qPCR分析CdH 2, FN1, 维姆和Snai 1 inAMBRA 1-静音SK-Mel-5。数据归一化为L34表示为折叠变化±sd(n=4；**p=0.0045CdH 2; **p=0.0022FN1; *p=0.0353维姆; *p=0.0005Snai 1，双尾未配对t-测试，SiAMBRA 1V.V.西斯克尔、虚线)。l代表(n(4)WB分析AMBRA 1-沉默的SK-Mel-5中Cdh 1、Cdh 2、-catenin、vim和SNAI 1。盒子和胡须情节f, i表示最小到最大值。顶部和底部晶须表示上部(Q)3)和更低(Q)1)四分位数。方框指四分位数范围。中间线表示为框中的水平线。
总之，这些结果表明安布拉1通过诱导ECM重构和EMT样表型，促进黑色素瘤侵袭。
安布拉1缺乏症促进小鼠黑色素瘤转移
为了探讨这些发现在体内的相关性，我们分析了安布拉1-缺乏黑色素瘤细胞，使其他器官定植。宏观观察和组织学分析显示腹股沟淋巴结双酚A−/−与老鼠相比，老鼠拥有更大的色素区域。双酚A+/+小鼠在42天的终点(图)。4A-d)，并显示S 100的数量较高。+黑色素瘤细胞4C，d)。有趣的是，iLNs的组织学分析双酚A+/+小鼠最大耐受性肿瘤大小(59天和42天)双酚A−/−)色素区呈上升趋势。双酚A+/+相似，但低于观察到的双酚A−/−老鼠(图1.4A-d)。这一证据支持了这样一种假设：安布拉1缺失加速了黑色素瘤的发展，促进了黑色素瘤的侵袭状态。然而，当原发肿瘤的最大耐受性达到最大时，两组均未见肺转移。因此，评估远距离器官是否能更有效地被安布拉1-缺乏症黑色素瘤细胞，我们利用一种同基因小鼠模型，即向C57BL/6小鼠注射新鲜解离细胞。双酚A+/+和双酚A−/−肿瘤通过尾静脉(SbpA+/+和SbpA−/−)(图1.4E)。健康状况SbpA+/+和SbpA−/−对小鼠进行3个月的监测，并对其进行安乐死和肺采集。虽然转移瘤在宏观上看不出，但组织学分析显示SbpA−/−小鼠有更多的归巢和更大的结节。SbpA+/+老鼠(图1.4F-h)，建议安布拉1耗竭促进黑色素瘤转移。
图4：安布拉1缺失促进黑色素瘤转移。a收集腹股沟淋巴结的宏观评价双酚A−/−肿瘤的耐受性达到最大(42天)，双酚A+/+, n=4；双酚A−/−, n=4)或最大允许体积双酚A+/+肿瘤(59天)n=4)。每组显示三幅有代表性的图像。bILNs的平均面积为42(双酚A+/+, n=4；双酚A−/−, n=4和59(双酚A+/+, n=4)天。每个点表示每个鼠标iLAN的平均面积。数据显示为平均值±扫描电镜(*p=0.0172；**p=0.0063，单因素方差分析)。cFFPE-iLNs切片用H&E(左板)和抗S 100染色(IHC，中间板；IF，最右边板)。转移区域由黑色箭头表示。IF染色用Hoechst染色。图片代表每一组(n=5)。dS 100 IHC的量化每个数据点代表S 100的平均百分比。+每只小鼠的iLN面积±SEM(n=5，**p=0.0079；*p=0.0002，单因素方差分析)。e黑色素瘤细胞肺归巢模型的示意图0.25×106细胞/小鼠静脉注射。fFFPE-肺灌流，H&E染色，黑箭头示细胞归巢区。图片代表每一组(n=4)。g总面积(**p=0.0075)和h群众人数(**p=0.0025)双酚A+/+ (n=4)和s双酚A−/− (n4)小鼠被量化(双尾未配对)。t-测试，SbpA−/−V.V.SbpA+/+)。图中显示的盒子和胡须情节b, d, g, h)表示从最小到最大的值。顶部和底部晶须表示上部(Q)3)和更低(Q)1)四分位数。方框指四分位数范围。中间线表示为框中的水平线。
安布拉1缺乏症导致黑色素瘤FAK 1信号过度激活
散在RNAseq和gsea分析表明，粘着斑基因(GO：0005925)在安布拉1-肿瘤衰竭(图1)。3A，b和补充图。三维空间)。近年来，已有研究表明，AMBRA 1通过与FAK 1和src相互作用，调控小鼠鳞状细胞癌中的粘着斑激酶1(FAK 1)介导的信号通路。20。因此，我们研究了是否观察到安布拉1-低强度肿瘤与FAK 1信号轴的磷酸激活有关，这已被证明有助于黑色素瘤的侵袭性表型。21,22,23,24。WB分析显示FAK 1(pFAK-Y 397及-Y 576)及src(psrc-y 416)的磷活性显著增加。双酚A−/−肿瘤(如图所示)。5A和补充图。5A)和人黑色素瘤细胞的AMBRA 1沉默(图一)。5B和补充图。5B-d)，以及在ILN转移中双酚A−/−(补充图。5E)和黑素细胞痣巴−/−小鼠(附图)2F，i)。免疫荧光分析进一步证实FAK 1在SiAMBRA 1SK-Mel-5细胞(图1.5C和补充图。5F显示pFAK-Y 397信号与F-肌动蛋白纤维边缘的FA相关蛋白共同定位(图1)。5C和补充图。5F)。值得注意的是，AMBRA 1缺乏与FAs的大小和长度增加和形状因子降低有关，FAs是癌细胞的一个特征，其特征是运动速度更快(图一)。5D-g和补充图。5G-I)25,26.
图5：安布拉1-缺乏症显示FAK 1信号亢进。
a42天pFak-Y576、pFak-Y397、Fak1、PSRC-Y416和Src的WB分析双酚A+/+/双酚A−/−在59天内双酚A+/+肿瘤(n=每组3人)和b在AMBRA 1-沉默SK-Mel-5(图像代表的是n=4)。c代表(n(3)AMBRA 1-沉默的SK-Mel-5中pFAK-Y 397的IF染色。分别用Phalloidin、vinculin和Hoechst对F-actin纤维、细胞骨架和细胞核进行染色.最右边面板显示用于量化的阈值d平均尺寸(*p=0.001)，e长度(渡轮)(*p=0.0003)，f周长(*p=0.0005)和g形状因子(*p=0.0098(n=3，双尾未配对t-测试，SiAMBRA 1V.V.西斯克尔). h代表(n(3)断裂PARP-1(CL-PARP-1)和CASP-3(CL-CASP 3)的WB分析长曝光在AMBRA 1/FAK 1共沉默的SK-MEL-5中，红带识别信号饱和度)。i的情况下评估了伤口的愈合情况。h并显示为百分比±SD比。T0在指定的时间。白色和黄色线条轮廓伤口边缘T0在24小时内提供统计数据和有代表性的图像。n=3；*p=0.037；*p < 0.0001、双向方差分析(ANOVA)。jAMBRA 1/FAK 1共沉默SK-MEL-5细胞迁移计数。数据表示为平均值±SD，图像代表(n=3；*p=0.0246SiScr：siAMBRA 1VS。SiScr：siScr; *p=0.0116SiFAK 1：siAMBRA 1VS。SiScr：siAMBRA 1; *p=0.0304SiScr：siFAK 1V.V.SiScr：siScr、双向方差分析(ANOVA)。k示意图表示法法基治疗。l肿瘤生长动力学车辆- (n=5)或法基- (n=5)处理SbpA−/−老鼠。数据点代表平均体积比.第0天±扫描电镜(**p=0.0022；*p < 0.0001, two-way ANOVA). m重量SbpA+/+*车辆 (n=8)，SbpA+/+*法基 (n=5)，SbpA−/−:车辆 (n=10)和SbpA−/−*法基 (n=9)牺牲肿瘤(*p=0.0007；*p < 0.0001, two-way ANOVA). nBdmc创面闭合术+/+ (n=3)和Bdmc−/− (n=3)经1M处理的细胞法基在24小时内，行定义为i，数据显示为百分比±SEM比。T型024小时，图像代表(*p=0.0003；*p < 0.0001, two-way ANOVA). o迁移Bdmc计数+/+ (n=3)和Bdmc−/− (n=3)细胞n。数据表示为平均值±扫描电镜，图像代表**p=0.0047；*p < 0.0001, two-way ANOVA). Box-and-whisker plots in d–g, m表示最小到最大值。顶部/底部晶须表示上部(Q)3)/较低(q1)四分位数。方框指四分位数范围。中间线表示为框中的水平线。
两种内源性免疫沉淀分析(附图。5J)和AMBRA1-myc标记表达(补充图)。5K)SK-Mel-5细胞提取物证实了以前报道的FAK 1和AMBRA 1的相互作用。20。有趣的是，当我们表达FAK 1P876A/P882A突变体(HA-FAK1.miRes)AA)-以前曾报告要废除与AMBRA 1的相互作用20-FAK 1缺失的SK-Mel-5黑色素瘤细胞(SiFAK 1)，我们观察到AMBRA 1/FAK 1相互作用的减少(补充图)。5L)。这种现象伴随着FAK 1信号的磷酸激活增加(补充图)。五米)，类似于我们以前在AMBRA 1中观察到的--沉默的细胞(如图所示)。5B)，提示FAK 1/AMBRA 1相互作用的消失与FAK 1的过度磷酸化有关。
以前曾报道过PP2A与AMBRA 1相互作用11调节粘着斑27,28。基于这一证据，我们试图研究PP2A活性是否能通过AMBRA 1促进FAK 1和SRC的磷酸化。为此，我们通过siRNA选择性地降低了SK-Mel-5中AMBRA 1的水平。AMBRA 1信使RNA(MRNA)(SiAMBRA 1#2)，然后诱导AMBRA 1的PXP突变体的表达。AMBRA 1PXP)，已被报道废除了PP2A与AMBRA 1的结合。11,16。表达AMBRA 1PXP，以及WT AMBRA 1(AMBRA 1威汤哥)，不影响FAK 1或SRC的磷酸化状态。5N)，从而排除AMBRA 1相关PP2A活性在AMBRA 1耗竭时对FAK 1磷酸化的调节作用。
最后，为了评估ambra 1亲自噬功能是否参与fk 1的过度激活，我们沉默了关键的自噬基因。ATG 7 (SiATG 7)在黑色素瘤细胞中。值得注意的是，FAK 1信号的激活(补充图)。6A-c)也没有观察到有侵袭性和迁移倾向的增加。SiATG 7细胞(附图)6d-i)，表明这些现象与自噬无关。
总之，这些结果表明AMBRA 1对黑色素瘤细胞中FAK 1信号的调控与其PP2A和自噬相关功能无关。
安布拉1-调控FAK 1对黑色素瘤进展的影响
为了了解FAK 1是否在AMBRA 1缺乏所观察到的侵袭和迁移能力中发挥作用(图1)。3G，h)，我们进行了伤口愈合和跨井迁移试验。SiAMBRA 1黑色素瘤细胞同时下调FAK 1(SiAMBRA 1:SiFAK 1双重击倒)(无花果。5H和补充图。7A)。光学显微镜分析表明，FAK 1的沉默导致了一种拯救的表型独特的.SiAMBRA 1细胞(图1.5i，j和补充图。7b，c)，然而，这与任何凋亡事件无关(如图所示)。5H和补充图。7A)。另一方面，HA-FAK1.miRes的重新表达AA突变体的迁移能力高于WT FAK(HA-FAK1.miRes)(附图)。7D)，支持AMBRA1-FAK1相互作用在确定黑色素瘤细胞侵袭能力方面的相关性。
接下来，为了探讨这一发现的治疗意义，我们测试了FAK 1(法基)能特异性地影响小鼠皮下注射黑色素瘤细胞的肿瘤生长。双酚A−/− (SbpA−/−)肿瘤。5K)。自SbpA+/+小鼠不容易发生肿瘤(图一)。1E和补充图。二维空间)，我们决定增加细胞数量(最多5×10)6)在两种基因背景下产生可检测的肿瘤。值得注意的是，肿瘤生长的动力学在法基行政管理SbpA−/−老鼠(图1.5L和补充图。7e-g)，收集时肿瘤重量减少也证明了这一点(如图所示)。五米)，强调FAK 1信号轴心在持续运行中的关键作用。安布拉1-缺乏肿瘤。
为了确定FAK 1的抑制是否也会影响体外侵袭/迁移能力，bdmc。+/+和Bdmc−/−细胞的最大非致命性剂量法基(1M)24小时(附图)。7H)。与我们的假设一致，伤口愈合和跨井迁移测试显示，只有在bdmc，才有统计学意义的拯救移行和侵袭性表型。−/−细胞法基(无花果)5N，o).
总之，这些发现表明AMBRA 1介导的对FAK 1信号的调控影响黑色素瘤细胞的侵袭能力，并影响肿瘤的体内生长。
AMBRA 1在人黑色素瘤中的低表达与侵袭性表型及对FAK抑制的敏感性有关
为了加强我们发现的相关性，我们对17株人黑色素瘤细胞株进行了AMBRA 1表达的检测。其中9个细胞系的特征是AMBRA 1的表达降低(图1)。6a，b)。筛选的AMBRA 1高表达和低表达细胞株的Transwell迁移和伤口愈合实验显示AMBRA 1的表达与侵袭/迁移能力之间存在明显的负相关(图一)。6C，d)。还有，AMBRA 1间充质基因的表达与表达呈负相关CdH 2, FN1和维姆，而上皮标记物之间有明显的正相关关系。Cdh 1(无花果)6e-h)，因此提示一个活跃的EMT样过程与人黑色素瘤细胞中AMBRA 1的低表达有关。
图6：AMBRA 1在人黑色素瘤中的低表达与侵袭性基因信号和对Faki的敏感性有关。a17株黑色素瘤细胞裂解物AMBRA 1的WB分析肌动蛋白作为负荷对照。形象代表n=3凝胶。b以AMBRA 1/actin比值±SD表示AMBRA 1的密度分析，确定AMBRA 1的高低基团。n=3；*p < 0.0001，双尾未配对t-测试)。c迁移AMBRA 1高(n=3)和低(n(3)细胞。数据表示为平均值±SD，图像代表**p=0.0026，双尾未配对t-测试，AMBRA 1低对AMBRA 1高)。dAMBRA 1高的创面愈合n=3)和低(n3)细胞的百分比为±SD比。T012小时。白线和黄线轮廓伤口边缘T0而在24小时内，则会在12小时内提供统计数字及有代表性的图片(*p=0.0387，双尾未配对t-测试，AMBRA 1低比.AMBRA 1高)e–h相关RT-qPCR分析AMBRA 1和eCdh 1 (n=17；r=0.5188；p=0.0329，双尾皮尔逊相关)，f CdH 2 (n=17；r=−0.5129；p=0.0353，双尾皮尔逊相关)，g FN1 (n=17；r=−0.5045；p=0.0389，双尾皮尔逊相关)和h 维姆 (n=17；r = −0.6812; p=0.0026，双尾皮尔逊相关)。数据归一化为L34. i来自肿瘤基因组图谱(TCGA-SKCM)黑色素瘤样本、癌细胞株百科全书(CCLE)数据集和利兹黑色素瘤组(LMC)黑色素瘤样本的GSEA。ECM组织(GO：0030198)，侵入性签名19、EMT(Hallmark基因集)和焦点粘附组装(GO：0005925)基因集在AMBRA 1_Low和AMBRA 1_High在TCGA-SKCM(n每个分组=70)，CCLE(n=7(每个分组)和LMC(n=每个分组105)。其他，标准化富集评分；FDR，错误发现率。jAMBRA 1表达与药物敏感性的相关剂量反应分析法基(IC)50、M)在n=15株黑色素瘤细胞系(r=0.7752；p=0.0007，双尾皮尔逊相关)。k两个选定的AMBRA 1高、低细胞的创面闭合面积法基的百分比±SD。T024小时(n=3；*p=0.0003；*p=0.0001对于ed 129，双尾未配对t-测试，法基VS。车辆).
来自肿瘤基因组图谱(TCGA-SKCM)数据集黑色素瘤样本的转录数据n肿瘤细胞株百科全书(CCLE)数据集的黑色素瘤细胞系(CCLE)n=49)和利兹黑色素瘤组原发黑色素瘤样本(LMC，n=703)29并进行了分析。在所有数据集中，样本是根据它们的AMBRA 1MRNA水平定义了AMBRA 1高和AMBRA 1低子群，考虑到人口的前15%和最底层15%AMBRA 1MRNA表达。有趣的是，所有数据集的GSEA显示，AMBRA 1_low亚基在ECM、EMT和FA基因以及与黑色素瘤侵袭性相关的基因中都有丰富的分布。19(无花果)6I).
最后，我们试图评估AMBRA 1的表达水平是否会对人黑色素瘤细胞株的敏感性产生不同的影响。法基。为此，我们治疗了一个由15个黑色素瘤细胞系组成的小组。法基24小时(附图)8A)，表明AMBRA 1蛋白表达水平与对法基(无花果)6J)。此外，我们还观察到法基有效(附图)。8B，c)并明显改变所选的AMBRA 1-低表达人黑色素瘤细胞株的侵袭/迁移能力。6K和补充图。8D).
总的来说，这一证据表明AMBRA 1与侵袭性表型相关，并增加了对法基在人类黑色素瘤细胞中。
