一种定量蛋白质组学方法确定T-all对NOTCHI的共同抗性机制 为了表征内源性GSI耐药性，我们分析了6个T细胞株(模型N.1；图1). 1B )。DND-41、HBP-ALL和ALL-SIL对NOTCHI敏感，而JURKAT、molt-3和朋辈对NOTCHi具有内在的抵抗力。 16 1 )。例如，在抵抗组织中，jurkat和molt-3港。 PTEN -零突变，而JURKAT和同行携带 Fbxw 7 突变，这两种基因之前都与GSI抗药性有关。 11 ,16 。对GSI XXI化合物E治疗后细胞存活的分析表明，与敏感组相比，GSI耐药组平均耐受更高的半最大抑制浓度(IC 50)近1000倍(补充图)。 1A )。观察到的差异反应并不是由于药物对耐药细胞N1断裂缺乏活性所致(补充图)。 1B )。敏感细胞株DND-41和HBP-均表现为G0/G1期细胞周期阻滞，而敏感细胞株ALL-SIL和三种耐药细胞系的细胞周期进程不受影响(附图)。 1C，d )。我们进一步验证了长期使用GSI的全SIL敏感性，直到9周，没有观察到细胞生长的恢复(补充图)。 1E ).
作为获得GSI耐药的体外模型，我们从敏感细胞株DND-41中分离出一个持续存在的细胞群，经过5~6周的处理，增加GSI的剂量(模型N.2；图1)。 1C )14 。持久细胞对NOTCHi的获得性耐药比亲本细胞高近1000倍(补充图)。 2A )。我们包括一个短期的GSI治疗(72h)条件，以区分短暂和长期的效果N1抑制(图一)。 1C )。我们用免疫印迹法验证了n1icd和cMyc蛋白的表达，并证实了先前报道的结果。 14 ：N1ICD在短期和长期GSI处理细胞中都完全缺失，而N1靶点cMyc在持续细胞中被拯救(补充图1)。 2B ).
为了再现患者获得性耐药的发展，我们治疗了两种Notch成瘾，Notch 1突变的T型异种移植(PDTALL 11和PDTAL 19)。 18 ；补充数据 1 )，在NOD/SCID小鼠体内植入NOD/SCID小鼠体内，用Noch 1特异性(ANoch 1)中和单克隆抗体OMP52M51，直至白血病发生。 19 (模式N.3)。OMP52M51或对照抗CD 20抗体Rituximab(RTX)每周一次。对OMP52M51处理的抗性在分析后(PDTAL 19和PDTAL 11分别在43天和80天)表现出不同的动力学特性。 19 。在两种模型中，耐药细胞均表现为Noch 1靶基因表达下调和n1icd蛋白表达完全缺失。 19 。从脾细胞群体中获得用于MS分析的T-all细胞(如图所示)。 1D ).
为了在全球范围内研究敏感和耐药T细胞间的差异信号，我们对蛋白质组和磷蛋白组两个信号层进行了基于质谱(MS)的蛋白质组学分析。 1A )。我们在不同的实验中使用了两种不同的蛋白质组学策略(补充图)。 3 )。对于模型1-2，我们在q-exactiveHF-X质谱仪上使用了基于等压标记的工作流程和LC-MS/MS相结合的方法。 20 。在每个条件下收集三个生物副本(附图)。 1F G， 2C )。对于模型n.3，我们在不使用谱库(直接-dia)的情况下，在OrbitrapExplorer 480上使用了一种数据独立获取模式下的一次不带标签的方法。 21 联合使用EvosepOne系统的短LC梯度 22 。每组5只-6只。在数据集N.1中，我们对8434个蛋白质组的218,847个肽，5100个磷蛋白上的32,565个磷酸肽和16,152个本地化的(I类)进行了量化。 23 磷矿。在数据集N.2中，我们对7430个蛋白质组的118,638个肽，4056个磷蛋白和11,080个Ⅰ类磷酸酯中的19,457个磷酸肽进行了定量分析。在数据集N.3中，我们定量分析了5803个蛋白质组的79,849个肽和相当于10,475个磷酸肽和3118个磷蛋白的10,639个Ⅰ类磷酸盐。 1E ).
阻断蛋白质合成可能恢复对NOTCHI的内在抗性 为了评估在蛋白质组水平上对GSI的反应是否明显，我们对不同细胞株(1122个调节蛋白；补充图)进行方差分析(ANOVA)统计分析后，进行主成分分析(PCA)。 4A )。这一分析表明，不同的细胞株蛋白组分-1分离在两个明显不同的群体中，反映了它们对GSI的反应。接下来，我们通过微阵列的显着性分析(SAM)统计检验，来确定敏感和耐药细胞株群之间的差异调节蛋白。 24 。我们发现596种调控蛋白：耐药细胞株组(簇1，C1)中有323种蛋白含量显著增加，敏感细胞株组(2，C2)中有273种蛋白表达上调(图2，C2)。 2A ；补充数据 2 )。为了确定某一特定转录因子是否是敏感或耐药细胞中更丰富的蛋白质的主调节因子，我们使用芯片富集分析(Chea)数据库进行了转录因子富集分析。 25 ,26 (无花果) 2B )。N1是C2中最显着富集的转录因子。在C1蛋白中，我们发现Tal1/scl的顶部富集。值得注意的是，Jurkat和molt-3在 TAL 1 启动子引起其过度激活 27 。综上所述，这组分析表明，在蛋白质组水平上，通过功能连接到N1的蛋白质的基础过度表达可以预测内禀N1成瘾。
图2：天然抗GSI细胞的全局蛋白质组特征。 a 耐药细胞株与敏感细胞株之间的规范化蛋白强度分级聚类(柱：Pearson相关；行数：堪培拉距离)(未配对双面SAM检验：基于排列的FDR<0.05；S0=0.1； n =9个生物独立样本，通过三个独立实验进行检验)。 b 芯片富集分析(CheA)是通过Enrichr对所有属于集群1或簇2的蛋白质进行的。综合评分融合了Fisher精确测试的结果和Z-评分的一个值。高分表明转录活性增加。只有转录因子经本雅明-霍奇伯格校正 p 数值<0.05包括在内。 c 通过string App进行基因本体丰富分析(fdr：benamini-hochberg校正) p 价值)。背景：蛋白质组。 d 在GSI耐药细胞系(基于排列的FDR<0.01)中，这些蛋白的功能串网络明显丰富。通过集群标记2应用程序，通过MCL聚类生成簇。基因本体富集分析通过STRIPAPP(背景：蛋白质组)进行。问：Benjamin amini-Hochberg-更正 p 价值。 e 抗GSI细胞株与敏感细胞株(基于排列的FDR<0.05)的顶部300个差异调节蛋白的连接图分析，t检验统计(每侧150个蛋白质被查询)。连接评分用Kolmogorov-Smirnov双面统计方法计算.正分数表示给定微扰根的信号与GSI敏感性的相似性。 f 在耐药细胞系中磷酸化明显丰富的磷酸化蛋白的功能串网络(未配对双面SAM试验：基于排列的FDR<0.01；S0=0.1； n =9个生物独立样本)，通过string App生成。通过集群2通过MCL聚类生成簇。通过string App进行基因本体富集分析。只显示了两个最大的星系团。背景：磷蛋白组。 g MTOR抑制剂雷帕霉素对9株人T细胞株的敏感性值(半数抑制浓度IC 50)的自然对数(LN)。数据来源于肿瘤药物敏感性基因组学项目。不成对的双面 t 用试验评估GSI耐药者的平均LN(IC 50)差异。 n =6)和敏感( n (3)细胞株。耐Res，Sens敏感，h人，m鼠，GOBP基因本体论生物学过程，SD智能域，FC折叠变化。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们对每个聚类进行基因本体论(GO)富集分析(如图所示)。 2C )，表明C2蛋白与生物过程“转录，DNA模板”相关，含有锌指结构域。C1最丰富的生物学过程是“小分子代谢过程”。考虑到c1蛋白的高度异质性，我们进行了功能网络分析。 28 接着是马尔可夫聚类(MCL) 29 以及GO/通路在每个子簇上的富集 30 (无花果) 二维空间 )。最丰富的GO术语是多种代谢过程，包括氨基酸的生物合成和分解、脂肪酸降解和活性氧(ROS)代谢过程。为了解开在富含耐药细胞的不同GO术语中是否存在共同的中介，我们询问了连接性图(Cmap)，这是一个针对19,811个化合物和5075个遗传扰动而收集的大量基因表达特征。31 。结果表明，GSI敏感性谱与蛋白质合成抑制剂emetine的表达特征相似性最高，其次是雷帕霉素(MTOR)抑制剂QL-X-138的哺乳动物靶标。 2E ).
为了准确识别GSI敏感性，我们在磷蛋白组数据上进行了耐药细胞群和敏感细胞群的SAM试验，得到107种显著调控的磷矿(补充数据)。 2 )。通过对所有调控的磷酸化蛋白的功能网络分析，我们在第二大簇中发现了KEGG途径“mTOR信号”和反应体通路“翻译起始复合物形成”的显著富集。 2F )，进一步证明了Cmap预测。为了将这些发现扩展到一个更大的细胞系面板，并验证这些发现的生物学相关性，我们对一个由6个GSI耐药细胞和3个敏感T-ALL细胞系组成的小组进行了独立分析(补充数据)。 1 )从肿瘤药物敏感性的高通量基因组学(GDSC) 32 。这表明耐药细胞系对两种不同的mTOR抑制剂雷帕霉素更为敏感。 2G )和JW-7-52-1(附图)。 4B )。PTEN是已知的mTORC 1复合物的负调节因子，它解释了人们观察到的mTORC 1目标磷酸化增加的原因。 PTEN 零细胞株，JURKAT和molt-3。对于对等细胞系，它不包含 PTEN 零突变，我们通过癌症细胞株百科全书数据库发现 33 它有一个无意义的突变(W 164*) 34 在 TSC 1 位点，编码负的mTORC 1调节蛋白。总的来说，这组分析表明，根据先前的报道，抑制mTORC 1信号或蛋白质合成可能会使固有的GSI抗性恢复。 35 ,36 ,37
DND-41中获得的GSI抗性部分共享具有本征电阻的异常信号模块。 为了深入了解DND-41细胞获得的GSI耐药性的生物学基础，我们对蛋白质组数据进行了PCA分析。 3A )。值得注意的是，短期内GSI的情况正好介于亲本和持久细胞之间的成分-1.然而，它似乎有着独特的特点，从成分2上的持久细胞和亲本细胞中分离出来。探讨我们的蛋白质组数据集与Bernstein和同事发表的微阵列数据的可重复性 14 ，我们对两个数据集进行了线性回归分析，发现两个数据集之间存在相当大的直接相关性(Pearson相关系数， R =0.64；附图。 5A )。为了找出三种条件下的差异调节蛋白，我们进行了方差分析。我们发现1963年差异调节蛋白(补充数据) 3 )并执行分层聚类以确定规则的方向性(如图所示)。 3B )。我们鉴定了6个表达簇(C1-6；图1)。 3C )。我们根据不同的亲本/持久者对每一组中的蛋白质进行排序，并在前100位上进行了Chea测试(图1)。 三维空间 )。在C1(GSI&Persister中Up)和C2(Up In Persister)中，我们都发现含有溴结构域的蛋白4(Brd 4)显著富集。此外，它在持久化细胞中的表达略高(折叠变化=1.06；fdr校正)。 p 价值， q =0.02)，确认先前报告的内容 14 。MYB也在这些簇中富集，表现出与固有抗性细胞的相似性(图1)。 2A )。有趣的是，Kdm2b的靶细胞也被富集；相反，它们在本质上敏感的细胞中被上调。C3(在GSI中)包括Notch目标cMyc( q =0.005)。事实上，在这里，Chea发现了主要受cMyc转录控制的蛋白质。我们还在这个簇中鉴定了Kdm5b，表明它的靶点被GSI下调，并在较持久的细胞中被拯救。这种脱乙基酶在内质抗性细胞中也有上调作用(折叠变化=1.43； q =0.009)。C4蛋白对N1和它的靶标(GSI&Persister)都遵循着同样的趋势。事实上，N1本身就是这个集群的一部分( q CHEA显示N1和Myc同时富集。这些发现表明，大多数cMyc靶细胞仍处于N1依赖状态，而在长期抑制N1后，只有一组特定的cMyc目标被重新表达。在C5中，我们再次发现N1，表明长期GSI治疗后其活性甚至比短期更受抑制。我们还发现GATA 3，其活性在内在抗性细胞中被上调。C6(GSI中的UP)显示出独特的轮廓，与其他集群或数据集1没有重叠。
图3：耐药DND-41细胞的蛋白质组学分析。 a 所有定量蛋白质的主成分分析(PCA)。 b 标准化蛋白质强度分级聚类(柱：Pearson相关；行数：堪培拉距离)在不同条件下的显着调节蛋白(单向方差分析：Benjamin amini-Hochberg FDR=0.01；S0=0.1； n =3个生物独立样本)。给出了每个条件下每种蛋白质的平均值。 c 每个集群的蛋白质表达谱显示在左边。每个聚类中最丰富的基因本体术语显示在每个配置文件的右侧。在Perseus进行富集分析，使用每个簇的所有调节蛋白(背景：蛋白质组)。 d 根据log 2倍变化持久蛋白/亲本组(1-2组和4-5组)或持久性/GSI组(第3组和第6组)对调控蛋白进行排序，并通过Enrichr进行芯片富集分析(CHEA)。Benamini-Hochberg修正的−log 10 p 数值(FDR)是Z分数归一化，结果显示在一个热图.父母，PERS持久化者，GOBP基因本体论生物学过程，Q benamini-hochberg-校正 p 有价值的人，我是老鼠。源数据作为源数据文件提供。
为了解开对持续细胞有显著影响的主要信号通路，我们对每个簇进行了GO富集分析(图1)。 3C ；补充数据 4 )。C1以“染色质结合”和“核小体组织”的形式富集。这表明，导致抗药性发展的表观遗传重塑从药物暴露的一开始就开始了。C2显示出几种代谢过程的富集，即“活性氧物种代谢过程”。重要的是，ROS清除酶在GSI耐药细胞系中也被过度表达。 二维空间 )。细胞的主要活性氧来源之一是线粒体呼吸的副产物。 38 。事实上，我们发现了富含C2的GO术语“线粒体基质”，其中包含了几种具有电子转移活性的蛋白质。Reactome术语“呼吸电子转移”也在获得的耐药细胞中富集。 二维空间 )。C4蛋白在多个水平上参与蛋白质合成，这与cMyc作为蛋白质合成主调节因子的已知作用是一致的。 39 。C3还包括参与蛋白质翻译的蛋白质，特别是参与核糖体生物发生的蛋白质。这表明，为了生存，持久化的细胞可能需要部分拯救翻译相关的过程，这与先前在内在抗性方面的发现是一致的(图一)。 2E，f )。属于C5和C6的蛋白质在细胞周期相关过程中富集。这些变化很可能是由于持久化细胞的增殖速度比亲本细胞慢(补充图)。 5B )。然后我们分析了参与细胞周期的单个蛋白的调节，这些蛋白的表达在T-all中被证明是n1依赖的。40 ,41 。而Cdk 4(C5)； q Cdk 6(C4)=0.009)； q 和Cdkn1b(C2)； q 表达谱符合N1抑制，cdn2d(C6)； q =0.002)，已知受到cmyc的压制。 41 ，逃脱N1控制，与cMyc救援一致。我们还观察到几种参与DNA损伤反应的蛋白质(在C5中富集的GOBP“DNA修复”)的持续细胞显著减少。这些发现类似于最近发现的对EGFR/BRAF抑制在人大肠癌中的“适应性突变”。 42
其次，我们分析了长期GSI处理DND-41细胞与亲代和短期GSI处理细胞相比的磷酸化变化。在长期与亲本的比较中，我们发现491个显著调节的磷酸盐，231个被上调，260个被下调。在持续的GSI比较中，我们发现565个显著调节的磷酸盐，287个被上调，278个被下调(补充数据)。 3 )。考虑到相对较高的相关性( R =0.45)蛋白质组和磷蛋白组之间的比较(补充图)。 5C，d )，我们进行了火山图分析，我们只强调了调节程度最高的磷矿，而这些磷矿在蛋白质组水平上没有受到同样程度的调节(图一)。 4 )。为了优先考虑与功能相关的磷矿，我们只对功能得分较高的磷酸盐进行了标记。 43 。这一分析表明，两个层次上受调控的生物过程之间有很大的重叠。然而，它也使我们能够找出一些不同之处。例如，我们注意到真核生物翻译起始因子4B(Eif4b)在持久分子-亲本比较中的几个位点上被下调，而我们在持续-GSI比较中观察到两个不同的位点被上调，这可能是持久细胞挽救翻译启动的一种方式，而在蛋白质组水平上，这是被高度下调的。
图4：耐药DND-41细胞的磷蛋白组学分析。 火山图分析的持久者/父母(上)和持久者/GSI(下部)比较。意义是通过不成对的双面确定的。 t 试验(Benamini-Hochberg FDR<0.01，持久者/父母<0.05，持久者/GSI<0.05； n =3项生物独立实验)。在显着性分析中，采用对数2倍变化的阈值，等于3倍标准差，在所有地点分别计算向上和向下的标准差。注释的地块是中间的火山图的放大部分。其相应蛋白质在蛋白质组水平上受到调节的磷矿，采用与磷蛋白组相同的标准，标记为粉红色(上调)和浅蓝(下调)。功能分数>0.5的磷矿被表示为填充圆。只有功能评分>0.5且在蛋白质组水平上不受调节的位点被标记。在Pers/GSI比较中，比较之间共享的受规范站点不被标记。颜色名称表示涉及相应蛋白质的生物过程。
PDX对NOTCH1i的获得性耐药使体外观察到的信号重编程 为了深入了解PDTALL 11和PDTAL 19细胞对aNoch 1 mAb获得性耐药的生物学基础，我们对这两种PDX模型进行了磷蛋白组分析(数据集编号3，图1)。 1D )。有趣的是，蛋白质组数据上的PCA显示，对于两种不同的模型，对照组(RTX)和aNotch 1组在成分-2上的方向是相同的(图1)。 5A )。这表明在两种PDX模型中对长期的aNot 1治疗都有共同的反应。为了鉴别对照组和aNot 1组之间的差异调节蛋白，我们做了一个样本。 T -对log2转化率进行测试，鉴定出1301个调节蛋白，504个上调蛋白和797个下调蛋白。 5B ；补充数据 5 )。接下来，我们进行了功能网络分析，其次是MCL聚类和GO在六个最大子簇上的富集(见图)。 5C )。在经过aNot 1处理的蛋白质中，我们发现GO术语“染色质组织”、“细胞粘附”、“Valine、Leucine和Isoleucine降解”、“脂肪酸代谢”的富集。同样的术语也丰富了内在抗性(图1)。 1D )和持久化单元格(补充数据) 4 )。“小泡介导的转运”、“中性粒细胞脱颗粒”、“GPCR信号”和“钙信号”似乎是这个数据集特有的术语。然而，我们发现KEGG“Chemokine信号通路”丰富了C1(DND-41)，这与GPCR信号有关。在被aNoch 1下调的蛋白质中，所有的簇都显示出与持续细胞的Go期重叠。特别是第一大275-蛋白质簇显示“翻译”和“核糖体生物发生”的富集；第二大簇包括参与细胞周期和DNA修复的蛋白质。然后，我们对每个集群执行Chea，并确定了以前在DND-41数据集中发现的大部分TFs(图1)。 5D )。在DND-41和获得性抗性方面，唯一的TF是GATA 3，其功能在PDXaN1中增加，在DND-41持久耐药细胞和内在抗性细胞中下降。
图5：抗Noch 1单克隆抗体OMP52M51抗T-allPDXs的蛋白质组学和磷酸蛋白质组学分析。 a 每组至少3只小鼠所有蛋白质的主成分分析。 b 对数2倍变化抗Not 1/Rituximab在不同条件下的无监督分级聚类 t 检验：Benamini-Hochberg FDR<0.01，S0=0.1； n =9只不依赖生物的小鼠)。列：Pearson相关；行：堪培拉距离。用RTX的中位数计算对数2倍的变化。 c 功能字符串网络的显着调节蛋白代表b(截止：Log2倍-变化>2次标准差)，产生的字符串。通过集群标记2应用程序，通过MCL聚类生成簇。通过string App进行基因本体富集分析。只显示了六个最大的星系团。背景：蛋白质组。 d 芯片富集分析(Chea)是对在 b (截止：对数2倍变化>2次标准差)。Benamini-Hochberg修正的−log 10 p 数值(FDR)是Z分数归一化，结果显示在一个热图. e PDTALL 19模型中蛋白质的主成分分析，无论是在抗Noch 1急性治疗(AT)中还是在抵抗(RES)(未配对双边)中都是如此。 t 检验：排列型FDR<0.05； n 分别=5或4)。 f 蛋白的功能串网络，其表达在抗性中被上调，在急性治疗中被下调(属于补充图中的粉红色簇)。 6d )。网络是通过Omics可视化应用程序生成的。 g PDTAL 19荧光蛋白组中aNotch 1/Rituximab的火山图分析显着性是通过sam检验(不成对的双面检验)来确定的。 t 检验：排列型FDR<0.01，S0=0.1； n =5)。只有一组功能分数>0.5的磷矿被标记。颜色名称表示与相应蛋白质相关的生物过程。Rtx控制抗体rituximab，a notch 1或an1抗-noch 1，fc折叠变化，h人，m鼠，q bjamini-hochberg校正 p 价值。源数据作为源数据文件提供。
重要的是，我们评估了我们的蛋白质组学数据与PDTAL 19模型中已发表的微阵列数据集的相关性。 19 并发现了较高的正相关( R =0.53；附图。 6A )。这不仅证实了在蛋白质水平上观察到的趋势，而且表明这里观察到的蛋白质调控机制很大程度上是由基因表达调控驱动的。
对于PDTAL 19模型，我们还在aNoch 1急性治疗(AT)(补充数据)之后生成了一个蛋白质组数据集。 5 )，我们将其与长期治疗(抵抗力)进行了比较.首先，我们分析了cMyc蛋白的表达，发现在DND-41持久化细胞中也有同样的表达(补充图)。 6B，c )。主成分分析表明，蛋白质组改变的方向性在AT和抗性之间是常见的，AT更极端，尤其是下调的蛋白质，并且对数2倍变化的标准差更大(图2)。 5E ，补充图。 6d，e )。这表明耐药细胞能减弱NOTCH1i蛋白信号。一种可能的解释是部分通路的重新激活，可能是由于Notch家族的其他成员对N1损失进行了补偿，如前所述。 44 。值得注意的是，我们在AT和aNot 1之间发现了转录调节因子Rbpj(也称为CSL)和Creb 1(补充图1)。 6f 、图1. 5F )。在没有活性Notch的情况下，rbpj被认为主要是一个转录抑制因子。 3 。然而，有人建议rbpj也可能有一个与Notch无关的活动。 45 。CREB 1被证明在rbpj dna结合基序上有显著的富集。 46 。这可能是一种特定于Notch 1导向疗法的适应机制，而不是GSI，这需要进一步的研究。
接下来，我们分析了与RTX相比，aNoch 1诱导的磷酸化变化。在PTALL 19中，我们发现294种显著调控的磷矿，173种被上调，121种被下调(补充数据) 5 )。然后我们做了一个火山图分析，在那里我们只突出了一个高功能评分的磷矿(如图所示)。 5G )。我们发现与DND-41持久化数据集的生物过程有明显的重叠(图一)。 4 )。一些具体的例子是上调STAT 1磷酸化(STAT5a磷酸化在持续的GSI比较中被上调)和HDAC 4磷酸化的下调(HDAC 7的磷酸化在两种比较中都被下调)。
与耐NOTCHI相关的激酶信号分析PKC的激活 接下来，我们通过激酶-底物富集分析(Ksea)算法研究了gsi抗性和敏感状态下的激酶调节，该算法根据其大多数底物的相对高磷酸化或去磷酸化程度对每个激酶候选物进行评分。 47 (无花果) 6A ；补充数据 6 )。这一分析表明Akt 1是在耐药细胞中表达最显著的激酶，这与以前的研究结果一致。 48 。通过免疫印迹(附图)，我们还发现其磷酸化在耐药细胞(JURKAT、molt-3和DND-41持久性细胞)中增加。 7a，b )。与GSI耐药相关的常见激酶信号还强调了蛋白激酶C(PKC)新亚家族(包括PKCƟ，δ，ɛ和η)的激活。此外，我们观察到不同的核糖体蛋白S6激酶(Rps6kb1，Rps6ka1，Rps6ka2)的显著流行。此外，PAK1-2激酶在耐药状态下活性更高。
图6：与耐NOTCHI相关的激酶信号揭示了耐药细胞PKC的激活。 a 激酶-底物富集分析(KSEA)输出用热图表示.列是不同的比较，行是活性受到显著调节的激酶( q ：：本雅明-霍赫贝格FDR<0.05)在至少3/5的比较中。排除少于4个底物的激酶。这三个集群是通过k均值行聚类生成的( n =3)。KSEA的意义来源于 n =3项独立于生物的实验，每项比较，并表示为* q < 0.05; **q < 0.01; ***q < 0.001. b 中使用的五种不同比较的P-S6 S 235-S 236 Log2折叠变化 a 。“*/**/*”代表 p 由未配对的双面产生的值 t 测试一下。*=0.001；**=0.01；*=0.001。 c , e –f 。T细胞裂解物的免疫印迹分析(C)； n =1表示左印迹；右印迹代表 n =2个独立实验)，DND-41细胞(E； n =1表示上面的污点；下面的印迹代表 n =5个独立实验)和PDTALL 11细胞FACS-从脾脏中分离出来(F； n =1)。β-肌动蛋白 c 是一种不同的凝胶。用ImageJ定量表达蛋白。小鼠n°5 in e (红色)：蛋白质组数据中的离群点。 d PKCδ 基因表达(RNAseq)在T细胞株中的表达。黑线表示平均值，虚线表示SEM( n =4-13个生物学独立细胞系)。不成对的双面 t 试验用以评估GSI耐药和敏感T-all之间的平均日志2/百万转录本(TPM)的差异。数据(RNAseq)取自CCLE数据库(ExpressionPublic19Q3数据集)。 g 免疫印迹在图中的定量。 6f 。所示值为平均值±扫描电镜( n =5-6只不依赖生物的小鼠)。不成对的双面 t 实验采用蛋白质表达和磷酸化的差异检测。异常值用白色标记。Rtx利妥昔单抗源数据作为源数据文件提供。
Pkcδ以前参与了对实体肿瘤靶向治疗的获得性耐药。 49 。因此，我们特别关注它的靶点，并确定了丝氨酸235和236号在核糖体蛋白S6(Rps6)上的磷酸化作用。 6B )。值得注意的是，以前曾报道过这些磷酸化事件可以促进mrna翻译的启动。 50 ，在耐药细胞中受到NOTCHI的抑制。因此，我们假设pkcδ可能代表了T细胞逃避GSI有害影响的一种方式。事实上，在抗GSI的细胞中，我们发现pkcδ蛋白表达增加(折叠变化=1.5； q =0.002；图1。 二维空间 )并增强其两个激活位点的磷酸化：Ser 299(折叠变化=2.3； q 0.004)和S 645(折叠变化=2.1； q =0.006)。我们进一步验证了这些发现通过免疫印迹(图)。 6C )并确认了 PKCδ 基因在更广泛的T细胞板中的表达 33 (无花果) 6d )。在持久化细胞和PDTALL 11中，无论是在蛋白质组还是在磷蛋白组，我们都没有发现PKCδ。然而，我们通过免疫印迹技术在持续细胞中发现了Ser 645的上调(如图所示)。 6E 经aNotch 1处理后，PDTALL 11中PKCδ蛋白水平升高(如图1所示)。 6f，g )。最后，我们鉴定了活化磷矿Thr 507(折叠变化=1.8； q =0.002；图1。 5G ，补充图。 7D ANotch 1处理后PDTAL 19中PKCδ总蛋白水平升高(补充图1)。 7C )。此外，在所有模型中，我们观察到PKCδ激活与S6磷酸化呈正相关(图)。 6C ，附图。 7D ).
我们使用两种不同的PKC抑制剂rottlerin和sotrastaurin进一步证实了pkcδ与S6之间的激酶-底物关系，这两种抑制剂都能诱导所有耐药细胞系S6磷酸化的大量降低(补充图)。 7E )。为了排除P-S6蛋白激酶Cδ调节是由mTOR介导的，我们分析了DND-41细胞相同裂解物中典型的mTOR靶标P-4e-bp1 Thr 37/46，发现无调节作用(附图)。 7F )，表明S6是一种“真正”的直接PKCδ底物。
缺口和PKC抑制协同影响耐药T细胞的存活 N1通过cMyc对GSI敏感T-ALL细胞S6磷酸化的正调控作用 35 。为了评价N1对耐药细胞系S6磷酸化的影响，我们用GSI处理所有T细胞株5天。这说明N1抑制能显著提高耐药细胞的S6磷酸化水平，而在敏感细胞中则显著降低。 7A ).
图7：针对耐NOTCHI细胞的Notch和PKC的联合治疗。 a 细胞经GSI(0.5μM)处理5d后，免疫印迹法检测抗体。HPB-所有样品：较高的暴露时间。右面板显示的数值为平均值±扫描电镜( n =每个细胞系3个生物学独立样本)。不成对的双面 t 用试验评估平均蛋白表达的差异。 n =9个生物独立样本，对3个独立实验进行了检验)。 b 用GSI(0.5μM)、鱼腥草素(5μM)或其组合处理细胞，免疫组化标记抗体。P-S6和S6：3天；cMyc：5天。JURKAT：Blot是3(CMyc)或4(S6)独立实验的代表。MOLT-3/S6： n =2.MOLT-3/cMyc和同行： n =1。 c 细胞用GSI(0.5μM)、鱼腥草素(5μM)或联合处理6天，用CCK 8法检测细胞存活情况。所示值为平均值±扫描电镜(JURKAT： n =8个生物独立样本，在4个独立实验中进行了检查；molt-3和Peer： n =4个生物独立样本，通过两个独立实验进行检验)。不成对的双面 t 用试验评估平均生存期的差异。幸福>0协同；<0拮抗；=0加性效应。 d 用GSI(0.5μM)、sotrastaurin(5μM)或其组合处理DND-41细胞5天，并对标记抗体免疫印迹。 n =3项独立于生物的实验； n =2)。 e 大剂量土星黄连(5μM)作用于DND-41细胞6天后细胞存活率的测定。所示值为平均值±扫描电镜( n =12个生物独立样本，通过三个独立实验进行检验)。在GraphPad棱镜中用非线性回归法计算半最大抑制浓度(IC 50).不成对的双面 t 采用检验方法评估平均IC-50(对数转换值)的差异.用ImageJ定量表达所有印迹蛋白。Sotra sotrastaurin，Ctrl DMSO处理细胞。源数据作为源数据文件提供。
众所周知，mTOR活性在细胞周期的G1/S期增加，而在静止的细胞中则下降。 51 。为了排除所观察到的mTOR靶点S6磷酸化的改变是由GSI依赖性的细胞周期改变引起的，我们在两个敏感的细胞系DND-41和HBP-ALL中进行了GSI时间历程。这些实验显示，GSI处理两种细胞系6天后细胞周期停止(补充图)。 1D )。此外，我们观察到S6磷酸化在最早的24小时在这两个细胞系中的降低(补充图)。 8A )，未检测到细胞增殖的变化(附图)。 8B )，提示P-S6的下降与细胞周期无关。在全SIL细胞株中，P-S6的调节在前72h内没有明显的变化。
然后，我们观察到GSI依赖的上调P-S6在耐药细胞系中的作用是否是PKCδ激活的结果。为此目的，我们使用了gpc抑制剂sotrastaurin，这是一种临床药物(第二阶段)，在不同的pkc亚型之间高度特异，在高浓度时很少有非靶点。 52 (补充图。 9a，b )。我们用GSI，sotrastaurin处理耐药细胞系(浓度低于实验确定的IC-50；补充图)。 9C )和组合(图1. 7b ，补充图。 9d )。在GSI中添加大豆皂甙显著降低所有细胞株P-S6的增加。这串扰是专门针对P-S6，而不是mTOR，因为我们观察到P-4e-Bp1(补充图1)没有受到任何调节。 9H )。此外，单纯的PKCδ抑制可显著上调cMyc蛋白的表达，联合用药可完全消除cMyc蛋白的表达。同样的联合处理对细胞生长有协同作用，如Bliss独立性分析所示(见图)。 7C )。这些结果在JURKAT细胞中被PKCδ抑制剂rottlerin独立证实。 9E-g ).
探讨PKCδ激活是否与DND-41细胞P-S6上调有关。 6E )，我们用GSI，sotrastaurin和联合治疗亲本细胞和持久细胞(如图所示)。 7D )。与GSI单独作用相比，星黄连和GSI完全抑制P-S6的持续增加，使亲本细胞P-S6进一步降低。此外，PKCδ抑制可导致亲代细胞中cMyc蛋白表达显著增加，而GSI则使其消失，在本征抗性细胞中表现出相同的行为。此外，与亲本细胞相比，持续细胞在星星座蛋白IC 50中表现出显著的两倍以上的增加(图1)。 7E GSI和sotraaurin联合作用可促进T细胞凋亡，Caspase-3酶解的上调证实了这一点(如图所示)。 7D ).
这些实验表明，PKCδ抑制能恢复耐药细胞对谷胱甘肽的敏感性。此外，他们还强调PKCδ和N1的表达是相互排斥的，因为两者的抑制或其中一种导致另一种的激活。为了验证这是否是T-all中的一个通用特性，我们发现了一个显著的负相关( R =−0.6； p =0.0009) N1 和 PKCδ 基因在T细胞株中的表达 33 (补充图。 10A )。此外，我们还分析了264名T-全组患者的RNAseq数据。 5 ，我们证实了在细胞系面板中观察到的一般负相关。 R =−0.14； q =0.055；附图。 10b ).
摘要pkcδ是发展适应性gsi抗性不可缺少的一环。 由于我们在DND-41和PDTAL 19数据集中都观察到了GSI抗性蛋白的早期出现(图一)。 3 一个, 5E )我们推测GSI和sotrastaurin的结合对GSI敏感细胞也有协同作用。为了验证这一点，我们研究了它在体内对PDTALL 19的作用。我们用PDTALL 19细胞移植NOD/SCID小鼠，当~1-2%的人CD7白血病负荷时，我们开始治疗。 + 第7天达到外周血。随机化治疗组采用VEAV、GSI DBZ、sotrastaurin或DBZ-sotrastaurin联合治疗。通过对外周血CD5和CD7T-All标记物的常规流式细胞分析，评价白血病的发生发展。经载体处理的小鼠达到人类终点(自然死亡或高于40%cd7阳性(Cd7)的白血病负担)。 + 第15天处死3只小鼠，观察外周血(PB)、脾和骨髓(BM)的白血病负荷。我们观察到两种CD5的百分比都有显着性差异。 + 和CD7 + 细胞在PB联合和单一药物治疗之间(图)。 8A ，补充图。 11A )。在bm中，我们只观察到CD7有显着性差异。 + 细胞(附图) 11B )。脾脏几乎完全浸润在所有小鼠(补充图)。 11C )，但我们观察到，与单一药物治疗相比，联合治疗可显著降低脾脏重量，这直接反映在脾脏大小上(图1)。 8B )。在献祭后，我们进一步观察到，与单一药物治疗相比，联合治疗显着地延长了生存期(如图1所示)。 8C ).
图8：对NOTCHI敏感的细胞中针对Notch和PKC的联合治疗。 a NOD/SCID小鼠注射1×10 6 第1天PDTALL 19细胞随机化，第7天给予载体(CTRL)、谷胱甘肽(GSI)、二苯并氮杂卓(DBZ)、鱼腥草素(Sotra)或雌雄激素+舒张压(DBZ)治疗。服DBZ 4天/停药3天(共4次)。Sotrastaurin方案为5天/2天休假(共5次)。人Cd7的流式细胞仪分析 + 第7天、第11天、第14天和第15天(献祭日)进行外周血细胞计数。所示值均为均值±扫描电镜，无配对双面法进行显着性评价。 t 测试和。车辆 n =6只不依赖生物的小鼠；DBZ n =3 n =5；sotrastaurin+DBZ n =6.补充图提供了门控策略。 12 . b 注射PDTAL 19 15天后，小鼠脾重(上)和大小(下)。所示值均为均值±扫描电镜，无配对双面法进行显着性评价。 t 测试一下。车辆 n =10只不依赖生物的小鼠；DBZ n =3 n =3；sotrastaurin+DBZ n =6。 c PDTALL 19的Kaplan-Meier生存曲线。显着性采用双面对数等级(Mantel-Cox)检验。车辆 n =10只不依赖生物的小鼠；DBZ n =5 n =8；sotrastaurin+DBZ n =5。 d 用大豆黄芩苷(5μM)预处理DND-41，共3d。然后，对3个不同的群体(DMSO+GSI)、Strastaurin洗涤(DMSO+GSI)和Sotrastaurin(Sotra+GSI)进行持续5周的GSI处理(0.5μM)。活细胞计数采用台盼蓝排斥法。 n =2个独立的实验，对持久剂和坚持者/星黄连； n =1代表黄豆素的洗净。 e 在不同时间点(2~5周)取细胞，用所指示的抗体免疫。5A和5b表示第5周内有两个时间点。实验进行了一次。W/O冲洗。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们试图确定GSI-sotrastaurin组合对抗性发育的影响.为此，我们对DND-41亲本细胞进行GSI、星头星素和联合治疗.然后，我们比较了长期的GSI处理诱导的抵抗发展与未处理的和星黄连处理的持久性细胞之间的关系。本实验表明，持续的pkCδ抑制完全消除了耐药持久性细胞生长的拯救作用(图一)。 8D )并诱导了稳定的凋亡反应(如图所示)。 8E )。GSI治疗2周后，P-S6已被上调。相反，cMyc的表达在2-3周后仍然下调，仅在第3周至第4周时才得到保护。GSI与星黄连联合应用时，P-S6或cMyc均未见挽救。为了识别获得的耐药细胞是否是一个预先存在的群体，我们在GSI治疗前先对dd-41亲本细胞进行土司他林处理，然后将药物洗掉。本实验表明，大豆黄芩苷预处理不影响细胞的存活(图一)。 8D )，既无P-S6表达，也无cMyc表达。 8E )。综上所述，本实验表明P-S6是GSI抗性发展的早期标志，它是通过pkcδ(图1)诱导的适应性反应发生的。 9 ).
图9：抑制T细胞内Notch和PKC的图形模型，以防止耐药。 a 在敏感细胞中，NOTCHi导致其转录目标cMyc的下调，而cMyc又以mTORC 1依赖的方式调控S6磷酸化。 b 在长期使用Notch抑制剂后，细胞通过上调pkcδ来适应Notch的缺失，从而磷酸化S6，并以不依赖Notch的方式维持cMyc的表达。 c Notch和pkcδ的激活呈现出一种相互排斥的模式。事实上，大豆皂甙对PKC的抑制导致cMyc表达上调。 d Notch和PKC的联合抑制具有协同作用，完全抑制获得性抗性的发展。
