Pax8和Mecom是卵巢癌的相互作用伙伴

转录因子PAX 8在甲状腺和泌尿生殖系统的发展中起着关键作用。全面的基因组筛选进一步表明PAX 8在肾癌和卵巢癌中具有额外的致癌作用。虽然在不同的背景下已经提出了大量的PAX 8调控基因，但我们仍然缺乏对PAX 8如何参与分子复合物来驱动与疾病相关的致癌转录程序的机械理解。在这里，我们展示了蛋白质异构体起源于梅科姆位点与PAX 8形成复合体。其中包括MDS1-EVI1(也称为PRDM 3)，我们将其与PAX 8在体外和体内的相互作用映射为MDS1-EVI1。我们发现PAX 8结合了大量的基因组位点并形成转录中心。在其中的一个子集，PAX 8和PRDM 3一起调节一个特定的基因表达模块参与粘附和细胞外基质。该基因模块与PAX 8和Mecom在细胞株、患者来源的异种移植(PDXs)和临床病例中的大规模表达相关，并将预后较差的妇科肿瘤进行分层分析。PRDM 3在卵巢癌中被扩增，我们发现Mecom位点和PAX 8在体内维持着肿瘤的生长，进一步证实了Mecom基因在卵巢癌中所识别的功能是PAX 8驱动的致癌功能的基础。

卵巢癌是一种异质性疾病，全世界每年死亡人数超过14万人。1。尽管发展了新的治疗模式，但在过去十年中，卵巢癌患者整体生存率的改善一直是令人沮丧的。2，强调需要确定新的治疗目标，特别是针对与特定遗传变异无关的亚型，例如BRCA 1/2突变。

转录因子(Tfs)是控制谱系特异性基因表达的关键蛋白。3。表观基因组图谱揭示了每一种细胞类型中的一组tfs如何参与高度活跃的调控元件，以驱动对生理或病理细胞状态重要的基因的表达。4。大规模的功能基因组筛选已经确定了肿瘤细胞系特异性增殖所必需的关键tf。5,6在卵巢癌病例中，PAX 8是癌细胞增殖的关键驱动因素。6。Pax8通常被认为是建立小鼠和人类甲状腺滤泡细胞所必需的一种发育性TF。7,8然而，它在癌症中的作用仍在调查中。我们和其他人曾报道过由PAX 8控制的细胞周期和代谢基因表达程序通过与增强子元素结合在肾脏或卵巢癌细胞中。9,10,11。虽然已有大量PAX 8靶基因在生理和病理背景下被报道，但对PAX 8如何发挥其致癌作用的机制理解仍有待于确定。

在这里，我们报告了PAX 8与梅科姆(MDS1-EVI 1复合位点)位点并解剖其功能。梅科姆是一个转录单元，最初由两个主要启动子(500 Kb)组成，驱动MDS 1和EVI 1蛋白的表达。然而，卵巢癌和急性髓系白血病(AML)中经常发生的剪接事件导致mds1-evii 1融合蛋白的表达。12,13,14。由于组蛋白甲基转移酶的PR结构域的存在，该蛋白先前被定义为PRDM 3。12,14。我们证明PAX 8 DNA结合区与大量的基因组位点有关，并且在一小部分位点上，通过它的PR结构域和一组C2H2锌指来招募PRDM 3。这种复合物调节一个特定的基因表达模块，参与细胞粘附和细胞外基质的形成。我们证明PAX 8和Mecom都是维持卵巢肿瘤体内生长的关键因子，Mecom可能作为PAX 8辅助因子介导PAX 8的一部分致癌功能。重要的是，我们定义了一个PAX8-Mecom基因标志，它是妇科癌症患者预后不良的特征。我们的分子解剖分析确定了一种潜在的策略来针对这些致癌因子的相互作用。

Pax8和Mecom居住在同一个综合体中。

Pax8是一种TF，与甲状腺和泌尿生殖道的谱系规范有关。基因筛选显示PAX 8是卵巢的候选癌基因。6和肾癌9通过调控基因表达程序控制细胞周期和代谢基因9,10,11。而PAX 8则通过招募乙酰转移酶来激活基因的表达。15，PAX 8参与诱发其致癌程序的TFs缺乏公正的表征。为了表征PAX 8的相互作用网络，我们使用了BioID系统16，其中原核生物的生物素连接酶Bira被融合到一个感兴趣的基因，允许标记近端参与的蛋白质。为了研究PAX 8，我们在IGROV-1卵巢癌细胞内源性PAX 8位点插入了一枚BioID-HA盒，并利用CRISPR-Cas9(辅助图)对其进行了研究。1A)。将BioID标签与t2A-mCherry盒融合后，FACS可对阳性整合物进行富集，PAX 8-BioID-HA融合蛋白在大体积种群分析中的出现就证明了这一点(补充图)。1B)。事实上，从这些丰富的种群中获得的克隆在预期的相对分子质量上表现出PAX 8-BioID-HA融合的表达(附图)。1C).

然后将这些细胞用于生物ID实验，用链霉亲和素富集和定量质谱(MS)鉴定PAX 8的近端相互作用。1A)。差异分析显示，106个蛋白质在标记生物素的细胞中特别富集。P值<0.01和LogFC>1)，包括PAX 8本身(图1)。1A和补充数据1)。对所获得的HITS的基因本体论分析表明，参与转录和DNA修复的蛋白质丰富(补充图)。1D)，与PAX 8已知的核角色兼容10,11,17.

对点击列表的进一步检查发现，有几个组蛋白以及与dna损伤有关的蛋白质，以及属于多个配合物的一组不同的染色质修饰物(补充图)。1E)。鉴于PAX 8致癌表型的细胞类型特异性，我们重点研究了在生物ID-MS实验中富集的谱系特异性TFs。我们对mecom特别感兴趣，因为这个基因在卵巢癌中经常被扩增。18。两个最具特征的蛋白质梅科姆位点是EVI 1和MDS1-EVI 1(以下简称PRDM 3)，其不同之处在于有一个N端结构域PR/SET结构域被报道具有组蛋白甲基转移酶活性。19或介导蛋白质与蛋白质的相互作用20在不同的组织中有不同的表达模式。有趣的是，癌症基因组图谱(TCGA)数据集的表达分析显示PRDM 3表达过度EVI 1卵巢癌(补充数字)1F).

Westernblot分析了两个不同的IGROV-1PAX8-BioID克隆，证实了PAX 8对两个Mecom剪接变异体EVI 1和PRDM 3的接近连接(图8)。1C)。内源性免疫共沉淀实验进一步证实了这一点。梅科姆两个细胞系中的变异体和PAX 8。1D)。此外，由于PRDM 3在卵巢癌细胞中的丰富表达，我们证实了PRDM 3在HEK 293细胞中通过外表达的PAX 8和PRDM 3的共免疫共沉淀可以与PAX 8相互作用。1E)，以及用细胞纳米比特法进行互补分析(图1)。1F)。我们的数据表明，PAX 8和Mecom剪接变异体，包括卵巢癌特异性PRDM 3，存在于同一蛋白复合物中。

Pax8dna结合域使prm 3参与二元相互作用。

为了分析PAX 8与PRDM 3相互作用的分子基础，我们利用哺乳动物体外转录-翻译(IVTT)系统，结合Nanobit的相互作用分析，产生了大量的PAX 8突变体。2A)。Pax8由一个称为配对(PRD)的N端DNA结合域、一个保守的八肽(OP)、一个截短的同源结构域(HD)和一个C末端反激活(TA)结构域(图)组成。2A)。与PAX 8 TA结构域的缺失相比，PAX 8 DNA结合区的缺失使荧光素酶信号减弱。2B)同时显示类似的蛋白表达水平(补充图)2A)。重要的是，废除PAX 8 DNA结合能力的点突变不会显著影响它与PRDM 3的相互作用。2B)，表明DNA结合域中的结构元素是PRDM 3结合的必要条件。为了了解pax 8 dna结合区是否足以与prm 3相互作用，我们在一个极小的重组IVTT系统中对每个px 8结构域进行了探讨，再一次耦合到Nanobit(补充图)。2B)。只有PAX 8的PRD结构域在与PRDM 3混合时给出了强烈的相互作用信号，证实PAX 8 DNA结合域足以进行相互作用(图1)。2C)。同样，为了了解PRDM 3的哪些区域参与PAX 8的相互作用，我们用IVTT-Nanobit系统表达了部分重叠的蛋白质片段扫描PRDM 3的整个长度。二维空间)。虽然PRDM 3单结构域的结构不足以实现最大的相互作用，但我们确定了一个包含PR/SET结构域和第一个锌指阵列(ZnF1-7)的结构，以显示与PAX 8 DNA结合域的最佳结合(图1)。2E).

为了验证我们的实验结果，我们在体外表达并纯化了PAX 8蛋白(氨基酸残基9-135)，pdm 3 pr/set和ZnF 1-4结构域(氨基酸残基2-345)(补充图)。2C)。二维核磁共振波谱观测13丙-15N标记的PAX 8在PRDM 3蛋白的加入和所有PAX 8共振的大量谱线展宽时，对一组峰的化学位移扰动(图8)。2F)。在一个补充实验中，在PAX 8上分析了PRDM 3质子光谱的甲基区，我们观察到了峰展宽和由此产生的光谱的变化，这与单独的PRDM 3和PAX 8谱之和有很大的不同(补充图)。二维空间)。这表明了这两种蛋白质之间的相互作用，并主张形成一个独立于DNA存在的二元复合物。作为进一步的测试，我们在PAX 8和PRDM 3之间进行了交联MS。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-MS)观察到的PAX 8-PRDM 3配合物S2E, S2F)。这些物种的肽图谱显示PRDM 3 PR结构域与邻近的ZnF阵列之间存在广泛的分子内相互作用。此外，从这两个区域，我们观察到分子间的交联聚合到PAX 8珠三角区域的后半部分。2G和补充数字S2G和补充数据2)进一步支持PRDM 3的PR和ZnF1-7都是实现与PAX 8最佳结合的必要条件的观点。为了验证我们在细胞中的结构/相互作用发现，我们进行了crispr-tiling筛选。21在卵巢癌和肺癌细胞中。对单个引导RNA(SgRNA)表达的滑动窗口分析显示，针对PAX 8 DNA结合域(尤其是后半部分)的sgRNAs比其他结构域(图1)有更强的缺失。2H)。重要的是，表型是特定于卵巢细胞，而肺癌细胞是惰性的PAX 8靶向(图一)。2H)。综上所述，我们的数据表明，PAX 8和PRDM 3之间存在直接的二元相互作用，涉及PAX 8 DNA结合域和PRDM 3的N端部分。

Pax8招募PRDM 3到染色质

为了确定PAX 8-PRDM 3相互作用对基因调控的功能影响，我们在NIH：OVCAR 3卵巢癌细胞上进行了PAX 8和PRDM 3染色质免疫沉淀测序(芯片-seq)(用抗PRDM 3 PR结构域的抗体)。这表明PAX 8位于30,000多个基因组区，而我们检测到了7600个PRDM 3位点(如图所示)。3A)。重要的是，这些PRDM 3位点(>60%)也与PAX 8结合，认为这两种因素共同作用于染色质，进一步证实了它们之间的紧密联系(图1)。3A，补充图S3A，以及补充数据3)。无论是基序富集还是新的基序发现，都很容易发现PAX基序在PAX 8中显著富集。+和PAX 8+PRDM 3+地点(图1.3B)。同时，我们没有发现所报道的Mecom基序的证据，表明PRDM 3通过PAX 8结合与染色质结合。

接下来，我们询问这两种因素的染色质结合是否以依赖或独立的方式发生。为了达到这个目标，我们在下调另一个因素的基础上，为每个因素执行了芯片-seq。RNA干扰(RNAi)基因敲除通过芯片定量实时PCR(芯片-qPCR)对所选择的基因座进行验证(补充图)。3B)。随后的差异结合分析显示，在PAX 8基因敲除后，PRDM 3显示出全球占用率的丧失(如图所示)。3C，D)尽管总蛋白水平略有变化(补充数字)3C)。相反，Mecom基因敲除对PAX 8在全基因组范围内的占用率没有显著影响(图1)。3C，D)。这些结果记录了PAX 8在在公共基因组位点上作为辅助因子的PRDM 3/Mecom的招募过程中所起的作用。

然后，通过荧光标记蛋白的瞬时表达和共聚焦显微镜分析PAX 8和PRDM 3的核分布。Pax8-egfp在细胞核中分布不均匀，形成了类似转录凝聚体的中枢状结构。22(无花果)3E)。在这些集线器中，~40%的PAX 8分子不能流动，可见光漂白后的荧光恢复(FRAP)。相反，PRDM 3的核表达更加均匀，在PAX 8集线器上，光漂白后迅速扩散(图1)。3E)。这表明PAX 8蛋白分子在枢纽状结构中有很强的连锁作用，并且PRDM 3具有更多的动态结合作用，可能是PAX 8的辅助因子。

接下来，我们要定义PAX8-mecom复合物引起的转录影响，并在沉默的情况下进行rna测序(rna-seq)。帕克斯8或梅科姆在一个由五个卵巢癌细胞系组成的小组中，显示出对这两种细胞的最高敏感性。帕克斯8和梅科姆击倒(见下文)。在短发夹RNA(ShRNA)诱导后4天，用多西环素诱导的发夹进行转录分析。帕克斯89两个独立的发夹梅科姆显示类似的目标击倒效率(附图)三维空间和补充数据4)。为了鉴定px 8-mecom的共同靶基因，我们回归了潜在的细胞特异性效应，鉴定了一组在沉默时表现出显著变化的58个基因。帕克斯8或梅科姆(无花果)3F)。路径富集分析表明Pax8-Mecom基因模块在细胞外基质、局灶粘连和肿瘤生长因子-β信号(补充图)中的功能基因中显着地富集。3E)。重要的是，帕克斯8或梅科姆耗竭对这个基因集的调节是一致的，当消耗时效果更强。帕克斯8辩称梅科姆作为辅助因素来调节帕克斯8目标基因。为了了解这种效应在体内是否能被重新调节，并且不限于培养的细胞系，我们在裸鼠体内注射NIH：OVCAR3-shPAX 8/shMECOM细胞(各有两个独立的发夹)，并用载体或多西环素进行转录谱分析(补充图)。3F)。重要的是，同样在体内，我们鉴定出的基因集受到两个基因的调节。帕克斯8和梅科姆(无花果)3F和补充数据4和，再一次，shPAX 8微扰诱导更强的转录调控，尽管有较轻的敲除效率(图一)。3F和补充图S3F)。综上所述，我们的数据表明PAX 8是卵巢癌细胞中的一种主要TF，它参与了大量的基因组位点，而PRDM 3(Mecom)是由PAX 8在特定的基因组位点上特异地参与调控一个确定的共同基因模块。

Pax8和PRDM 3促进卵巢肿瘤生长

大规模的功能基因组筛选已将PAX 8列为卵巢癌的依赖物。6。鉴于我们发现Mecom是PAX 8的一个相互作用体，我们在这样的基因筛选数据集中评估了它们之间的关系。我们使用depmap(依赖图)的rna i或crispr数据集，观察到在卵巢模型中，最敏感的细胞株是帕克斯8击倒/击倒(Ko)也是最敏感的。梅科姆扰动(图1.4A和补充图S4A)。我们用独立的基因试剂对多个细胞系进行了集落形成分析，严格检验了这些发现(补充图)。4B)。.的特征帕克斯8-敏感线是高表达水平的梅科姆，这意味着有那么高的可能性梅科姆表达式可能是生物标记物帕克斯8敏感性(图1.4A和补充图S4A).

接下来，我们问Pax8/Mecom依赖可以在体内异种移植模型中被重新描述。应用含多西环素诱导shRNAs的NIH-OVCAR 3细胞帕克斯8或梅科姆证实帕克斯8沉默会导致深刻的倒退(如图所示)。4B)，同时梅科姆丢失导致肿瘤生长停滞/停滞(图一)。4C)。这些不同的反应帕克斯8或梅科姆击倒意味着较弱的贡献梅科姆对卵巢癌的生长，可能是因为它的辅助因子活性。重要的是，在长期有效的消融帕克斯8在体内，我们观察到Mecom蛋白的显著丢失。4D)，而后者的沉默使PAX 8水平不受影响(补充数字)4C)。这些数据与PAX 8在在一个公共位点子集上招募PRDM 3到染色质中的作用是一致的。

然后，我们将我们的发现扩展到大规模的细胞株和患者源性异种移植(PDX)的表达谱。当模型按签名分数排列时(Pax8-Mecom基因模块从体外/体内的RNA-seq在图中。3E)，我们观察到帕克斯8和梅科姆“表达(补充数字)4D，E)，扩展了这样的概念，即PAX 8和Mecom对特定签名的控制在一大组模型中是一致的。另外，通过结合tcga高级别浆液性卵巢癌(Hgsoc)病例(n=430)帕克斯8或PRDM 3表达四分位数，我们观察到高的病例帕克斯8和梅科姆与其他人相比，表达式显示出更高的签名分数(见图)。4E)。卵巢癌和子宫内膜癌患者的生存率分析表明，与低评分(下四分位数)的患者相比，表现出高信号评分(上四分位数)的患者的生存率明显下降，提示PAX 8/Mecom活性高的病例可识别出具有特别侵袭性肿瘤的患者的子集。

我们在这里报告了PAX 8与梅科姆基因产物PRDM 3利用细胞、生化和生物物理等方法，我们将这种二元相互作用映射到PAX 8 DNA结合域、PRDM 3 PR结构域和ZnF 1-7。我们证明PAX 8与大量的基因组位点结合是因为它的核中心状分布，而PRDM 3则被招募到PAX 8的一个子集来驱动参与细胞外基质和细胞粘附的基因表达模块。重要的是，PAX 8和Mecom是卵巢肿瘤在体内生长所必需的，它们的特征区别于预后较差的一组患者。

Pax8最初被认为是甲状腺发育的关键TF。帕克斯8Ko小鼠因缺乏甲状腺滤泡细胞而死亡8，而px 8 dna结合区突变的人类只会发展出一个较小但活跃的甲状腺。7提示以PAX 8为靶点的抗癌治疗可能具有良好的疗效指标。重要的是，甲状腺缺陷帕克斯8用左旋甲状腺素可拯救Ko小鼠，显示泌尿生殖道缺陷所致不孕表型。23,24。PAX 8在输卵管分泌上皮细胞中的表达25, 帕克斯8KO雌性小鼠表现出形态发育缺陷，导致子宫无功能。重要的是，当卵巢癌中经常发生的遗传损伤是在帕克斯8+FTSEC，发生类似HGSOCs的肿瘤25,26表明PAX 8在HGSOC原发细胞中表达。PAX 8是卵巢发育和癌变的关键驱动因素，而转录和表观基因组图谱则强调了正常和癌变FTSECs基因表达程序之间的巨大差异。10,11表明PAX 8活性而非表达可分化卵巢细胞的病理状态。

Pax8已被证明与甲状腺特异性Tf-1(也称为NKX 2-1)相互作用。27。在卵巢癌中，据报道PAX 8与河马通路效应剂Yap和tead相互作用。10。虽然我们也在PAX 8芯片-seq数据集中观察到TEAD基元的强烈富集，但我们的研究集中于Mecom相互作用，因为我们在BioID实验中很容易发现它，并证明Mecom对于体内肿瘤的生长是必要的。因此，人们很容易推测，更大的PAX 8复合物(包括几个TFs)可以共存于卵巢癌细胞中，每个细胞都有潜在的位点和功能特异性。

Mecom由于其转录单元的复杂性而引起了人们的特别兴趣。最初分类为两个独立的单元，分别编码500 kb。MDS 1和EVI 1基因，后来被重新注释为一个统一的单位，因为剪接变体的表达，其中包括外显子从两个基因座。13。特别是，第二外显子的剪接事件MDS 1第二外显子EVI 1生成包含PR结构域的新蛋白质(MDS1-EVI 1)，因此也被定义为PRDM 3。12,13,14。PR结构域与组蛋白甲基转移酶的序列相似性为20-30%，具有催化活性。12,14。据报道，PRDM 3是细胞质中的一种H3K9me1酶。19然而，由于我们未能检测到本征甲基转移酶的活性，我们将重点放在PR结构域参与蛋白质-蛋白质相互作用的可能性上。20。我们的生物化学和生物物理分析表明，有一个很大的界面，包括PR结构域和第一组PRDM 3锌指(通常涉及序列特异性dna结合)。28)包含PAX 8 DNA结合域的第二部分(称为红色)。虽然这种相互作用类似于PRDM 14 PR域与MTGR 1螺旋之间的相互作用29，PRDM 3的ZnF 1-7的参与证实了在缺乏Mecom基序的情况下依赖于PAX 8的PRDM 3的招募。需要进一步的结构和生物物理研究来理解PAX 8、PRDM 3和核小体DNA之间的三维相互作用。

摘要rdm 3(mdm 1-evi)的功能及其启动子活性在造血系统中得到了广泛的描述。30骨发育31。在疾病背景下，PRDM 3被报道为AML的驱动癌基因之一。32,33，其在实体肿瘤中的作用从未被详细探讨过。我们在此报告PRDM 3作为PAX 8辅助因子在卵巢癌中的作用。在这样的疾病环境下，梅科姆位点经历频繁扩增18和PRDM 3如TCGA数据分析所证明的那样，表达(由于位点选择性剪接事件)经常发生。

PRDM 3与PAX 8一起调控细胞外基质和细胞粘附的基因表达模块。最近对FTSEC的单细胞rna-seq分析揭示了细胞的异质性，其特征是特异的信号的表达。34。重要的是，在已识别的基因模块中，与emt相关的基因模块表达于帕克斯8+细胞一旦应用于tcga数据集，就可以识别预后较差的患者群体。34。PAX 8和Mecom正调控的基因也使预后较差的患者分层，这一事实表明PAX 8确实与Mecom合作调节一个促进侵袭性肿瘤表型的基因表达程序。

本研究为进一步研究PAX 8和Mecom作为上皮性卵巢癌的治疗靶点奠定了基础。同时，也有研究表明，化学物质是独立抑制PAx 2-5-8或mecom dna结合结构域的。35,36由于蛋白质的无序/柔韧性以及结构/功能数据的缺乏，对抑制其功能的配体的识别仍然具有特别的挑战性。我们的报告揭示了两个致癌TFs之间以前未被描述的相互作用表面，可能会指导治疗预后不良的卵巢癌患者的新疗法的合理设计。