腹腔巨噬细胞在术后粘连中的细胞屏障功能

术后粘连是导致腹部手术相关并发症的主要原因.暴露在受损腹膜上的纤维蛋白凝块破坏了间皮屏障，容易与周围组织粘附，导致粘连形成。这里我们展示了驻地F4/80高CD 206−腹腔巨噬细胞迅速积聚在病变上，形成“巨噬细胞屏障”，以保护纤维蛋白凝块，以取代失去的间皮。巨噬细胞亚群的耗竭或CD11b的阻断会损害巨噬细胞的屏障并加剧粘连。巨噬细胞屏障通常不足以完全阻止粘附形成；然而，它可以通过白细胞介素-4的治疗或过继转移来增强这一巨噬细胞亚群，从而产生强有力的粘附预防。相比之下，单核细胞衍生的腹腔巨噬细胞并不参与巨噬细胞的屏障.这些结果突出了一个以前不明的细胞屏障功能的一个特定的巨噬细胞子集，也提出了一个创新的方法，以防止术后粘连。

术后粘连是将器官或组织连接在虚拟空间上的病理连接，例如腹膜、心包或胸膜腔。这些都是导致术后并发症的主要原因之一。1。79-93%的接受过腹部或盆腔手术的患者发生腹壁粘连。2,3。这些会引起疼痛和痛苦，并可能导致更严重的并发症，即肠梗阻和女性不孕症。4。术后粘连的唯一有效治疗方法是矫正手术。5，而这个过程是侵入性的，经常导致粘连的复发。6表明预防的重要性。目前最常见的预防术后腹壁粘连的方法是植入或使用生物材料屏障产品，包括人工薄膜、液体或凝胶，使受伤的组织表面与邻近的组织/器官分离。7。然而，这些屏障产品只对一半的病人有效，而且在实用性上也有局限性。8,9,10。因此，非常需要对术后腹壁粘连进行更有效和更广泛的预防性治疗。为了达到这一目的，有必要进一步了解细胞和分子机制支持术后粘连形成。

术后粘连形成的主要起始因素是纤维蛋白凝块的产生。11。在手术相关的损伤后，凝血级联被激活，导致在受损组织表面形成纤维蛋白凝块。12。暴露的纤维蛋白凝块上的粘附聚合位点促进周围组织与其结合。13,14。纤溶酶和纤溶酶原激活剂所起作用的内源性纤溶能力不足以减轻纤维蛋白凝块的形成或粘附的形成。15。以前的研究表明，不同类型的细胞参与了术后粘连形成的初始过程。16,17，包括激活的间皮细胞和中性粒细胞。18,19,20。然而，巨噬细胞在腹腔中的作用仍然存在争议，巨噬细胞是腹膜腔中的一种主要细胞类型。21,22,23,24,25。例如，氯膦酸脂质体引起的腹腔巨噬细胞耗竭可减轻纱布诱导的小鼠腹腔粘连形成。25提示巨噬细胞具有致病作用。另一方面，腹腔巨噬细胞过继转移减少了兔顶叶腹膜肌缺损模型的粘附形成。21表明巨噬细胞具有抗粘附作用。虽然在这些研究中使用的不同物种和/或模型可能是这种自相矛盾的观察的一个原因。26腹腔巨噬细胞的异质性和多样性也可能是这种不一致的原因。

这里我们展示了驻地F4/80高CD 206−腹腔巨噬细胞，但未招募F4/80低层CD 206+巨噬细胞，具有形成“细胞屏障”的能力，决定了小鼠术后腹腔粘连的形成。这种以前不明的巨噬细胞屏障是通过CD11b形成的，但通常不足以完全保护暴露的纤维蛋白凝块，从而允许粘附形成。然而，我们描述了以IL-4为基础的治疗能增强巨噬细胞的屏障，并能有效地预防术后粘连，并提出了一种创新的抗粘连策略，该策略基于与传统治疗不同的概念。

术后一天内腹腔粘连形成

我们首先利用小鼠模型研究了与腹腔粘连形成有关的局部细胞动力学，该模型是建立在顶叶腹膜上的缺血按钮的基础上。27(补充图。1A)。用报告的粘附评分系统评估粘连的严重程度。4,28。该模型显示缺血按钮与周围组织之间的粘连早在术后第1天就形成了(补充图)。1B，c)。苏木精和伊红染色组织学观察显示，缺血按钮表面的间皮层在第1天被破坏，有核细胞聚集在按钮表面，其形态与原始间皮细胞不同(图1)。1)。在粘连形成部位，间皮层在第1天丢失，结缔组织与细胞浸润形成结缔组织，结合缺血按钮和周围组织，即肠。

F4/80+CD 206−巨噬细胞聚集在纤维蛋白凝块上

为了鉴定缺血按钮表面积累的细胞，我们首先用术后第1天无粘连的缺血按钮标本对F4/80和podoplanin(PDPN)进行了免疫组织化学荧光染色。结果显示，缺血按钮的腹膜表面有明显变化。邻近和远离缺血按钮的顶叶腹膜完全被PDPN所屏蔽。+间皮细胞单层，而相比之下，按钮的腹膜表面大部分被F4/80的单层所覆盖。+巨噬细胞代替PDPN+细胞(图1.2A)。然后，我们进一步进行了每个缺血按钮的分析，同时采用整体贴装和横断面免疫组织化学荧光染色。在手术之前，一层PDPN+间皮细胞29以鹅卵石状的形态完全覆盖了顶叶腹膜，而这些pdpn的大部分。+术后第1天，细胞从按钮表面消失(如图所示)。2B-d)。另外两种间皮标记物的免疫染色进一步证实了间皮细胞的消失。29、细胞角蛋白19和间皮素(附图)。2A，b)。破坏的间皮细胞层用PDPN重建。+第5天的细胞。2B-d)。观察到在缺血按钮表面形成纤维蛋白凝块，并在第3天达到高峰(图3)。2C)。值得注意的是，F4/80+巨噬细胞聚集在这些病变上，似乎替代了破坏的间皮屏障，尽管部分(50%-65%的表面积覆盖；图1。二维空间)。这些巨噬细胞特别定位于暴露的纤维蛋白凝块的表面，因此在第3天屏蔽了60%的暴露纤维蛋白凝块的表面积(补充图1)。2C)并显示出吞噬能力(附图)。3A，b)。此巨噬细胞屏障于第5天被清除，当间皮屏障被重建时，巨噬细胞屏障被清除。

我们发现F4/80+在按钮表面积聚的巨噬细胞CD 206呈阴性(补充图)。4)。相反，CD 206+第3天后在缺血按钮组织中观察到F4/80弱阳性细胞，表明这两种巨噬细胞亚群有区别。此外，在缺血按钮与周围组织之间形成腹腔粘连的病变部位，F4/80的积聚减少。+纤维蛋白凝块上的巨噬细胞被注意到(图中所示)。2E)。这些结果共同表明，由F4/80组成的细胞屏障+CD 206−裸露纤维蛋白凝块上的巨噬细胞可能有助于减少术后粘连形成。

腹腔巨噬细胞亚群有明显的动态变化

然后用流式细胞仪分析了腹腔巨噬细胞在术后腹腔粘连形成过程中的表面表型。与上述组织学表现一致的是，两种主要的巨噬细胞亚群F4/80。高CD 206−和F4/80低层CD 206+子集被识别出来(图中所示)。3A，b，以及附图。5)。这两种巨噬细胞亚群，但不是F4/80低层CD 206−，F4/80−CD 206+或F4/80−CD 206−腹膜细胞，表现出明显的吞噬活性。3C，d)。值得注意的是，F4/80高CD 206−腹腔液中以巨噬细胞为主(约占腹腔液细胞总数的40%)，手术后4h，巨噬细胞几乎被清除，仅占腹腔液细胞的1%。3A，b)。这种清除在手术后24小时更明显，在24小时内这些细胞很难被检测到。我们推测F4/80的损失高CD 206−液体中的巨噬细胞是由于这些细胞牢固地附着在缺血按钮上的纤维蛋白凝块上(见图)。2A-d)。F4/80高CD 206−巨噬细胞亚群在第5天大部分在腹腔液中重组。另一方面，F4/80。低层CD 206+巨噬细胞很少出现在未成熟的腹腔液中，但在第1天可检测到巨噬细胞，占腹腔液细胞的3%，在第3天达到高峰。在研究的整个时间过程中，F4/80的数量。低层CD 206+巨噬细胞与F4/80相似或小于F4/80。高CD 206−巨噬细胞3B)。这两种腹腔巨噬细胞亚群均表现出组织修复相关基因的高表达和促炎症或血管生成相关基因的低表达(补充图)。6a，b)。与其他子集相比，F4/80高CD 206−巨噬细胞体积较大，并表现出较高的mRNA或蛋白表达。GATA 6, Tgfb 2，Ucp 1，和ICAM 2(图1.3E和补充图。7a，b)，被报道为留置腹腔巨噬细胞的标记物。30,31,32。相反，较小的F4/80低层CD 206+巨噬细胞具有较高的CCR 2和MHCII表达(附图)。7b)，表明他们的身份是单核细胞衍生的，招募了巨噬细胞。32,33.

为了研究其他单核/巨噬细胞亚群或粒细胞有能力覆盖纤维蛋白凝块的可能性，我们对缺血按钮形成后的腹腔细胞进行了进一步的研究。结果表明：F4/80低层CD 206−细胞包括Ly6C高经典单核/巨噬细胞，Ly6C低层非经典单核/巨噬细胞和西格勒克-F+嗜酸性粒细胞，而Ly6G+在F4/80中发现中性粒细胞−CD 206−人口(附图)8a，b)。然而，这些细胞类型并没有积累在按钮表面(补充图)。9A)。此外，累积F4/80+纤维蛋白凝块上的巨噬细胞对巨噬细胞标志物ICAM 2呈阳性反应。9B，c)。尽管如此，仍有一种担心，即所招募的单核/巨噬细胞或粒细胞不能覆盖纤维蛋白凝块，因为它们在最初形成粘附时(术后<24小时)发生得太少。因此，我们进一步评估了所招募的单核/巨噬细胞参与“重复缺血按钮生成模型”(补充图)中细胞屏障形成的能力。10a，b)。在这个模型中，我们在第一次在左侧腹膜壁上创建缺血按钮后的第3天，在右侧腹膜壁上创建了一个额外的缺血按钮。这一模型使我们能够更准确地研究收集到的单核/巨噬细胞的能力，因为在第3天，这些细胞在腹腔中的出现比一般细胞屏障形成的时间要丰富得多。结果表明，即使单核/巨噬细胞或粒细胞增多，也不参与细胞屏障的形成。这些结果共同证实，只有驻留的巨噬细胞有能力覆盖纤维蛋白凝块。

巨噬细胞耗竭加剧粘连

接下来，我们利用耗竭策略研究了腹腔巨噬细胞在术后粘连形成中的作用。根据以前的报告34,35，我们调整了预注射氯膦酸脂质体的方案，使F4/80常驻。高CD 206−腹腔巨噬细胞在手术时被耗尽(如图所示)。4A)。这一协议并没有减少被招募的F4/80人数的增加。低层CD 206+术后腹腔巨噬细胞(附图)。11A，b)。通过这种氯膦酸脂质体的治疗，我们发现缺血按钮产生后腹部粘连明显加重，纤维蛋白凝块的覆盖率降低了F4/80。+巨噬细胞4B-f)。重要的是，间皮破裂的程度或纤维蛋白沉积的数量没有受到影响(图)。4G-I和补充图。11C)，建议居民F4/80的耗竭高CD 206−腹腔巨噬细胞不影响纤维蛋白的形成或降解。与此相一致的是，主要的亲或抗纤溶因子组织纤溶酶原激活剂(Tpa)。36或纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)37，在腹腔液中不受氯膦酸脂质体治疗的影响(图一)。4J，k)。这些数据表明，居民F4/80高CD 206−腹腔巨噬细胞通过减少纤维蛋白凝块作为细胞屏障的暴露，而不是通过影响纤维蛋白的产生或纤溶，从而减少术后腹腔粘连形成。

巨噬细胞通过CD11b结合纤维蛋白凝块

为了了解纤维蛋白凝块吸引腹腔巨噬细胞的机制，我们用TISEEL纤维蛋白胶试剂盒(Baxter)在小鼠腹腔内植入了一种体外产生的纤维蛋白凝块(附图)。12A)。因此，观察到大量驻留的腹腔巨噬细胞聚集在植入的外源性纤维蛋白凝块表面，类似于在缺血按钮上发现的纤维蛋白凝块(图1)。5A，b)。半数以上的外源性纤维蛋白凝块表面被累积的腹腔巨噬细胞覆盖。这表明纤维蛋白凝块本身具有吸引腹腔巨噬细胞的能力。

我们假设CD11b(整合素αM)调节小胶质细胞与纤维蛋白的结合。38，可能在腹腔巨噬细胞与纤维蛋白凝块的相互作用中起作用。居民F4/80高水平CD11b的表达高CD 206−腹腔巨噬细胞得到证实(附图)。12b)。此外，邻近连接试验(PLA)检测到F4/80上纤维蛋白和CD11b之间有清晰的PLA信号。+巨噬细胞5C)，但不介于纤维蛋白与F4/80之间(补充图1)。12C)。此外，腹腔注射抗CD11b的阻断抗体(克隆；5C6)39增强了腹腔粘连，与F4/80的消失相对应。+纤维蛋白凝块上的巨噬细胞。5D-g)。此外，上述居民F4/80的短暂失踪高CD 206−术后1天腹腔液中的腹腔巨噬细胞。3A，b)被阻断CD11b，而被招募的F4/80发生。低层CD 206+腹腔液中的腹腔巨噬细胞未受影响(附图)。12D，e)。因此，我们得出结论，居民F4/80的积累高CD 206−损伤腹膜上的纤维蛋白凝块直接通过CD11b获得腹腔巨噬细胞。

IL-4通过增强巨噬细胞屏障减少粘连。

鉴定了F4/80居民的细胞屏障功能高CD 206−腹腔巨噬细胞，这种自然发生的过程是不足以防止腹腔粘连(图一)。1和补充图。1B，c)。因此，我们探讨了是否强制增加驻地人员F4/80高CD 206−腹腔巨噬细胞将导致强有力的预防术后粘连形成。我们证实腹腔注射长效IL-4复合物(IL-4c)。40增加驻地人数F4/80高CD 206−腹腔巨噬细胞大约三次。6a，b)。这种IL-4c治疗确实导致术后粘连的形成明显减弱，暴露的纤维蛋白凝块被F4/80覆盖更多。+巨噬细胞6C-f)。组织学检查显示腹腔膜间皮细胞或缺血按钮病变上的纤维蛋白沉积不受IL-4c注射的影响。6g-i)。此外，IL-4c对腹腔或缺血按钮组织中其他类型的免疫细胞没有影响(补充图)。13A-c)。为支持这一观察，IL-4c不影响术后3天腹腔液中Th1/Th2相关细胞因子的分泌水平，而巨噬细胞源性趋化因子CCl 6/c10则不受影响。41，被上调(附图)。14a，b).

与上一篇报道一致的是，IL-4不仅促进了巨噬细胞的增殖，而且还促进了巨噬细胞的极化。32，IL-4c的管理也增加了被招募的F4/80的人数。低层CD 206+腹腔液中的巨噬细胞。6a，b)，而这个单元格数还不到f4/80的三分之一。高CD 206−巨噬细胞数。排除征聘F4/80的可能性低层CD 206+巨噬细胞参与了术后粘连的减轻，我们从IL-4c注射小鼠中分离出每个巨噬细胞亚群，并在缺血按钮形成时将其过继转移到同基因受体小鼠的腹腔内。如我们所料，领养的F4/80居民高CD 206−腹腔巨噬细胞，但未招募F4/80低层CD 206+腹腔巨噬细胞，明显减少术后粘连。6J，k)。积存相当数量的转移驻地F4/80高CD 206−缺血按钮表面的腹腔巨噬细胞被证实。6L)。这些数据表明，以IL-4为基础的治疗将通过增强保护暴露的纤维蛋白凝块的腹腔巨噬细胞屏障，实现对术后粘连形成的实质性预防。

尽管它具有巨大的临床意义，但细胞和分子过程对术后粘连的形成和(或)预防仍知之甚少。17。在此，在小鼠模型中，我们揭示了以前不明身份的腹腔巨噬细胞通过产生细胞屏障来减轻术后粘连形成的作用(如图所示)。7)。手术侮辱后不久，在受损的腹膜膜上形成粘稠的纤维蛋白凝块，从而失去间皮屏障。这些纤维蛋白凝块捕获驻留的F4/80高CD 206−腹腔巨噬细胞表面通过CD11b介导的结合。这种巨噬细胞的积累导致了细胞屏障的形成，其作用是将粘附的纤维蛋白凝块从周围组织中屏蔽，以取代失去的间皮屏障，从而潜在地减弱粘附形成。巨噬细胞屏障在术后第1天迅速形成，第5天被重建的间皮细胞屏障所取代。与完整的间皮屏障相比，巨噬细胞屏障不足，仅占暴露纤维蛋白凝块面积的60%。因此，术后粘连发生在巨噬细胞屏障不足的病灶上。在临床上，以IL-4为基础的治疗或过继性细胞转移可增强巨噬细胞屏障，从而有力地防止粘附形成，提出了一种创新的抗粘附策略。此外，吸收腹腔巨噬细胞并不参与保护细胞屏障的机制，这为以前未知的关于巨噬细胞复杂多样性的生物学研究提供了线索。

我们证明，在损伤的腹膜上存在的腹腔巨噬细胞的积累是通过CD11b与纤维蛋白的结合而介导的。有报道称，腹腔巨噬细胞通过感测细胞外ATP被吸引到受损的组织中，并在热致肝损伤模型中参与清除死细胞。34。然而，我们观察到，植入体外产生的纤维蛋白凝块，不太可能释放出显著水平的ATP，导致巨噬细胞在其表面积聚，类似于缺血按钮模型中所观察到的那样。此外，除了CD11b和纤维蛋白之间的PLA信号阳性外，用阻断抗体抑制CD11b-纤维蛋白相互作用，还可以消除在缺血按钮受损腹膜上积累的巨噬细胞。综上所述，虽然不能完全排除细胞外ATP和其他因素的作用，但我们的结论是CD11b-纤维蛋白结合是腹腔巨噬细胞聚集在损伤腹膜上的主要机制之一。

本研究的一个有趣的发现是，腹腔巨噬细胞在粘连诱导手术后急剧但瞬间地从腹腔液中消失。在腹腔感染的背景下，巨噬细胞消失反应(Mdr)也出现了类似的现象。42,43。我们也知道腹腔注射脂多糖30酵母35，或巯基乙酸盐44诱导多药耐药，用包括华法林和肝素在内的抗凝血剂预处理可抑制多药耐药。35,42。MDR的基础机制被认为是巨噬细胞聚集到异物或迁移到淋巴管中，而不是巨噬细胞死亡。35,43。我们的研究报告，MDR也发生在术后粘连形成。驻地F4/80高CD 206−腹腔巨噬细胞约占正常状态腹膜液细胞总数的40%，手术后第1天几乎清除。本研究中的一系列组织学检查表明，腹膜液的这种清除是由于这些细胞附着在缺血按钮上的纤维蛋白凝块上。术后第5天，住院的F4/80人群高CD 206−腹腔巨噬细胞在腹腔液中被重组。虽然这些重组巨噬细胞的来源仍不确定，但可能是它们脱离纤维蛋白凝块，从腹膜器官迁移。45，从所招募的单核细胞分化，和/或表型变化从招募的F4/80低层CD 206+腹腔巨噬细胞或其他细胞类型46,47,48.

腹腔巨噬细胞主要分为两大类，即大腹腔巨噬细胞(Lpm)和小腹腔巨噬细胞(Spm)。33。LPM是以稳态为主，通过自我更新而维持在腹腔内的驻留巨噬细胞，具有f4/80。高、CD11b高、MHCII低层、GATA 6高，以及CD 206−表型46,49。相反，SPM是从循环单核细胞中获取的巨噬细胞，并以CCR 2依赖的方式在炎症刺激下产生数量增加的巨噬细胞。30。这些细胞呈F4/80低层、CD11b低层、MHCII高、GATA 6低层，以及CD 206+表型也有报道称，骨髓来源细胞对lpm的性二态补足作用，男性较高，女性很低。48。此外，还有关于这些子集功能多样性的资料。例如，在正常情况下，lpms通过转化生长因子β2调节腹膜B-1细胞介导的肠IgA生成。30。SPMS有能力将抗原呈现给幼稚的CD4。+T细胞50提示SPMs在腹腔感染或炎症过程中可诱导局部T细胞启动。在我们的研究中，F4/80高CD 206−和F4/80低层CD 206+在形态学和基因/蛋白表达方面，巨噬细胞亚群分别表现出与LPM和SPMs相似的特征。30,33,51。然而，还需要进一步的研究才能将这些巨噬细胞定义为LPM和SPMs。

我们观察到相当数量的CD11b+CCR 2+Ly6C高经典单核/巨噬细胞与CD11b+CCR 2+Ly6C低层非经典单核/巨噬细胞，F4/80低层CD 206−，术后第3天出现在腹腔内。不像F4/80高CD 206−和F4/80低层CD 206+巨噬细胞亚群，这些F4/80低层CD 206−细胞群不具有吞噬能力，说明它们不太可能是成熟的巨噬细胞。此外，我们的结果表明，CCR 2+所收集的单核/巨噬细胞不具备形成抗粘附细胞屏障的能力。另一方面，有报道表明，用蛋白胨预处理或移植蛋白胨诱导的腹腔巨噬细胞对粘附形成有保护作用，提示单核细胞源性炎性巨噬细胞在一定条件下可能具有抗粘附作用。21。据推测，单核巨噬细胞的这种作用可能是通过与细胞屏障形成不同的机制来实现的，包括调节炎症、纤维蛋白形成、纤溶和/或空泡化，以及粘附组织的纤维化。21,22,23,24,25.

众所周知，IL-4在免疫系统中起着多种作用。52。我们发现腹腔注射IL-4c可以通过增加F4/80的数量来减轻术后粘连的形成。高CD 206−留置腹腔巨噬细胞。IL-4c处理的F4/80过继转移高CD 206−巨噬细胞导致了类似的粘连衰减。另一方面，IL-4c不影响腹腔液中非巨噬细胞类型(包括淋巴细胞)和主要Th1/Th2相关细胞因子的数量。因此，我们认为腹腔巨噬细胞屏障是白细胞介素-4c(IL-4c)抗粘附作用的核心机制。然而，我们不能排除白细胞介素-4(IL-4)对这些细胞的功能改变的可能性，这将调节粘附形成的过程。采用细胞特异性IL-4受体基因敲除小鼠，可以进一步阐明细胞对IL-4的依赖性反应及其对粘附形成的影响。值得注意的是，先前的一项研究报告称，IL-4基因敲除并不影响小鼠术后的粘连。24表明内源性IL-4不太可能在粘附形成中起关键作用。

本研究的结果对开发一种新型的抗粘连策略具有重要的临床意义。为了防止术后粘连的形成，我们测试了一系列药理学药物，包括纤溶药、非甾体抗炎药、类固醇、抗氧化剂、组胺拮抗剂和他汀类药物，但迄今为止，这些药物都没有在临床上取得成功。53。相反，目前正在进行生物材料屏障产品的植入/使用，以防止粘连。7。然而，该方法在有效性和实用性方面存在明显的局限性。8,9,10。巨噬细胞屏障可能比以生物材料为基础的屏障具有多种重要优势。巨噬细胞屏障的形成依赖于自然的生理愈合过程，而人工生物材料屏障则与异物反应有关。54。巨噬细胞屏障不存在物理位移的风险，不像生物材料屏障。9,10。此外，巨噬细胞的移动性和灵活性使其能够在整个腹腔的任何位置形成细胞屏障，包括难以进入的定位，即盆腔深处或肠道之间。此外，只要注射一种药物试剂，即IL-4c，就可以获得足够的巨噬细胞屏障，因此可以在任何类型的外科手术中获得，包括开放的、腹腔镜的或机器人的手术。进一步发展这种创新的治疗，以防止术后粘连，这是基于以前未知的概念巨噬细胞屏障，是有必要的。为此，必须确认本研究结果的普遍性。我们使用小鼠缺血按钮模型，因为它在诱导可复制的腹腔内粘连方面有着重要的优势。55。事实上，这个模型为我们的研究提供了可靠和充分的粘着形成。作为下一步的临床应用，将需要使用不同的模型，特别是大型动物模型的研究，以及对人类细胞的研究