甲型H1N1流感T细胞表位识别及对蛋白-O-甘露糖基转移酶1蛋白的交叉反应

嗜睡症1型(NT1)是一种慢性神经系统疾病，与HLA-DQB 1*0602有很强的相关性，提示有免疫学起源。据报道，接种AS 03佐剂补充的甲型H1N1流感疫苗潘德母克斯疫苗的儿童或青少年中NT1的风险增加。在此，我们发现儿童潘德母线相关的NT1患者对病毒表位神经氨酸酶175-189(NA)的T细胞免疫增强。175–189)和核蛋白214-228(NP)214–228)，但也会对NA作出响应。175–189-模拟，脑自表位，蛋白质-O-甘露糖转移酶1(POMT 1)675–689)。流感病毒特异性T细胞和T细胞交叉反应性在NT1中的致病作用是由IFN-γ、穿孔素1和颗粒酶B的上调和T细胞受体TRAV 10/TRAJ 17和TRAV 10/TRAJ 24克隆型的融合选择支持的。175–189或POMT 1675–689。此外，抗POMT 1的自身抗体在接种潘德梅克斯疫苗的儿童或青少年中增加.这些结果表明POMT 1是NT1中T细胞和B细胞识别的一种潜在的自身抗原。

嗜睡症1型(NT1)是一种罕见的慢性脑疾病，其特点是白天嗜睡过度、昏昏欲睡和夜间睡眠紊乱。1,2,3。NT1与人类白细胞抗原II类等位基因的异常高度关联DQB 1*0602，编码T细胞受体α-链、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)启动子、肿瘤坏死因子受体2和P2Y11受体的基因多态性，强烈提示了本病的免疫学起源。4,5,6,7,8。尤其是T细胞介导的导致hcRT信号受损的机制参与了nt1的形成。4,9,10,11。据报告，有几个欧洲国家增加了NT1的风险，2009/10年度接种了AS03佐剂补充的甲型H1N1流感疫苗(Pandemrix)的儿童和青少年。12,13,14,15。我们以前曾报道过，潘德母线相关的NT1患者对潘德母线疫苗中存在的甲型流感病毒蛋白有更强的抗体应答。16。这表明后来发展出NT1的接种者也可能对潘德母线产生了异常的T细胞反应。进一步，我们假设由甲型H1N1流感病毒肽启动的CD4+T细胞与CNS自身抗原发生交叉反应，并在NT1中组织一次免疫介导的对次生质神经网络的攻击。

在这里，我们证明了增强的T辅助1(Th1)细胞/细胞毒性T细胞反应在潘德母线相关的NT1患者对不同的病毒NA和NP肽表位。患者来源的T细胞也对脑表达蛋白-O-甘露糖转移酶1(POMT 1)中的一个自表位作出反应，该表位代表患者强烈识别的NA T细胞表位的肽模拟。外周血单个核细胞(PBMC)基因表达谱密切匹配，TCR谱分析检测到NA或POMT 1肽刺激对相同克隆型的上调，从而支持病毒导向的自身反应性T细胞克隆型在NT1中的分子模拟和致病作用。最后，接种者提高了抗人POMT 1的抗体水平，提示Pandemrix疫苗可触发POMT 1自身免疫。这些发现提供了甲型H1N1流感病毒诱导的T细胞免疫与NT1自身免疫的发展之间的联系。

流感病毒HLA-DQ6.2转基因小鼠及HLA-DQB1*0602阳性个体的T细胞表位筛选

为确定流感病毒A(H1N1)T细胞表位在Pandemrix相关的NT1中的分布，制备了15-聚肽，分别覆盖流感的血凝素(HA)、NA和NP(A/Re杂合物/NYMC X-179A(California/07/2009×NYMC X-157)(H1N1))。T细胞表位发现的实验设计如图所示.1。首先，我们筛选了T细胞对肽池的反应(补充数据)。1)用脾细胞接种HLA-DQ6.2转基因小鼠。17。以干扰素-γ(IFN-γ)和(或)白细胞介素-2(IL-2)mRNA或蛋白质(荧光多重珠免疫分析法)的上调作为读出(图1)。2A-C)。作为第二步，在Pandemrix免疫的HLA-DQ6.2小鼠脾细胞中检测刺激IFN-γ或IL-2上调的单个肽对T细胞的反应性(附图)。1A-C)和外周血单个核细胞(PMBC)从Pandemrix接种HLA-DQB 1*0602阳性个体(睡眠临床对照病人，未诊断为NT1；图1。二维f；补充表1)。来自HA、NA或NP的单个T细胞肽刺激小鼠或HLA-DQB 1*0602阳性个体的IFN-γ上调，被确认为随后T细胞分析的抗原，并与NT1患者和对照组进行比较(补充表)。2).

Pandemrix相关NT1患者甲型H1N1病毒T细胞表位的鉴定

为了剖析甲型H1N1流感的T细胞免疫，pbmc来自一组特征良好的芬兰儿童pandemrix相关nt1病例，以及健康年龄匹配的pandemrix免疫对照儿童(表)。1、补充表3A，B)，用从HA、NA或NP(补充表)中预先选择的15-聚肽组进行刺激。2)。有趣的是，Pandemrix相关的NT1患者与健康接种者相比，有两个病毒T细胞表位被不同程度地识别和诱导出较高的IFN-γ和IL-2应答。这些表位是AWSASACHDGINWLT(NA)178–192)和KTRIAYERMCNILKKFQ(NP)214–231)。表位AFAMERNAGSGIIIS(HA)271–285)和MERNAGSGIIDTP(医管局)274–288)，以前与NT1相关联。18但IFN-γ和IL-2的应答相对较低，患者与健康接种者之间无显着性差异(图二)。3A-f，补充图。2A-F)

接下来是AWSASACHDGINWLT(NA)178–192)和KTRIAYERMCNILKG(NP)214–228)表位被定位在芬兰儿童潘德里克斯相关NT1患者的验证队列中，以及健康年龄匹配的潘德梅克斯疫苗接种对照组(表)。1、补充表3A，B)。T细胞分析中的15-聚肽重叠刺激表明AWSACHDGIN(NA)178–189)和IAYERMCNILKG(NP)217–228)是T细胞核心表位。4A，d，补充图。3A，D)。有趣的是，AWSACHDGIN(NA)178–189)表位包括WSASACHD(NA)179–186)，一个甲型H1N1流感B细胞表位，通过噬菌体展示-模拟表位变异分析，与潘德梅克斯相关的NT1患者血清发生反应。19.

NT1和NT1患者对甲型H1N1流感抗原表位的差异T细胞反应HLA-DQB 1*0602阳性或阴性健康疫苗接种者

T细胞对表位NA的反应175–189纳178–192，和NP214–228NT1组强于两组HLA-DQB 1*0602阳性或阴性对照(NT1患者发现和验证队列的组合；图1。4B、c、e，补充图。3B、C、E)。纯合性HLA-DQB 1*0602似乎没有增加对这些T细胞肽的反应。HLA-DQB 1*0602NT1杂合子患者。相反，T细胞对HA的反应271–285和HA274–288NT1患者与对照组相比无明显增加，而对NP的反应无明显增加。217–231NT1患者仅与HLA-DQB 1*0602阴性，但不是阳性对照(补充图)。4A-D、图1.4F，补充图。3F)。结果表明NT1患者对NA的T细胞反应异常强烈。175–192和NP214–228病毒抗原表位对Pandemrix疫苗的反应，这不仅仅是HLA分子限制的结果DRB 1*1501-DRB 5*0101-DQA 1*0102-DQB 1*0602单倍型这些发现与我们先前报道的NT1患者对潘德母线病毒蛋白的抗体反应增强相一致，并与携带HLA-DQB 1*0602等位基因16.

从NA和NP中寻找与甲型H1N1流感T细胞表位同源的人类蛋白序列

为了确定可能的交叉反应自表位，我们对人类蛋白质组(BLASTP)的12-聚肽进行了基本的局部比对.IAYERMCNILKG(NP)序列相似性搜索217–228)和ESVAWSACHD(NA)175–186)产生的同养素γ-1(YEIMCKILK，SNTG 1)的最高点击率338–346；E-值2.0，75%的查询覆盖率，78%的标识)和蛋白-O-甘露聚糖转移酶1(VAWYSSACH，POMT 1)681-689；E值0.083，查询覆盖率75%，标识78%).这两种蛋白质都在人脑中表达。

Pandemrix相关NT1患者甲型H1N1病毒交叉反应性T细胞自表位的发现

为了检测免疫交叉反应性，我们对sntg 1和POMT 1中的Blastp识别的两个可能的自表位进行了重叠的15聚肽T细胞分析。2)。有趣的是，干扰素-γ对肽IFSALVVAWYSSACH(POMT 1)的反应增强。675–689NT1患者(p < 0.01, Fig. 5A；补充图。5A)。提示POMT 1可以代表NT1中的自身抗原。T细胞对肽NA的反应175–189、纯合性HLA-DQB 1*0602似乎没有增加对POMT 1的响应675–689超过达到的水平HLA-DQB 1*0602NT1杂合子患者。相反，肽RAEKTFSVYIMCKI(SNTG 1)330–344)仅由一名NT1患者和接种过疫苗的对照组(注：图1)确认。5B；补充图。5B).

干扰素-γ对肽NA的反应175–189和POMT 1675–689，或NA178–192和POMT 1675–689,显示了相关性，进一步暗示了特异性病毒定向T细胞与NT1中这个自表位的交叉反应(Spearman的秩相关系数)。rs=0.511和rs分别=0.778(p=0.078；**p=0.007)。

甲型~(H1N1)NA流感刺激PBMC的转录分析175–189或人类POMT 1675–689提示Pandemrix相关NT1中T辅助细胞活化及具有交叉反应性的细胞毒性T细胞反应

为了进一步表征T细胞对甲型H1N1流感病毒NA和人POMT 1表位的反应，并确定NT1的致病途径，我们研究了病毒NA的基因表达水平。175–189-或人类POMT 1675–689-Pandemrix相关NT1患者和接种Pandemrix疫苗的健康对照者的受刺激PBMC。在RNA测序中，刺激诱导NT1患者与健康对照者发生明显的反应。总共有74个基因被差异表达，要么是对NA的反应。175–189(49个基因)，或POMT 1675–689(28个基因；3个基因重叠，**)p < 0.01; Fig. 6，补充图。6，补充数据2)。结果进一步表明，NT1患者PBMC基因表达谱与这两种多肽反应密切匹配(图一)。6)，且NT1患者PBMC中未见任何一种多肽刺激后PBMC中基因的差异表达。p-水平<0.05)。这些发现证实了IFN-g反应的相关分析，并支持NA和POMT 1之间的T细胞交叉反应.74个差异表达基因的列表中包含了几个与细胞毒性T细胞功能密切相关的基因，例如，干扰素-γ、趋化因子/趋化因子配体已知与干扰素-γ, 穿孔素1，和颗粒酶B。对T细胞效应分子的关注也显示，单个NT1患者的T细胞对病毒NA的刺激有相似的反应。175–189或人类POMT 1675–689，与NT1中自身抗原POMT 1对甲型H1N1流感病毒定向T细胞的交叉反应性一致(图1)。7)。最明显的例子是NT1患者P 003和P 015(图1所示)。6, 7这两种疾病的临床特征都是在接种潘德母线疫苗后4周内迅速发病，白昼嗜睡和晕眩。

此外，rna测序的fcs-排序，NA。175–189刺激CD4+和CD8+T细胞的单个儿童，潘德母线相关的NT1患者(P 003)显示上调干扰素-γ，穿孔素1，颗粒酶B，趋化因子(C-C基序)配体4，和趋化因子(C基序)配体在CD8+T细胞中，CD4+T细胞的基因表达谱主要表现为干扰素-γ(无花果)6；FACS选通和排序策略，如附图所示。7)。总之，基因在NA中的表达175–189-刺激的CD8+T细胞样本符合NA的特征。175–189-刺激PBMC，提示肽NA175–189这一发现与细胞毒性T细胞是介导甲型流感病毒免疫的关键效应细胞群体的观点是一致的。20.

T细胞受体序列分析显示甲型H1N1流感的融合选择175–189-和人类POMT 1675–689-Pandemrix相关NT1中的反应性克隆型

为了在克隆水平上表征T细胞对假定的交叉反应表位的反应，我们对T细胞进行了测序。TCRα链和β链从病毒NA的RNA175–189-或人类POMT 1675–689-Pandemrix相关NT1患者和接种Pandemrix疫苗的健康对照者的受刺激PBMC。TRA变量(TRAV)、TRA连接(TRAJ)、TRB变量(TRBV)、TRB多样性(TRBD)，和TRB加入(TRBJ)基因片段的使用在肽刺激样本和中对照样本之间没有显着性差异，无论是在患者中还是在对照组中(补充数据)。3)。我们鉴定了在≥3 nt1患者标本中被上调的trA克隆型，它们中的任何一种都受到NA的刺激。175–189或POMT 1675–689肽(图1.8)。在这些公共的TRA阵挛型中，6个阵挛型在NA刺激下显著增加。175–189，或POMT 1675–689(假阳性率<0.05)，进一步支持T细胞交叉反应性.最引人注目的是，clonotype CVV沙IKAAGNKLTF-TRAV 10/TRAJ 17和CVV萨姆TTDSWGKFQF-TRAV 10/TRAJ 24在8中的3(3/8)NA中被上调。175–189-受刺激，10人中有5人(10人中有4人)POMT 1675–689-受刺激样本。NT1患者P 003和P 015，其特征为T辅助1(Th1)细胞/细胞毒性T细胞基因在NA刺激下的表达。175–189或POMT 1675–689，两种克隆型对这两种多肽均有上调作用。在刺激后发现了另外三种克隆型，其中至少一种肽刺激后更丰富，并且与上述两种克隆类型中的任何一种都有很高的相似性：cvv。它IKAAGNKLTF-TRAV 10/TRAJ 17，在POMT 1中显著上调675–689-受刺激样本，包括P 003；CVVSGMTTDSWGKLQF-TRAV 10/TRAJ 24，NA上调175–189-受刺激样本，包括P 015；和CVVSGMTTDSWGKFQF-TRAV 10/TRAJ 24，两者均上调175–189-和POMT 1675–689-受刺激样品，包括P 003和P 015。这些结果证明了NA的收敛选择。175–189-和(或)POMT 1675–689-Pandemrix相关NT1患者TRAV 10/TRAJ 17或TRAV 10/TRAJ 24基因片段的反应性T细胞克隆。

图中提供了NT1患者或健康对照者使用TRAV 10/TRAJ 17和TRAV 10/TRAJ 24的公共和私人阵挛型的完整列表。9a，b。结果表明，除了使用TRAV 10/TRAJ 17(CVV)识别的公共克隆类型外，沙IKAAGNKLTF，CVV它IKAAGNKLTF)和TRAV 10/TRAJ 24(CVV)萨姆TTDSWGKFQF，CVVSGMTTDSWGKLQF，CVVSGMTTDSWGKF(Qf)在包括cvv在内的不同nt1患者的肽刺激样本中出现了几种高度相似的克隆型。SMIKAAGNKLTF-TRAV 10/TRAJ 17，CVVSSMTTDSWGKFQF-TRAV 10/TRAJ 24，CVVTVMTTDSWGKFQF-TRAV 10/TRAJ 24和CVVSSLTTDSWGKFQF-TRAV 10/TRAJ 24。所识别的公共阵挛型并不是NT1患者独有的，但也偶尔出现在健康对照者身上。特别是，HLA-DQB 1*0602阴性健康对照HC27在NA刺激的NT1患者标本中有几个克隆型表达上调。175-189或POMT 1675-689。然而，与NT1患者相比，HC27在肽刺激时并没有表现出炎症细胞因子/趋化因子的表达增加(比较图)。4A，b；5a；7)。因此，这些TRAV10-TRAJ17和TRAV10-TRAJ24克隆型可能参与了NT1患者的炎症反应，但当正常人存在时，其功能表型可能受到有效调控。

应用与tra相同的搜索标准，我们还在≥3 nt1患者样本中发现了较少数量的trb克隆型。175–189或POMT 1675–689肽(附图)8)。在这些公共的trb克隆型中，同样有一个克隆型在两个NA中都显著增加。175–189-或POMT 1675–689-刺激病人样本，进一步支持T细胞交叉反应性.该克隆型为CASSEAGQGAYEQYF-TRBV6-1/TRBJ2-7(在P 003、P 015和P 023中上调)。

Pandemrix疫苗接种儿童POMT 1自身抗体的发现

最后，我们用放射免疫分析法(Ria)研究了血浆中POMT 1抗体的水平，这是一种灵敏而特异的液相法，用于检测识别构象表位的自身抗体。21。注射Pandemrix疫苗的儿童(NT1患者和健康对照组)对POMT 1的自身抗体高于未接种的对照组儿童，提示潘德母线对POMT 1(*)有诱导的自身免疫作用。p < 0.0001, Fig. 10表1).

HLA-DQ6.2-限制性CD4+T细胞与NT1发病机制的遗传学研究4,5。CD4+T细胞在许多自身免疫性疾病中发挥着重要作用，例如腹腔疾病和1型糖尿病。这两种疾病表现出异常强烈的HLAⅡ类关联。22，在NT1中仍将被超越。HLAⅡ类自身免疫性疾病被认为是抗原驱动的疾病(例如，由小麦醇溶蛋白在腹腔疾病)，尽管组织病理学不是由CD4+T细胞介导。其他免疫细胞参与组织破坏，抗原扩散导致广泛的自身免疫。在pandemrix相关的NT1中，我们假设由甲型H1N1流感病毒抗原表位启动的CD4+T细胞是疾病驱动因子，与中枢神经系统自身抗原发生交叉反应，并参与免疫介导的对亚克隆蛋白神经网络的攻击。因此，我们的研究重点是甲型H1N1流感T细胞表位，这些表位是在HLA-DQ6.2背景下识别的，尽管HLA-DQ6.2肽结合还没有被直接检测。由于儿童Pandemrix相关NT1患者血液样本的可获得性受到限制，我们开始使用Pandemrix启动的小鼠寻找显性T细胞表位，这些小鼠将HLA-DQ6.2作为唯一的MHC II类等位基因，并接种了Pandemrix疫苗，HLA-DQB 1*0602-阳性个人。选择这一策略，所选的T细胞肽被富集为HLA-DQ6.2-结合，但可能包括MHCⅡ类和/或I类结合肽。

我们发现与Pandemrix相关的NT1儿童和青少年对两个NA和NP衍生表位的T细胞反应与Pandemrix免疫对照相比增强。此外，我们的研究为甲型H1N1流感病毒导向的T和B细胞与人POMT 1的交叉反应提供了证据。病毒NA肽序列与人POMT 1序列的同源性是通过基本的局部比对得到的。我们可以证明干扰素-γ的分泌是对NA的反应。175–189/纳178–192-和POMT 1675–689刺激与T细胞因子/趋化因子基因表达模式密切匹配。这是两个强有力的反应者，P 003和P 015的例子，他们都在接种Pandemrix疫苗后的一个月内发展为临床嗜睡症伴麻痹。NT1患者TCR再灌注谱分析显示，在NA刺激下，7种公共阵挛型增多。175–189和POMT 1675–689NT1患者。此外，Pandemrix疫苗还可诱导儿童产生抗POMT 1自身抗体。这些结果与Pandemrix相关的NT1中特异性、病毒导向的T细胞和自身抗原POMT 1的交叉反应相一致。

在本研究中，在Pandemrix疫苗接种后出现NT1的患者中，T细胞对不同的甲型H1N1流感蛋白片段的反应性增强，其原因尚不清楚。我们先前的研究表明，潘德母线抗原悬液中含有的病毒蛋白形成复合物，这可能有助于增强对NA和np衍生表位的反应性。16。另外，NT1患者T和B细胞反应性增强，而不是相互排斥，可能与免疫遗传倾向有关。6,7,8,23，导致对前炎症信号和AS 03佐剂补充甲型H1N1流感(H1N1)的高反应性。

HLAⅠ类等位基因，最一致HLA-A*11：01，说明NT1中额外的遗传风险贡献，独立于Hla-DQB 1*06：0224,25。细胞毒性CD8+T细胞可能与CD4+Th1-细胞协同作用，常与自身免疫性疾病(包括多发性硬化症)的发病有关。26和NT125。Pandemrix相关NT1、细胞因子和趋化因子基因表达的研究PBMC对甲型H1N1流感刺激后的细胞因子和趋化因子基因表达的影响175–189或人类POMT 1675–689紧密匹配，并显示出一个细胞毒性T细胞信号，其特征是干扰素-γ，IFN-γ−相关基因、穿孔素1，和颗粒酶B。这种表型与CD8+T细胞一致，但也与以前在甲型流感感染中观察到的非常规细胞毒性CD4+T细胞一致。20。在FACS分类的T细胞组分中，只有一名Pandemrix相关的NT1患者可以进行研究，穿孔素1和颗粒酶BNA表达上调175–189-刺激CD8+T细胞，而不刺激CD4+T细胞。因此，NA175–189肽最有可能与HLAⅠ类和Ⅱ类分子结合。

Pandemrix相关的nt1患者的6个tRA克隆型和1个trb克隆型在NA刺激时均显著增加。175–189，或者使用POMT 1675–689。引人注目的是，公共的TRA克隆型CVVSAIKAGNKLTF-TRAV 10/TRAJ 17和CVVSAMTTDSWGKFQF-TRAV 10/TRAJ 24在NA中被上调了37.5%。175–189-刺激，40-50%的POMT 1675–689-受刺激样本。此外，我们还在NT1患者的标本中鉴定了几种与这两个显性阵挛型高度相似的公共TRA克隆型。这些结果提示不同NT1型NA患者的会聚选择。175–189-和(或)POMT 1675–689-利用TRAV 10/TRAJ 17或TRAV 10/TRAJ 24基因片段的反应性T细胞克隆。提示这些克隆型可能与NT1的发病机制有关。

然而，所确定的公共阵挛型并不仅限于NT1患者。偶尔，他们也会出现在Pandemrix--接种了健康对照疫苗的人群中。有趣的是HLA-DQB 1*0602-阴性健康对照具有显性TRAV10-TRAJ 17和TRAV10-TRAJ24克隆型，提示表达这些克隆型的T细胞可能不受HLA-DQ6.2-的限制。因此，TRAV 10-TRAJ 17和TRAV 10-TRAJ 24克隆型可能参与了NT1患者的炎症反应，这可能是由于CD8+T细胞识别NA所致。175–189和假定交叉反应的POMT 1675–689(自动)抗原，而相同的克隆型出现时，有效地调节时，在健康对照。在未来的单细胞技术研究中可能允许NT1患者和对照组T细胞克隆型的直接功能特征。

特别令人感兴趣的是CVVSAMTTDSWGK的识别。FQF-TRAV 10/TRAJ 24为显性公共克隆型，另有高度相似的TRAV 10-TRAJ 24克隆型，在NA中上调。175–189-或POMT 1675–689-NT1患者的受刺激样本。汉等人描述了与NT1，rs 1483979相关的单核苷酸多态性(SNP)。此SNP位于TRAJ 24TCR(F8L)的CDR 3肽结合位点中的一个氨基酸片段和一个氨基酸的改变27。在我们研究的NT1患者标本中检测到的最高公共TRAV10-TRAJ24克隆型中，两个编码苯丙氨酸(F)，一个编码亮氨酸(L)。所有TRAJ 24(和4个TRAJ 17中的3个)克隆型，对NA的反应被上调175–189-或POMT 1675–689-刺激共享TRAV 10基因片段的使用。这些克隆型不同于TRAV2-TRAJ 24。18和TRAV6-TRAJ 2428以前使用HLA-DQ6.2-HCRT四聚体从NT1患者中分离出的克隆型。据我们所知，使用TRAV 10、TRAJ 17或TRBV 6-1/TRBJ 2-7的克隆型以前从未在NT1患者中被描述过。本文描述的主要公共TRAV10-TRAJ17、TRAV10-TRAJ24和TRBV 6-1/TRBJ2-7克隆型是NT1潜在的生物标志物。

在鉴定的T细胞表位中，IAYERMCNILKG(NP)217–228免疫表位数据库ID 145824)，来源于NYMCX-157疫苗株，在不同的甲型流感病毒株之间共享。相反，ESVAWSACHD(NA)175-186；ID 97390)和MERNAGSGIIISDTP(医管局)274-288ID 188723主要由甲型H1N1流感病毒株携带。罗等人最近的一项研究。显示HA特异性T细胞的频率增加273–287NT1患者与HLA-DQB 1*0602阳性对照18。然而，Schinkelshoek等人的一份报告。发现T细胞对HA的反应性没有显著提高273–287NT1患者与HLA-DQB 1*0602阳性对照29。肽HA271–285和HA274–288被NT1患者和健康疫苗接种者确认为透明质酸。273–287作为甲型H1N1流感T细胞表位。再一次，我们没有看到nt1患者和健康疫苗接种者之间的明显差别，也没有看到与健康疫苗接种者之间的明显差别。HLA-DQB 1*0602积极或消极对照，质疑医管局的作用273–287-NT1发病机制中的反应性。

利用HLA-DQ6.2四聚体，罗等人的研究。证明了CD4+T细胞的存在，其特异性为C-端氨基化的人hcRT。54–66和HCRT86–97NT1患者和对照组的多肽，而非天然HCRT肽18。此外，TCR序列分析表明与HA的交叉反应。蒋等人最近的研究，也使用HLA-DQ6.2四聚体，检测了针对天然hcRT的CD4+T细胞。56–69和HCRT87–100NT1患者及对照组的多肽28。此外，Latorre等人。报道了NT1患者HLA-DR限制性CD4+T细胞克隆的频率增加，克隆识别的HCRT肽表位更加多样。这些克隆与HA没有反应。值得注意的是，在2型嗜睡症中也检测到T细胞对hcrt的反应性，这与hcrt缺乏无关。30。因此，目前关于NT1中T细胞对HCRT的反应性的文献仍然相互矛盾。在许多自身免疫性疾病中，自身免疫是针对在靶组织中表达的多种自身抗原的。我们的研究结果并不排除自身免疫对HCRT的作用，但与POMT 1的另一个自身抗原在NT1。

POMT 1是一种锚定在内质网中的糖基转移酶，与POMT 2配合物催化O-甘露糖聚糖合成的第一步。在人类中，O-甘露糖基化主要见于大脑、周围神经和肌肉糖蛋白.POMT 1/POMT 2最著名的底物是α-dystroglcan，介导细胞外基质组分(如层粘连蛋白)与dystrophin复合物的结合。POMT 1的先天性缺陷是引起肌营养不良症的原因之一？？A1、B1和C1型糖基性疾病。31。某些类型的肌肉营养不良，最明显的是1型肌强直性营养不良，与快速眼动(REM)睡眠失调有关。32。目前尚不清楚POMT 1或其底物是否参与神经元睡眠调节，但这种可能性可以在实验研究中探索。

本研究检测了Pandemrix相关NT1患者T细胞与POMT 1的反应性.未接种NT1患者的样本无法进行比较。目前，还不清楚在未接触甲型H1N1流感疫苗或感染的NT1患者中是否能观察到T细胞对POMT 1的反应性。其他有待进一步研究的问题包括与限制显性公共TRAV10-TRAJ17、TRAV10-TRAJ24和TRBV6-1/TRBJ2-7克隆型有关的HLA等位基因的同源性、它们的功能、抗原肽特异性和交叉反应性，以及它们在NT1诊断中的价值。

总之，这项研究为甲型H1N1流感病毒在HLA-DQ6.2背景下NT1中的POMT 1交叉反应性T细胞反应提供了证据。我们在Pandemrix相关的NT1患者中鉴定了A(H1N1)NA和(NYMC X-157疫苗株)NP病毒蛋白的两个显性T细胞表位。患者对这些表位表现出强烈的Th1细胞/细胞毒性T细胞反应，并显示T细胞对POMT 1中的一个自身表位的反应性，POMT 1是一种在大脑中表达的酶。POMT 1表位是Pandemrix相关NT1中A(H1N1)NA显性T细胞表位的一个肽模拟。干扰素-γ穿孔素1颗粒酶BT细胞肽NA对趋化因子基因表达的影响175–189或POMT 1675–689NT1个体与之匹配。TCR曲线图分析显示，NT1中TRAV 10/TRAJ 17和TRAV 10/TRAJ 24克隆型的融合选择，都是针对任何一个NA而上调的。175–189-或POMT 1675–689-刺激，从而支持T细胞交叉反应和这些克隆型在NT1中的致病作用。此外，接种疫苗的人提高了抗人POMT 1的抗体水平，表明Pandemrix疫苗可引发对POMT 1的自身免疫反应。这一无偏搜索结果表明POMT 1是T细胞和B细胞在NT1中识别的自身抗原。