B1A和B2细胞在DNMT3A上具有不同的cpG修饰状态

B细胞的B1和B2系以不同的方式促进了对病原体的保护。DNA cpG甲基化体在指定这两种B细胞命运中的作用尚不清楚.在这里，我们概述了腹膜b1A和卵泡B2细胞的cpg修饰和转录，以及它们各自在胎肝和成人骨髓中的前体细胞。CD19-CRE DNMT3A在B系中缺乏DNMT3A的浮动小鼠。我们发现，在B系承诺过程中，基本的CpG甲基体是稳定建立的，并且在B1A和B2细胞中被一个DNMT3A维护的动态甲基小体所覆盖。这种动态的DNMT3A维持甲基组是由新的增强子组成的，这些增强子与世系特异性基因密切相关。DNMT3A在B1A和B2细胞中都保持着这些增强子的甲基化状态，而动态甲基化在B1A和B2细胞发育过程中经历了明显的去甲基化过程。我们认为DNMT3A增强子的甲基化模式是由DNMT3A和Tet酶的重合作用决定的，它们调控B1A和B2系特异性基因的发育表达。

B细胞分为两个主要的亚系.B2细胞，占所有B细胞的大多数，是短暂的循环细胞，它们是代谢静止的，可以在次级淋巴器官中被激活，在那里它们与辅助T细胞协同产生特定的抗体。B1A细胞主要存在于腹腔和胸膜腔内，是一种长寿命的自我更新细胞，产生天然抗体作为天然免疫的一部分。1,2。鉴于dna甲基化在控制基因表达、谱系规格和维持细胞状态方面的关键作用，我们从全基因组胞嘧啶修饰动力学的角度探讨了b1和b2亚系。3,4。基因间CpG岛甲基化已与免疫系统中的谱系规范相联系。5，并提示dna甲基化可能保护特定类型的细胞，使其免受转录因子异常激活的影响。6。在人类B细胞中进行了胞嘧啶甲基化的全基因组研究，发现早期人类B细胞发育的特征是增强子位点CpG甲基化缺失；此外，B细胞分化为记忆细胞和浆细胞，其特征是异染色质区cpG甲基化的丧失和多梳抑制区甲基化的增加。7。然而，人类B1细胞的鉴定仍存在争议，先前关于人类B细胞甲基体的研究并没有讨论B1与B2的谱系决定。

增加甲基标记的酶包括DNA甲基转移酶1(DNMT 1)和DNA甲基转移酶3a(DNMT3A)和3b(Dnmt3b)。DNMT 1被称为维持甲基转移酶，因为它识别新复制的DNA中的半甲基化位点，并恢复对称CpG甲基化。DNMT3A和Dnmt3b是一种新的甲基转移酶，在胚胎发生早期具有活性，并对称修饰未甲基化的cpgs。8。虽然5-甲基胞嘧啶(5 MC)是一种稳定的修饰，但它可以通过十个11易位家族(TET 1、TET 2和TET 3)的甲基胞嘧啶双加氧酶(TET 1、TET 2和TET 3)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5 HmC)。9,10,11,12。5 hmC本身也是Tet酶的底物，可被逐步氧化为5-甲酰基(5fC)和5-碳氧基(5 CaC)胞嘧啶，它们被胸腺嘧啶-DNA糖基化酶所识别和切除，从而通过碱基切除修复途径恢复未甲基化的胞嘧啶。与5 mC不同的是，5 hmC标记在细胞分裂过程中不被DNMT 1所维护，并且似乎经历了dna复制依赖的丢失，从而为dna去甲基化提供了一种额外的机制。13。因此，Tet酶在mCpgs的活性脱甲基中起着至关重要的作用。

低甲基化的CPGS标记基因调控区域，如启动子和一些增强子。5 hmC标记可能是tet活性的一个指标，但鉴于这个标记在增强子元素中特别丰富，人们猜测它可能发挥积极的、功能性的作用，而不仅仅是去甲基化的中间体。14,15,16。已经确定了几个专门识别甲基化或非甲基化CPGS的读者，但尚未确定5 hmC的特定读取器。与与DNA复制机制相关的DNMT 1不同，DNMT3A和Tet酶通过与转录因子的关联而被招募到特定的基因组位点，如基因调控区。工程损失DNMT3A在小鼠中，造血干细胞已被报道导致许多造血系的恶性转化，包括B系，类似于人的B-cll。17,18,19,20,21。白血病转化E-TCL 1-CLL转基因模型也被认为是由TCL 1抑制DNMT3A的能力驱动的。22。一旦DNMT3A和Tet酶在B系承诺过程中在整个基因组中建立了CpG甲基化模式，DNMT 1就会在整个细胞分裂过程中维持CpG甲基化模式。缺鼠TET 2和Tet 3在B系中保持正常数量的卵泡B2细胞，但在早期B细胞发育过程中出现部分阻滞，完全缺乏B1A和边缘区B细胞。23，建议在B系承诺后，DNA去甲基化在建立B1A细胞程序中继续发挥作用。在本研究中，我们通过研究，阐明了DNMT3A在B系承诺中和B族后的作用。DNMT3A-在CD19-CRE+/-背景在4周龄，早在白血病建立之前，在b1A细胞仍然是多克隆的时候。20,21,24，为了研究DNMT3A在克隆性体细胞畸变和CpG甲基化广泛变化的混杂效应中的作用，已知CpG甲基化是伴随着向CLL的恶性转化而出现的。

我们分析了B1A和B2细胞及其前体中胞嘧啶的修饰，发现B1A和B2细胞都表现出一层动态的家族特异性和DNMT3A维持的CpG甲基化，并叠加在一个共同的基本甲基体上。我们发现DNMT3A在这个动态的甲基化层需要持续的作用来抵消Tet的活性，而在B系承诺后CpG甲基化由DNMT3A维持的位点对增强子高度富集，我们称之为DNMT3A-维持增强子(DMES)。二甲醚甲基化与家族特异性基因的调控表达有关，并揭示了DNMT3A在特异性增强子标记和维持DNA甲基化方面的新作用，这些增强子调控发育中的淋巴细胞的命运。我们的结果还提供了一个表观遗传框架来理解bcr依赖于B细胞亚系的可塑性。25.

B1A细胞发育的特点是CpG修饰的明显丧失。

通过对前B2细胞(骨髓Hardy组分B和C)、脾滤泡B2细胞、ProB1细胞(胎肝Hardy组分B和C)和腹膜B1A细胞进行全基因组亚硫酸亚铁测序(WGBS)，观察了小鼠B1A和B2细胞的全基因组CpG修饰谱，并将其称为ProB 2、B2、ProB 1和B1A细胞。我们发现了大约40,000-50,000个低甲基化区(HMR)，它们分布在基因组的1.7%到1.9%之间，主要分布在四种细胞类型的基因间和内含子区域。26。有趣的是，野生型b1A细胞的hmr明显长于b2细胞(中位长度分别为830 bp和668 bp；K-S检验)。p < 1e-10), indicating that the B1a lineage may favor CpG demethylation at HMRs across the genome (Fig. 1A)。在小鼠造血干细胞的研究中，3.5kb以上的大HMRs曾被称为峡谷。27。使用类似的3.5kb的截止点，我们在所有四个B细胞群体中确定了甲基化峡谷.成熟的B1A细胞表现出比所有其他B细胞期多30-35%的峡谷(如图所示)。1B)。这种在B1细胞中的峡谷数量的发展增加让人想起了在下面观察到的峡谷扩张。DNMT3A-缺乏的小鼠HSCs27提示DNMT3A活性的改变可能与B1A细胞分化过程中所观察到的程序性去甲基化有关。

接下来，我们确定了在B1A和B2细胞系发育过程中出现的差异甲基化区域(DMRs)。DMRs是存在于一个甲基小体中，但在另一个甲基小体中不存在的差异甲基化概率较高的区域。在ProB 1和B1A阶段之间DMR尤其丰富。它们包含了B1A基因谱系中5,392个基因组区间的600万bp(占基因组的0.42%)，但在B2系的639个区间(占基因组的0.04%)中，只有50万bp左右，表明与B2细胞发育相比，CpG甲基化调控是B1A细胞发育的一个更为显著的特征。1C-E)。大部分B1A DMRs(~75%)在B1A细胞发育过程中表现出CpG修饰缺失。1C，d)。观察到的B1A DMRs的中位大小为857 bp，~12%的低甲基化B1A DMRs位于B1A细胞甲基化峡谷内。1F)

B1A细胞程序性去甲基化发生在B2细胞去甲基化和再甲基化的增强剂上。

大多数B1A和B2 DMR存在于基因间或基因内间隙的转录起始点(TSS)，与可能的增强子功能相一致(图1)。2A，b)。事实上，许多以前对成人体细胞组织中CpG甲基体的研究已经发现，不同甲基化区域在增强子位点上有很强的富集作用。成熟B2和B1A细胞H3K4me1和H3K4me3修饰的公开芯片-Seq数据分析28结果表明，B1和B2细胞发育去甲基化的DMRs与H3K4me1峰在成熟的B1A和B2细胞中共定位。这表明，这些DMR可能代表发育去甲基化促进剂，以调节世系特异性基因的表达(如图所示)。2C)。为了评估这些增强剂在造血发育中的意义，我们还利用已发表的芯片-Seq数据检测了HSC中的H3K4me1和H3K4me3标记。在成熟的B2或B1A细胞中，发育性高甲基化的DMR在B细胞中表现出少量的H3K4me1信号，但在HSCs中确实有H3K4me1信号，提示这些过度甲基化的DMR可能是被CpG甲基化抑制了发育的增强子(如图1所示)。2C)。B1A DMRs在HSCs中的H3K4me1水平较低，提示它们可能代表HSCs中的启动增强子，随后在B系中完全活跃。

在B2细胞中，只有一小部分发育去甲基化DMRs存在于注释转录起始位点(TSS)附近，显示H3K4me3信号，与启动子功能一致(图1)。2A)。然而，在B1A细胞中，大多数发育去甲基化的DMRs获得了一些H3K4Me3三甲基化标记(如图所示)。2C)。虽然h3k4me3通常与启动子有关，但在某些情况下，它可以在促进剂中找到。29,30。报道了SET1 H3K4三甲基化酶复合物通过CFP 1对非甲基化CPGS的识别，将该染色质修饰酶复合物限制在非甲基化启动子区域，防止CpG甲基增强子获得异位H3K4me3标记。31。这种CpG甲基化障碍对H3K4me3的获取似乎在B1A细胞的许多增强子位点上被破坏，而异位H3K4me3在去甲基增强子上的发育获得是B1A细胞特有的。有趣的是，B1A细胞的H3K4me3峰宽于B2细胞，这与B1A细胞HMR长度的全球增长一致(图一)。二维空间).

WGBS显示，B1A细胞发育去甲基化的DMRs中90%的CPGS在B2细胞中发生了修饰。2C)。由于WGBS不区分胞嘧啶甲基化和羟甲基化，我们还用tet辅助亚硫酸氢盐测序(TAB-Seq)分析了成熟的b1A和B2细胞中5-羟甲基化(5 HmC)的水平。32(无花果)2C，极右)。考虑到大部分亚硫酸亚铁保护来自于5mCpG，而不是5hmCpG，我们分析的重点是5mCpG。B1DMRs中的CPGS大部分在B2细胞中发生修饰。这些CpG中约有10%是羟甲基化的，表明Tet酶在这些位点上甚至在B2细胞中都有活性(如图所示)。2E)。相反，我们的分析显示，在B1细胞中，B1DMR没有明显的5 hmC水平。如前所述，5 hmCpgs，Tet活性的标志，在B1A和B2细胞的HMR边界上被发现富集(图1)。2F)。在hmr边界处的tet活动通过反对dnmt3A的作用在维持hmr中起着至关重要的作用。27,33.

B1系特异性基因表达与增强子去甲基化有关。

对ImmGen集团B细胞亚群中基因表达数据的检测表明，在B1A细胞发育过程中失去甲基化的B1A细胞特异性DMRs附近的基因在从ProB 1向成熟B1A细胞(胎肝分数E或腹膜B1A细胞)分化过程中被上调(如图1所示)。3A)34。这些基因在B细胞受体信号传递和激活的通路中得到丰富(如图所示)。3B)。相比之下，在发育过程中获得甲基化的B1A细胞特异性DMR与相邻基因表达的统计学变化无关(图一)。3A)。与低甲基化dmr-近端基因不同，在甲基化或退役增强子附近的基因与典型的淋巴细胞功能无关(补充表)。1)。B2 DMRs数量较少，与发育过程中基因表达变化无明显相关性(附图)。1)。虽然一些基因在其附近有多个DMRs，但DMRs的数量与基因表达之间没有相关性(附图)。2)。在B1A细胞发育过程中表达增加的基因与在B1A细胞发育过程中失去CpG甲基化的DMRs有显著的重叠(p < 0.01; Fisher’s exact test) (Fig. 3C)。在这些基因中，40%编码b1A系特异性基因，其中包括转录因子，如Arid3a, BHLHE 41和Zbtb 32，以及信号调整器，如西格列格和RASGRP 1，这是已知的B1A细胞的发展和功能所必需的(如图所示)。三维空间)35,36,37,38.

a成熟B1A(腹膜B1A或胎肝Fre)和proB 1(胎肝FRBC)细胞间基因表达的折叠变化分布。发育性低甲基化或高甲基化B1A DMR附近的基因与所有基因的集合一起被描述。来自ImmGen Consortium的微阵列数据被用于这一分析。b丰富的基因本体(生物过程)术语，在低甲基化的B1A DMRs附近的基因。cB1A(腹膜B1A或胎肝Fre)与proB 1(胎肝FRBC)细胞DMRs附近差异表达基因的重叠。有显著重叠的基因集被标记为星号(p < 0.001, Fisher’s exact test). dB1A系特异性基因在显著重叠的集合中显示在c。源数据作为源数据文件提供。

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缺DNMT3A小鼠B系中B1A细胞的选择性扩增

为了评估DNMT3A对B1和B2细胞命运决定的可能贡献，我们使用了CD19-CRE有条件地删除有条件的DNMT3A等位基因(DNMT3A2LOX)在B系中，特别是从proB 1和proB 2阶段开始。39,40。DNMT3A在B系中的直接或间接丢失已被证明可导致B1A细胞的白血病转化。20,21,22。同样，CD19-CRE+/- DNMT3A2 lox/2 lox (DNMT3A-/-)小鼠B1A B细胞也有明显的扩增，在9个月大的时候发展成单克隆白血病，并且有100%的外显率(图1)。4A)。B1A细胞的增加最早在4周龄时就可在腹腔中检测到(如图所示)。4A)10周后，脾脏和骨髓明显可见。随着年龄的增长，腹膜B1B B细胞群逐渐被逐渐扩大的B1A群体所取代。我们观察到CD 19的比例没有增加。+胎肝B1A系祖细胞或proB 1细胞41提示B1A细胞的扩增是由成熟的B1A细胞室自我更新或增殖增加所致(附图)。3A)。脾脏滤泡B细胞数略有减少，骨髓中B_2细胞发育数无明显变化。DNMT3A-/-老鼠(图1.4B和补充图。3B)。边缘区(MZ)B细胞在8周龄时也减少(图1)。4B和补充图。3C)。在12周龄以上不能评估MZB-细胞室的变化，因为浸润的B1A细胞将脾边缘区生态位消失，而MZB细胞不再被检测到。

4周龄时，缺乏DNMT3A的B1A细胞基本保持多克隆性，与野生型B1A细胞相似。4C和补充图。4)。Igκ和Igλ轻链染色结果表明，腹膜腔中膨胀的B1A细胞池从多克隆状态到单克隆状态逐渐受到限制。在30周龄以上的8只小鼠中，7只只显示Igκ染色，1只仅显示Igλ染色。DNMT3A-/-B1A细胞表现出较高的Ki-67染色，与本室自我更新的增强相一致(图).4D)。对克隆白血病的IgH重排进行了扩增和测序，并与未突变的人CLL相似，未发生体细胞高突变。避免由白血病中可能选择的致癌体细胞突变引起的潜在混淆效应DNMT3A-/-克隆在稍后的时间点，我们用腹膜DNMT3A-/-从4周龄小鼠的B1A细胞，当细胞仍然处于多克隆状态，所有后续分析。

DNMT3A缺失揭示了B1A和B2细胞中的B系特异性基础甲基组

我们在B2和B1A细胞中分别鉴定了9,401和9,765个基因组间隔，显示了不同的cpG修饰，它们分别存在于prob、成熟B(野生型)和b1A细胞之间。DNMT3A-缺乏成熟B细胞，此后称其为B2和B1A DNMT3A依赖性DMRs(DDMRs)。5A)。值得注意的是，在没有DNMT3A的情况下，成熟的B2和B1A细胞中的谱系特异性甲基化模式几乎被完全消除，从而揭开了B1A和B2细胞中基本相同的甲基化的面纱(图1)。5B)。事实上，只有34个不同的甲基化间隔DNMT3A-/-B1A和B2细胞。有趣的是，野生型b1A细胞的cpg甲基化谱类似。DNMT3A-/-B1A和B2细胞，提示DNMT3A活性在B1A细胞发育过程中可能受到生理上的抑制。5B)。我们发现峡谷的数量在DNMT3A-与野生型细胞相比，缺乏B细胞(见图)。5C)，似乎是由于B型野生细胞中存在于各自位置的较小的HMRs的扩张和合并所致。峡谷DNMT3A-B2和B1A细胞有很高的重叠度(98%)，编码转录因子的基因高度富集，因此在这些峡谷中，近三分之一的最接近的基因编码转录因子。

与公开获取的野生型和野生型小鼠WGBS数据的比较DNMT3A-缺乏骨髓造血干细胞(HSCs)显示出基因组位点DNMT3A-依赖的CpG甲基化在HSCs和B细胞之间几乎没有重叠。5D).27。值得注意的是，考虑到CD19-CRE删除DNMT3A-浮动等位基因，DNMT3A的丢失发生在B系承诺后。有趣的是，即使没有DNMT3A(无花果)5E)。这表明，在分化为B系后，基础甲基体和动态甲基体被重新构建成B系，由此B系DDMR的CpG甲基化依赖于DNMT3A，这可能是为了抵消TET 2在这些位点的富集所暗示的TET 2的活性(图5 hmC)。5F，g，h).

根据CpG修饰模式将DDMR分为12组，6种模式占B2和B1A细胞DDMR的97%以上(附图)。5A, f)。正如以前所观察到的，大部分(~75%)的B1A DDMR在ProB 1细胞向B1A细胞分化过程中表现出CpG修饰的缺失(如图所示)。5F)。值得注意的是，从prob 1到成熟b1A阶段经历部分去甲基化的DDMR在DNMT3A-/-B细胞(图7型)。5F)，表明DNMT3A维持了野生型B1A细胞DDMR中CpG甲基化水平的降低。在DDMR>65%CpG修饰的B2细胞中，B2DDMR中约10%的CPGS是5-羟甲基化的，指示了这些位点的Tet活性。5G)。相反，我们的分析显示，在B1A细胞中，5 hmCpG在B1A DDMR上没有明显的水平(图1)。5H)。提示Tet可将B2 DDMRs处DNMT3A生成的部分mCpG转化为B2细胞中的5hmCpG，但B1A细胞中DNMT3A在B1A DDMRs处的发育抑制活性可能导致B1A细胞中Tet的mCpG底物缺乏。在大多数B系DDMR中，DNMT3A似乎在DDMR上起着维持甲基转移酶的作用，甚至在不分裂的B2细胞中也是如此，其方式有别于DNMT 1所执行的复制耦合维持甲基化功能。因此，这组DDMR可被视为B1A和B2细胞中由DNMT3A维持的动态甲基化体。

DNMT3A-维持增强子(Dmes)是一种新的甲基化敏感的增强子子集。

DDMR主要位于与TSS相距较远的基因间区和内含子区，与增强子功能一致(图1)。5我，j)。为了评估这一点，我们用抗H3K4me1、H3K4me3和H3K27ac的抗体对ddm的染色质特征进行了检测。42和ATAC-Seq43。在B1A和B2细胞中，DDMRs被用于H3K4me1组蛋白修饰，这是广泛研究的促进剂标志。6一个,b)。事实上，DDMR约占B细胞非TSS H3K4me1峰(74,344中的7,990)所确定的所有增强子的11%。发育低甲基化DDMR(B1A DDMR模式1和7，B2 DDMR模式7)在发育过程中获得H3K27ac标记，这是一种活性增强子状态(图)。6一个,b)。B2和B1A DDMR与染色质可达性增强位点重叠。在两组DDMR中，染色质可达性与CpG甲基化呈负相关(B2和B1A DDMRs分别为Spearman相关系数=−0.2 6和−0.5 7)。鉴于大部分DDMR在野生型B1A细胞中部分低甲基化，DNMT3A的缺失对B2细胞DDMRs的CpG甲基化有更深刻的影响，同时也增加了染色质的可及性(图1)。6b，c)。这表明CpG甲基化可能限制了这些DNMT3A增强子的染色质可及性，我们称之为DMES。

a和b5 mCpG，H3K4me1，H3K27Ac，H3K4me3和ATAC-Seq信号DNMT3A-/-B细胞分别位于B1A和B2系。从3到4 ATAC-Seq或剪切和运行复制的聚合信号被绘制成每个条件。B1A和B2 DMR的平均CpG甲基化率是从图中复制的。5E在组蛋白修饰热图的同时提供参考框架，如剪切和运行或染色质可达性信号在距DMR中心±5kb区域的100 bp垃圾箱中测量。甲基化的六种主要模式被标记。cATAC-seq法测定B1A和B2型DDMR中染色质可达性的分布。d修改后的CPGS、H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac和染色质可达性在两种最大的B1A和B2型DDMR中的平均轮廓。DNMT3A-B1A和B2缺乏症细胞。

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在B2细胞中，Dmes表现为5mCpG和5hmCpG，且以H3K4me1标记，而H3K4me3未见标记。6A)。少数在H3K4me3中富集的B2 Dmes(模式1)也在TSS中富集，表明它们是启动子(附图)。6)。相比之下，在B1A细胞中，发育性低甲基化的Dmes(特别是模式1)显示出H3K4me1和H3K4me3标记，尽管它们与注释转录本的启动子有极小的重叠(图1)。6b，d，和补充图6)。如图所示。2C使用公开的芯片-seq数据，如图所示。6B用不同的抗体进行剪切试验，我们发现在Dmes上获得H3K4me3标记是B1A细胞发育的独特特征。H3K4me3在启动子中很突出，但在rna polⅡ结合的活性增强子上也观察到这种修饰的水平。44。虽然dmes中cpG甲基化在缺乏dnmt3A的b1A和b2细胞中大部分被清除，DNMT3A对b1A或b2细胞dmes中的h3k4me1或h3k4me3水平影响不大，未导致dmes在dmes上获得h3k4me3标记。DNMT3A-缺乏B2细胞。6一个,b)。Dmes中CpG甲基化完全丢失DNMT3A-B1A细胞缺失也与携带异位H3K4me3增强子标记(模式1)的B1A Dmes中H3K27ac标记增加有关，提示CpG甲基化可能通过H3K4me3标记抑制Dmes的活性(图1)。6b，d)。而在B2细胞中，DMES中H3K27ac、H3K4me1或H3K4me3的水平在DNMT3A丢失时基本不变。

少量DDMRs(模式10和11)在甲基化方面表现出自相矛盾的增加。DNMT3A-与野生型相比，敲除B2细胞。这可能类似于在造血干细胞缺乏DNMT3A的情况下，Dnmt3b驱动的异常甲基化。45。有趣的是，这些站点在我们的数据中没有增强子标记(图)。6A)，表明它们不是B细胞的功能增强剂。这一点得到了公开提供的有关免疫细胞类型(如CH 12或小鼠脾脏)的ChromHMM数据的证实，这些免疫细胞类型的免疫细胞类型基本上没有标记，因此很难确定这些时间间隔的特定功能(补充图)。7)46。我们还观察到，发育性高甲基化B1 DDMR(4和9型)在ProB 1期具有H3K4me1标记，但在成熟的B1A细胞中丢失，提示这些DDMR代表DNMT3A介导的CpG甲基化使发育退役的增强子。没有解除这组ProB 1增强剂的作用DNMT3A-缺乏B1A细胞可能参与了观察到的白血病前表型的形成。DNMT3A-缺乏B1A细胞。发育甲基化的B1A DDMR也不显示5 hmCpG标记，表明DNMT3A可能不需要继续甲基化。不甲基化模式4和9 DDMR不伴随H3K4me3获取。DNMT3A缺失对B1A和B2两大类DDMR组蛋白标记和胞嘧啶修饰模式的影响如图所示。5D.

DNMT3A依赖的Dmes甲基化控制B细胞的系特异性基因表达

全球二甲醚甲基化的丧失DNMT3A-B细胞缺乏导致B1A(2,872个基因)和B2(2,018个基因)B细胞基因表达普遍紊乱。其中1,002基因在B1A和B2细胞中的表达发生了一致的改变，而在B1A和B2细胞中，1,710和946基因的表达分别发生了谱系特异性的改变(图)。7一个,b)。两种DNMT3A-缺乏B1A和B2细胞，基因的差异表达与其附近存在的二甲醚几乎没有相关性(图)。7C)。我们推测这是因为DME-近端基因在DNMT3A-B细胞缺陷会影响附近缺乏二甲醚的基因。为了探索这一概念，我们在将差异表达的基因分层成组后，重复了这一分析，这些序列可能对主调控基因(如谱系界定基因或编码转录因子的基因)进行富集。我们发现B1A和B2系特异性基因以及在B1A和B2细胞发育过程中被上调的基因在DMES附近显著富集，DMES的甲基化由DNMT3A维持。7C)。有趣的是，尽管DNMT3A(B1A模式5和B2模式10和11)丢失，但Dmes附近保留其CpG修饰的基因与世系特异性、发育或DNMT3A-基因表达的依赖性变化。我们之前已经注意到，这个基因最接近于近三分之一的低甲基化峡谷。DNMT3A-/-B细胞编码转录因子(TF)。这也提示虽然DMES的存在与DNMT3A缺失时基因表达的整体变化没有直接关系，但TF基因的增强子去甲基化可能导致基因表达的广泛继发性变化。事实上，我们发现tf基因在DNMT3A-在B1A和B2细胞的Dmes附近，缺陷B细胞被选择性地富集(如图所示)。7C).

a野生型和野生型差异表达基因的热图DNMT3A-/-B1A和B2细胞(每个条件有两个重复)。b野生型和野生型差异表达基因DNMT3A-/-B1A和B2细胞如Venn图所示。统计上的显著重叠(p < 2.2e-16, Fisher’s exact test) are marked with an asterisk. cB1A和B2 Dmes附近基因重叠的显着性，表现出明显的甲基化模式和以下差异表达的基因集(I)，其表达因基因缺失而改变。DNMT3A在ba和b2细胞中，或(Ii)b2和b1A系特异性基因，或(Iii)在发育过程中表达改变的基因(从prob到成熟的B)，或(Iv)编码转录因子的基因，这些转录因子的表达因基因的缺失而改变。DNMT3A。用双侧Fisher精确检验和显著重叠对基因集来评估重叠的显着性。p < 0.001) are colored in pink (B1) or blue (B2) based on the p-价值。源数据作为源数据文件提供。

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在发育过程中，特定于谱系的增强子出现在通过“启动”或“平稳”状态进入“主动”状态的沉默染色质位点，每一种状态都以染色质和胞嘧啶修饰的特定组合为标记。44。这些转变需要特定部位的染色质和胞嘧啶修饰酶通过TFs的作用。我们分析了Tf结合基序在DMES中的富集情况，并在细胞阶段特异性甲基化状态下解释了这些数据。的确，具有类似甲基化模式的Dmes表现出类似的TF基序富集，这表明特定的TFs可能是特定甲基化模式的原因(图一)。8A)。有趣的是，DDMR模式与基因表达的变化有关(如图所示)。7C)不要与基因表达变化无关的DDMR共享任何丰富的TF基序。在任何特定的B细胞发育阶段，dmes的cpG甲基化状态很可能是由tf介导的dnmt3A或tet酶的位点特异性招募决定的。47,48,49。已被证明能招募到DNMT3A的TFs的绑定主题，如SPI 1(PU.1)、FOS、JUN和ETS 147，以及tet 2相互作用的tf 1、batf、tcf 3(E2A)、spi 1和ebf 1的基序在dmes中都有很强的富集。48,49。列出的TFs的转录激活子结构域可能决定DMES的增强子功能，值得注意的是，丰富的TF结合基序既包括已知的B系主调控子，也包括响应bcr信号的转录激活子。

a甲基化模式不同的B1A和B2 DDMR显著丰富了TF结合基序。富集型p < 0.01 (binomial test run with HOMER) and a difference in motif instances between test and background sets of intervals greater than 5%; the entire set of DDMRs was used as the background. Motifs that are insensitive to CpG methylation or lack a CpG are depicted in black. Methylation-sensitive transcription factor binding motifs are marked in magenta and colored based on whether the colored by TF binding is enhanced (orange) or inhibited (cyan) by CpG methylation. bGWAS中与人类疾病相关的SNP在B系DMR(红色)和所有HMRs(不包括用Riviera计算的DMR(灰色))中的富集。源数据作为源数据文件提供。

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有趣的是，TFs不仅可以招募胞嘧啶修饰的作者和擦除器，还可以作为CpG甲基化的读者，因为它们的结合可能受到CpG识别位点甲基化程度的影响。体外实验研究了胞嘧啶甲基化对TF结合的影响。50。据报道，在DMES中富集的TF结合基序中约有一半对INE等人的CpG甲基化敏感。学习50。有趣的是，在B系规范中具有重要作用的TFs的丰富TF结合基序，如EBF 1、TCF 3(E2A)、MEF2A、MEF2C、SP1(PU.1)、PAX 5和NFKB 1，要么对甲基化不敏感，要么缺乏cpG位点。51。它们在甲基化和非甲基化两种时间间隔中都得到了富集(如图所示)。8A)。ARID3A缺乏cpgs的结合基序，可以选择性地驱动b1A谱系的发展，它在模式5中选择性地丰富了b1A dmes，在b1A发展过程中甲基化。35。相反，对bcr信号(如FOS、Jun和NFATC 1)作出反应而激活的TFs对它们的结合位点CpG甲基化很敏感。CpG甲基化降低了FOS与JUN的结合，CpG甲基化增加了NFATC 1的结合。FOS和Jun基序在B1A和B2细胞中均以低甲基化间隔富集。事实上，B1A基因中Dmes的发育去甲基化可能使大量的DMES响应于BCR信号下游的FOS和JUN。

这些B系Dmes在60种脊椎动物的相对侧翼区域表现出较高的序列保守性(附图)。5B)。人类基因组中相应区间内的单核苷酸序列已在全基因组相关研究中与人类疾病联系在一起。52。特别是，与多种人类免疫介导的疾病相关的SNPs的二甲醚合成区强富集(如图所示)。8B)53，但大多数神经发育、神经精神疾病或代谢紊乱都没有发现类似的富集现象。众所周知，gWAS所涉及的常见变异体对于调节性变体来说是富集的，而且确实有可能这些dme同步区中的疾病相关SNP通过影响它们的增强子功能而直接导致疾病易感性。54。从功能角度看，本研究鉴定的DMES是B系甲基化敏感增强子的保守组，其增强子功能受DNMT3A介导的甲基化影响和维持。

我们的研究发现了在B细胞之间共享的基础甲基小体，并且可能由DNMT 1维持在B1A和B2亚系中，与DNMT3A无关。我们还描述了一个动态甲基体，主要由DNMT3A以B1A和B2谱系特有的方式维护的增强子组成。DNMT3A需要抵消这些促进剂中正在进行的Tet活性。因此，我们将这些促进剂称为DNMT3A-维持促进剂或DMES。在B1A细胞发育过程中，Dmes经历了广泛的CpG去甲基化，这与在这些增强子附近诱导其家族特异性基因的表达相一致。这些增强剂在B2细胞中仍被DNMT3A甲基化。然而，DMES是一个在B2细胞中持续存在的Tet活性位点，如5hmCpG标记所证明的那样，在没有DNMT3A的情况下，DMES是完全去甲基化的。我们的结果表明，DNMT3A可以在DME位点发挥维持作用，表现出Tet依赖的去甲基化和DNMT3A依赖的维持重新甲基化的持续周期(补充图)。8)。我们还发现，发育去甲基化的Dmes在B1A细胞中获得了H3K4me3修饰。对DNMT3A缺失后早期传代ES细胞胞嘧啶修饰动力学的研究表明，ES细胞中的体细胞增强剂显示了DNMT3A与Tet活性一致的迹象。55,56。鉴于这些增强子独特的生物学和染色质特征，以及它们在谱系确定中的作用，我们建议DMES可能代表一种特殊类型的增强子，它们在其他细胞类型中的作用仍有待探索。

虽然基本的CpG甲基体在DNMT3A-缺乏B1A和B2细胞在两个亚系中几乎相同，细胞不会丧失身份。事实上，其他表观遗传标记的差异，包括DMES中的异位H3K4me3标记，尽管DNMT3A的丢失，也会被保留下来。这表明，其他表观遗传特征，包括Dmes中的H3K4me3标记，在维持B1A或B2亚系身份方面可能很重要。H3K4me3标记与转录密切相关，它们在Dmes中的存在可能表明存在增强子RNA。不同水平的h3k4me1和h3k4me3可能决定在增强子位点发生单向或双向转录。57,58。在B细胞中，在ctcf锚处胞嘧啶修饰的变化中观察到了新的eRNAs的转录。59。然而，我们发现的b1和b2 dmes在ctcf基序中没有富集，只有10%的dmes与最近对小鼠八种B细胞类型的一组4,516个多腺苷化的长非编码rna重叠。28。在我们的转录数据中，我们没有发现转录本与带有H3K4me3标记的Dmes的特异性映射的证据。鉴于我们在测序时富集了多腺嘌呤化RNA，可能已经错过了非聚腺苷化增强子RNA，因此需要进一步的研究来评估DMES的转录起始。ERNAs在调控基因表达中的作用尚未完全阐明，DME甲基化、eRNAs转录与基因表达之间的关系还有待于进一步的研究。然而，二甲醚甲基化的缺失DNMT3A-缺乏细胞并不是没有结果，结果是一个混乱的转录程序，表现为白血病前状态的B1A细胞。

在B1A细胞中，Dmes的DNMT3A活性可能是通过获得H3K4me3标记而被部分阻断的。而一些研究则描述了在CD8增强剂上获得H3K4me3标记的情况。+在肿瘤背景下，这些先前的研究并没有在胞嘧啶修饰的背景下对它们进行评估。29,30。CpG甲基化与哺乳动物细胞H3K4me3的相互抑制关系可能是B1A和B2细胞CpG甲基化和Dmes染色质修饰状态转换的生化基础。在小鼠胚胎干细胞中，SET1 H3K4三甲基化酶复合物的CFP 1亚基与未修饰的CPGS结合，抑制H3K4三甲基化启动子的活性。在没有cfp 1的情况下，异位h3k4me3会在与启动子相互作用的甲基化增强子中积累，从而增加其目标基因的表达。31。相反，与H3K4me0/me1不同的是，H3K4me3不能将DNMT3A的催化中心从其自身抑制的ATRX-DNMT3-DNMT3L(Add)结构域中释放出来，从而使其附近的DNMT活性受到局部抑制。60,61。因此，我们假设SET 1复合物的cfp 1亚基(初级h3k4三甲基化酶)在启动子上的非甲基化dmes也部分适用于非甲基化dmes。31,62。一旦在DMES中建立了H3K4me3标记，可能是为了响应Tet介导的去甲基化提供的短暂机会，H3K4me3标记也可能随后阻止DNMT3A进一步甲基化。事实上，5hmCpG在B1A细胞的Dmes边界富集(图1)。5H)。由于5hmCpG在复制过程中不被维持，在DNMT3A减少的背景下B1细胞的基线自我更新也可能有助于DMES的完全去甲基化。此外，在B系中缺乏TET 2/3的小鼠完全缺乏B1A和边缘区B细胞。23。Tet酶介导的脱甲基化可能是B1A Dmes上H3K4三甲基化酶活性所必需的。

DMES在B系中的重要性被进一步强调，因为它们对于B系决定的TFs的绑定点是高度丰富的。DME同步区内与人类免疫介导的疾病相关的SNP的显著富集进一步凸显了这些DMES在维持细胞功能方面的重要性，我们推测DMES可能具有更广泛的生物学意义。进一步研究DNMT3A在不同组织中的组织特异性缺失有可能揭示DME介导的基因调控在不同细胞类型中的关键因素。在生物发育和细胞分化的研究中，根据它们的组蛋白修饰和邻近基因的功能状态，增强子被确定为平稳、启动或活跃。44。我们建议，增强子的子集是Dmes，并且可能也经历一个类似的进展，从一个平稳或启动到一个活跃的状态。然而，与传统促进剂不同的是，DMES在活性状态下仍表现出局部的Tet活性，DNMT3A是平衡的。5 hmC在ES细胞中富集于增强子中，在es细胞分化模型中被认为是增强子启动的标志。63,64。TET 2曾被证明能在prob细胞中促进5 hmC的生成。49.

在dmes上保持每一个cpG修饰的适当水平，可能需要通过与染色质和转录因子的相互作用，使dnmt3A和tet 2在这些位点持续定位，就像在表皮干细胞中所观察到的那样。65。大多数B系DMES的CPG甲基化是由DNMT3A在B细胞中维持的，而在HSCs中则不是，这表明动态甲基化是特定细胞类型或谱系所特有的。B1A细胞CpG甲基化缺失的原因可能是DNMT3A和Tet酶的转录因子活性变化。考虑到PU.1与DNMT3A结合47它的结合基序富含DMES，很可能是一种转录因子，可以将DNMT3A引入到DMES中。有趣的是，B细胞中PU.1(SPI 1)的丢失导致了从B2向B1A细胞的转变，而B1A细胞表现出较低水平的PU.1。66。B1A细胞在dmes处获得的H3K4me3标记也可能是组成性bcr信号的结果，最近证明该信号足以使B2细胞重新编码成b1A细胞的命运。25。事实上，含有B1A Dmes的H3K4me3含有FOS、JUN和NFATC 1基序，支持BCR信号可能在获得DMES异位H3K4me3中起关键作用的观点。相反，DNMT3A的缺失并不足以在B2细胞的Dmes中获得H3K4me3，也不足以使B1A细胞中的发育甲基化和退役促进剂获得H3K4me3，提示获得H3K4me3需要B1特异性因子，可能是构成BCR信号，或B1A细胞特异性的谱系结合--如LINL 28、ARID3A、BHE41或ZBTB 32。

DNMT3A和TET 2之间的局部平衡也被认为是维持小鼠HSCs低甲基化峡谷边界的一种方法。DNMT3A在HSCs中的丢失导致峡谷的扩展，以及自我更新的增加。67。B1A细胞的发育还伴随着HMRs的全基因组化和B1A细胞发育过程中观察到的峡谷数的增加，提示B1A细胞分化过程中DNMT3A活性的降低可能不仅仅限于Dmes，而且可能涉及DNMT3A活性的全球降低。在B1系的发育过程中，B1A细胞自发地获得了一个CpG甲基化图谱，类似于DNMT3A-缺乏B1A和B2细胞。建议hSCs通过miR-29抑制dnmt3A的水平来调节其自我更新能力，而hscs中miR-29a的丢失导致dnmt3A的增加与hsc自我更新的减少有关。68。我们推测，类似的机制可能控制B1A细胞中DNMT3A的水平，从而控制其自我更新能力。事实上，DNMT3A在B系中的直接或间接丢失已被证明导致了B1A细胞的白血病转化。20,21,22。B1A细胞Dmes中CpG甲基化水平的降低可能足以促进自我更新；在缺乏DNMT3A基因敲除的情况下，完全去甲基化可能导致不受控制的自我更新。

有趣的是，最近的两项研究描述了DNMT3A和Tet酶在ES细胞体细胞促进剂中协同作用的证据，这两种酶对转录因子结合位点高度富集。55,56。我们的研究表明，类似的调控模式也可能在完全分化的体细胞(如B细胞)中的促进剂中起作用。通过对一个未转化的造血干细胞系中CpG甲基化体的全面分析，我们的发现可能适用于更广泛的体细胞。本研究还阐明了DNMT3A是如何在广泛的B系特异性增强子中作为维持甲基转移酶发挥作用的，其方式不同于DNMT 1的DNA复制-偶联维持甲基转移酶功能。我们的结果还提供了更多的见解，以了解动态甲基组的扰动如何促进IgHV未突变的慢性淋巴细胞白血病(一种怀疑是B1A细胞起源的白血病)的白血病前期。

在B细胞中，我们推测由DNMT3A调控的增强子可能存在于许多分化的细胞类型中，而Dmes在动态甲基化体中对其他谱系的分化和生物学的贡献无疑是非常有意义的。DMES可能为增强子功能的发育控制提供了一种额外的模式，其中CpG去甲基化和H3K4me3标记的获得促进了增强子活性的额外调控，特别是在特定于世系基因表达的背景下。我们的工作还提出了DNMT3A介导的表观遗传修饰的细胞表型后果如何被限制到特定的发育谱系，以及这种表观遗传调控机制的丧失如何可能导致细胞型特异性恶性肿瘤。