为了评估B细胞在AD中的参与程度，我们首先进行了B细胞在同型、性别和年龄匹配的C57BL/6(WT)和3×tgAD小鼠循环中的流式细胞术评估，后者是一种早期发病的AD模型(eoad，携带瑞典APP突变，ps1上的m146v突变和MAPT中的p301L)。 24 ,25 。注：从现在起，除非有明确规定，我们使用年龄较大的雌性3×tgAD小鼠，因为它们的AD症状更明显。 25 。与对照组相比，3×TgAD小鼠在循环和次级淋巴器官中B细胞的频率和数量显著增加(附图)。 1A 而不是描绘；门的策略在补充图中。 9A )，天生的CD5 + B1A和CD5 − B1B细胞(CD11b) + 或/和CD 23 − CD 43 + CD 19 + 脾淋巴结和颈淋巴结中的B_2细胞明显增多，B_2细胞减少(CLN；图1)。 1A-C 和补充图。 1B-D )。3×TgAD小鼠在循环中也有较高数量的活化B细胞表达IFNγ、IL 6、IL 10和β。 1D-G )，主要在B1A细胞内，其次是B1B和滤泡B细胞(补充图)。 1E-H )。AD小鼠B细胞，尤其是B1A细胞，明显上调4-1BBL(补充图)。 1I，J )，与老年人致病性B1A细胞相似。 22 ,23 暗示他们可能参与了AD。为了验证这一可能性，我们已经产生了缺乏B细胞的3×TgAD小鼠(称为3×TgAD-BKO，补充图). 2A )与J杂交3×TgAD小鼠。 H T小鼠由于免疫球蛋白J缺乏功能B细胞 H 在亲B细胞阶段终止B细胞发育的位点缺失 26 。当小鼠达到50-60周龄时，采用Morris水迷宫(MWM)任务对小鼠海马依赖的认知行为进行评估。在为期5天的隐性平台训练中，3×TgAD和3×TgAD-BKO小鼠表现相似(未显示)。然而，在上一次训练24小时后，在没有隐藏平台的情况下进行的一项探测试验显示，3×TgAD-BKO小鼠在目标象限内的时间明显长于3×TgAD小白鼠( p =0.017， n =13-15，图1。 2A )，表示对平台位置的更强的空间记忆。我们还测试了在3×TgAD小鼠中常用的开放式竞技场(OFA)的探索性行为异常。 27 ,28 )。与WT小鼠相比，3×tgAD小鼠在OFA中的活性降低，但在年龄匹配的3×tgAD-bko小分子中不能再检测到这种损伤(左面板，单因素方差分析)。 F (2，29)=21.68， p < 0.0001; WT vs 3×TgAD p < 0.0001, 3×TgAD vs 3×TgAD-BKO p < 0.0001, n =10-11，图1。 2B )，这意味着3×TgAD相关的行为障碍需要B细胞。
图1：3×TgAD小鼠激活的B细胞增多。 与同型、年龄、性别相匹配的WT小鼠比较，b1A(CD5)。 + CD11b + CD 19 + , A )和B1B细胞(CD5) − CD11b + CD 19 + , B )增加，而B2细胞(CD5)增加。 − CD11b − CD 19 + , C )3×TgAD小鼠颈部淋巴结减少。AD还激活B细胞，因为它们上调了IFNγ( D )、IL6( E )，IL 10( F )，以及转化生长因子β( G )小鼠外周血中。显示频率(%)平均值±SEM，每个符号代表单个鼠标， n =5-6英寸 A –C , n =15英寸 D –G 。门控策略如图所示。 9A . **p < 0.01; ***p < 0.001 in unpaired t 测试一下。
图2：AD的进展所需的B细胞。 AD相关认知障碍( A ，MWM测试)和非认知运动活动( B 3×tgAD 3×tgAD-BKO小鼠在30 min OFA实验中，总行程、左板、中间区时间、右侧视野时间均有改善(P<0.01)，3×tgAD-bko小鼠(3×tgAD-bko小鼠)( n =10-15名女性)。与WT小白鼠相比，APP/PS1小鼠增加了IL 10的数量。 + 外周血B细胞( C )。APP/PS1小鼠认知能力受损 D ，到达逃逸平台的延迟； E 在APP/PS1-BKO小鼠中，MWM试验(探针试验)的平台穿越次数被逆转。平均±扫描电镜显示，每个符号为一只老鼠。 A , B 和 D , E 分别独立繁殖了三次和两次。门控策略如图所示。 9A . *p < 0.05; ***p < 0.001 in unpaired t 试验( A )，曼-惠特尼试验( C )，单向方差分析( B (左)，Kruskal-Wallis试验( B ，右和 E )或双向方差( D ).
为了证实这一结论，我们测试了另一种Eoad模型APP/PS1小鼠，与3×TgAD小鼠相比，APP/PS1小鼠具有早期AD病理。 29 。值得注意的是：随后的实验是在雌性和雄性，20-35周龄的小鼠身上进行的.流式细胞仪检测发现APP/PS1小鼠外周血B细胞表达IL 10也明显上调(图1)。 2C 3×TgAD小鼠。 1F )。然而，APP/PS1小鼠不上调4-1bbl。 + B细胞(大概是由于他们相对较年轻的年龄 22 ,23 )尽管B1A细胞循环和CLN明显增加，但与对照组相比(补充图)。 2B、C )。接下来，我们通过杂交app/ps1和j，产生了B细胞缺陷型APP/PS1-BKO小鼠。 H T小鼠。利用MWM对空间学习的分析表明，与年龄和性别匹配的APP/PS1或WT短时相比，B细胞缺乏明显改善了APP/PS1小鼠的学习缺陷，表现为到达逃避平台的潜伏期。 F (2，33=8.288， p =0.0012；WT vs APP/PS1 p =0.0006，APP/PS1 vs APP/PS1-BKO p =0.003， n =12，图1。 二维空间 ；在平台区域交叉的次数中，在24小时后进行探针测试(Kruscal-Wallis ANOVA)(Kruscal-Wallis ANOVA)。 p =0.0004；WT vs APP/PS1 p =0.0002；APP/PS1 vs APP/PS1-BKO p =0.028，图1。 2E )。APP/PS1小鼠探究性行为障碍的缺失 30 我们的小鼠在OFA中的探索行为没有差异(未描述)。因此，APP/PS1所表现的空间学习障碍是B细胞依赖性的。
因为EoAD的记忆障碍是由Aβ斑块的积累和海马小胶质细胞病变引起的。 31 我们对APP/PS1-BKO(30周龄)、3×TgAD-BKO(60~70周龄)和年龄和性别相匹配的对照小鼠的A型β斑块(6E10 Ab)和电离钙结合适配器1(IBA，一种小胶质细胞标记物)进行了免疫荧光分析。考虑到在此模型中，早期海马区A区β沉积与认知障碍有关 32 ，AD患者海马CA1区和海马CA1区萎缩增加。 33 ，在此基础上，我们对亚木耳进行了初步的分析。APP/PS1和3×TgAD小鼠(与健康对照组小鼠相比)Aβ斑块明显上调，APP/PS1-BKO小鼠和3×TgAD-BKO小鼠的A型TgAD-BKO斑块均明显升高(P<0.01)。 n =4-7，图1。 3A-C 和补充图。 3A-D )。对3×TgAD-BKO小鼠额叶皮质和海马的分析也显示可溶性Aβ的增加。 42 和一个β 40 被逆转( n =2-6，图1。 三维空间 和补充图。 3E )。由于3×TgAD和3×TgAD-BKO小鼠海马神经元中APP基因表达水平较高(见图)。 3E 我们的结论是B细胞缺乏的好处可能是Aβ肽的形成减少和/或清除增加。相应地，大的配子体小胶质细胞(>5μm) 2 )，表明功能失调过度激活 34 ,35 和β斑块的间隙受损 36 ，3×TgAD-BKO小鼠显著低于WT小鼠。 p < 0.05, compared with 3×TgAD, n =3-9，图1。 3F 和补充图。 3F，G )。相反，在APP/PS1和APP/PS1-BKO小鼠中，激活的小胶质细胞(不论大小)仍在增加。 第三代 和补充图。 3H )。为了了解这种差异，我们比较了小胶质细胞在这两种模型中的作用。用佛波醇12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯和离子霉素(Pmai)分离和刺激脑髓系细胞，诱导小胶质细胞因子的表达和增殖。 37 )在单能素存在下作用4~6h，然后表面标记物和细胞内小胶质细胞因子(CD 45)。 INT CD11b + )流式细胞仪分析。B细胞的丢失不影响白细胞介素1(IL)1β的表达，在3×TgAD和APP/PS1(补充图)中均显著上调。 4A 还有无花果。 4A 而不是描绘；门的策略在补充图中。 9B )。相反，我们注意到转化生长因子β明显减少。 + 和干扰素γ + 小胶质细胞(大概是静止的和静止的小胶质细胞) 38 ,39 ,40 )APP/PS1和3×TgAD小鼠。 4B、C 和补充图。 4B-D )。转化生长因子β + (较小程度的干扰素γ) + APP/PS1-KO和3×TgAD-KO小鼠的小胶质细胞均与WT对照水平相适应。 4B、C 和补充图。 4B-D )。脑和海马rna微阵列分析表明，B细胞缺乏可防止转化生长因子β1的丢失。 + 3×TgAD小鼠海马和脑小胶质细胞表达上调(图1)。 4D )而DAM相关的转录标志基因，如 伊特加克斯 , Cst 7 , Clec7a , Mamdc 2 ，和 SAA 3 (参考文献) 4 )在3×TgAD-BKO小鼠中被下调(补充图)。 4E ，补充数据 1 –3 ，和 Https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE165111 )。B细胞缺乏症不影响 IL1β 或其他水坝基因，如 肿瘤坏死因子α , IGF 1 ，和 Lilrb 4 (补充图。 4E 和补充数据 1 –3 )。总之，在AD的3×TgAD模型和APP/PS1模型中，尽管AD促进基因表达、DAM积累、Aβ斑块沉积以及疾病的进展都需要B细胞。
图3：B细胞缺乏可减轻AD小鼠海马Aβ斑块负担和小胶质细胞激活。 A –C 显示APP/PS1中的β斑块数目( A )和3×TgAD( B )小鼠( n 3×TgAD和3×TgAD-BKO小鼠的免疫荧光染色 C ，β斑块(绿色)，Iba 1 + 小胶质细胞(红色)和DAPI(蓝色)；鳞片，50μm。 D 可溶性Aβ的增加 1–40 和一个β 1–42 3×TgAD-BKO小鼠脑内肽被逆转。小鼠皮层ELISA检测结果 n =2-6)。B细胞缺乏对转基因表达无影响，3×TgAD和3×TgAD-BKO均在海马神经元中高表达转基因Happ。 E ，被6E10染成 B –C )。B细胞缺乏症可显著减少5~20μm的小胶质细胞数目(#)。 2 )在3×TgAD( n =3-9， F )，但在APP/PS1小鼠( n =4-8， G )。平均±扫描电镜显示，每个符号为一只老鼠。* p < 0.05; ***p < 0.001; NS not significant in Kruskal–Wallis test (A , B , G )或者是单向的 A (E , F ).
图4：B细胞缺乏至少部分逆转了DAM表型. 白细胞介素1(IL1)β的流式细胞术定量结果 + (A )和转化生长因子β + (B , C )小胶质细胞(CD11b) + CD 45 INT )在被指示的老鼠的大脑中( n =11-12)。APP/PS1小鼠遗传B细胞缺陷(APP/PS1-BKO) B 循环B细胞(aCD 20/B220， C )AD发病时(70~79周龄3×tgAD小鼠)逆转AD相关的转化生长因子β下降。 + 小胶质细胞。3×tgAD小鼠海马和脑(无海马)的基因芯片分析显示，B细胞缺乏(3×tgAD-bko)可上调转化生长因子β1的表达，而不上调转化生长因子β2和转化生长因子β3的表达。 D , n =3)。AD发病时B细胞(aCD 20/B 220)的治疗性耗竭改善了AD( E –G )，因为它明显减少了小窝中的Aβ斑块(量化和有代表性的图像显示在 E 和 F β斑块(绿色)和IBA 1 + 小胶质细胞(红色， F ), n =6-8；独立复制两次)。B细胞耗竭逆转干扰素γ的降低 + 3×TgAD小鼠的小胶质细胞 G , n =5-7)。平均±扫描电镜显示，每个符号为一只老鼠。门控策略如图所示。 9B . *p < 0.05; ***p < 0.001 in one-way ANOVA (A –C , G )或未配对 t 试验( F ).
接下来，我们试图测试Eoad的进展是否也可以被治疗性B细胞在疾病开始时的失活或耗竭所控制。为验证这一思想，3×TgAD小鼠(60~70周龄，雌性)腹腔注射抗CD 20/B 220抗体(使循环中的B细胞枯竭)2个月。对照组用同型配型IgG治疗.抗CD 20/B 220 Ab在循环中有效地耗尽了B细胞(补充图)。 5A )。与对照组相比，抗CD 20/B 220 Ab处理的3×TgAD小鼠OFA活性呈上升趋势。 p =0.07，30分钟， n =5，补充图。 5B )。然而，治疗后AD小鼠的Aβ斑块数量明显减少( p < 0.05, Fig. 4E、F ，但不影响大型(>50m)的数量。 2 )Iba 1 + 海马小胶质细胞(附图) 5C )。为了解这一差异，我们在60~70周龄3×tgAD小鼠群中重复抗CD 20/b 220 Ab治疗2个月。 n 然后用流式细胞仪对脑灌注后的小胶质细胞因子进行检测。如上所述，在3×tgAD-bko小鼠中，B细胞耗竭可显著逆转转化生长因子β的下降。 + 和干扰素γ + 3×TgAD小鼠的小胶质细胞几乎达到WT小鼠的水平(包括频率和数量)， p < 0.05, Fig. 4C，G 和补充图。 5D，E )而不影响IL1β + 小胶质细胞在3×TgAD和WT小鼠中均有较高的表达(附图)。 5F ).
为了验证这些结果，我们使用了第三只小鼠的EoAD模型，5×FAD小鼠在40周龄时出现了更具侵略性的AD病理，这是由于5个家族AD突变的加性效应造成的Aβ斑块的巨大负担。 41 。在这个模型中，其他人将AD的进展与潜在有益的B1A细胞的频率降低联系在一起。 42 。然而，我们的5×FAD小鼠队列中的B细胞，包括B1A和B1B细胞(在数量和频率上)并没有表现出与对照年龄匹配的幼鼠相比的减少(补充图)。 6A，B )。5×FAD小鼠的B细胞和B1细胞似乎被激活，因为它们显著上调了4-1BBL(附图4-1BBL)的表达。 6C，D )。脾细胞IC细胞因子染色显示B细胞IL 10、β和γ明显升高(附图)。 6E )。为检测激活B细胞的耗竭是否也能改善AD，采用5×FAD小鼠(35~47周龄，雌性)。注射抗CD 20/B 220抗体或对照IgG( n =7-12)，2个月。然后在OFA中评估小鼠的探索性行为和焦虑。对照IgG处理5×FAD小鼠的探索性行为明显低于WT小白鼠，而B细胞缺失小鼠则相反。 F (2，25)=5.25， p =0.013；wt vs 5×fad p =0.03，5×FAD+IgG vs 5×FAD+αCD 20 p =0.02，图1。 5A )。为了证实这一结果，我们对这些小鼠海马中的Aβ斑块和激活的小胶质细胞进行了定量分析。与IgG治疗相比，5×FAD小鼠B细胞减少了A型β斑块的数量(图1)。 5B、C )和大型iba 1 + 小胶质细胞 5D )。我们在一组年龄相配的雌性5×FAD和WT小鼠上重复了2个月的B细胞耗竭实验。 n (5~12)，用流式细胞术对生理盐水脑灌注后的小胶质细胞进行评价。转化生长因子β与3×tgAD和APP/PS1小鼠相似 + 和IL 10 + 5×FAD小鼠脑内小胶质细胞较WT小鼠明显减少(P<0.05)。 p < 0.001, Fig. 5 E、F )。B细胞耗竭逆转转化生长因子β的下降 + 和IL 10 + 5×FAD小鼠的小胶质细胞。 5 E、F )。与其他模型一样，这种治疗不会降低海马IL1β。 + 小胶质细胞(附图) 7A，B )，大概是为了支持β牌的清除。 43 。总之，我们的结论是，B细胞的耗竭可以延缓AD的进展，即使在疾病开始时也是如此。
图5：B细胞的治疗性耗竭改善了5×FAD小鼠的AD症状。 OFA试验表明，B细胞耗竭可改善5×FAD小鼠的迟发性运动。 A ，在前5分钟内行驶的总距离)。B细胞耗竭减少海马Aβ斑块负担( B , C )。β斑块(绿色)、IBA 1的代表免疫荧光染色图像 + 小胶质细胞(红色)和dapi(青色)显示在 B 。在……里面 C 和 D 并给出了β斑块和小胶质细胞定量的结果。 D ，大尺寸，5-20μm 2 )分别。 A –D 结果被复制了两次， n 7-12.脑小胶质细胞的流式细胞术评价(CD11b) + CD 45 INT )发现B细胞耗竭增加了转化生长因子β的发生频率(%)。 + (E )和国际法10 + (F )5×FAD小鼠的小胶质细胞( n =10-12)。免疫荧光染色显示，B 220 + 与WT对照组相比，5×FAD脑实质中的B细胞明显增多，短暂的B细胞耗竭后B细胞丢失。 G , n =9-12)。与WT对照组相比，5×FAD小鼠脑内IgG含量较高，B细胞瞬时耗竭也可逆转IgG水平。 H 和 I )。在……里面 H ，IgG是绿色的，Iba 1 + 小胶质细胞是红色的。脑IgG定量 I (n =5-7)。平均±扫描电镜显示，每个符号为一只老鼠。门控策略如图所示。 9B . *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 in one-way ANOVA (A , E , F , I )，Kruskal-Wallis试验( G )，或未配对 t 试验( C , D ).
然后我们想知道B细胞是否通过浸润大脑实质来促进AD。由于B细胞数量少(CD 45的<1%) + 流式细胞分析中检测到的细胞不能区分位于薄壁组织内外的细胞，我们对灌注和冷冻保存的小鼠脑切片进行了免疫荧光染色。与对照年龄匹配的WT小鼠大脑不同，我们清楚地检测到5×FAD小鼠额叶皮质和海马组织中的B细胞明显增加(图1)。 5G 和补充图。 7C-E )。重要的是，B细胞减少的5×FAD小鼠几乎完全失去了B细胞的增加。 5G 和补充图。 7D，E )，暗示细胞起源于循环。我们还对脑切片进行了IgG染色。而WT小鼠的脑内几乎没有免疫球蛋白(如图所示)。 5H，i 5×FAD小鼠海马实质内易检出大量IgG灶，常与小胶质细胞和A型β斑块共存。 5H，i )。这种脑IgG的增加在B细胞缺乏的5×FAD小鼠中丢失(图1)。 5H，i )。然而，这种耗竭并不影响总IgG水平，也不影响循环中Aβ特异性抗体的微量(补充图)。 8A-C )，暗示脑实质中的B细胞产生IgG，并可能促进AD。
