Caramba：用无病毒法制备sLAMF 7 car-T细胞的首次人类临床试验睡美人基因转移治疗多发性骨髓瘤

嵌合抗原受体(CAR)-T细胞治疗的临床发展得益于合成生物学、基因工程、临床级制造和复杂物流等方面的进展，从而将药物产品分发到治疗地点。Cra mba项目的一个主要目标是为使用先进的无病毒car基因转移提供概念的临床证明。睡美人(某人)转座子技术SB转位在CAR-T工程中是很有吸引力的，因为通过优化超活性SB100X转座酶和转座子组合使稳定的CAR基因转移率高，分别由mRNA和小环DNA编码，作为首选的载体实施例。这种方法具有便利和加速病媒采购、汽车-T制造和分销的潜力，并有可能提供安全、有效和经济上可持续的治疗。作为Sb基CAR-T细胞的典型和新靶点，CARAMBA联合选择了多发性骨髓瘤中的SLAMF 7抗原。SLAMF 7 CAR-T细胞在体外和体内的临床前检测中赋予了有效和一致的抗骨髓瘤活性。CARAMBA临床试验(阶段I/iIA；eudraCT：2019-001264-30)研究了自体SLAMF 7 CAR-T细胞的可行性、安全性和抗骨髓瘤的效果。Caramba是欧洲第一个使用无病毒CAR T细胞的临床试验，也是世界上第一个使用先进SB技术的临床试验。

基因工程嵌合抗原受体(CAR)T细胞过继免疫治疗是细胞和基因治疗的重大突破和成功案例。针对CD 19抗原的CAR-T细胞治疗是治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和外套细胞淋巴瘤的一种有效方法，针对多种替代抗原的CAR-T细胞产品正在血液学和肿瘤学方面进行研究。

目前有三种CD 19车载T细胞产品，即kymriah™(基于慢病毒载体)、yescarta™(γ-逆转录病毒载体和Tecartus™(γ-逆转录病毒载体)，已获得fda和ema的市场授权。这三种产品都是自体的，基因工程的CAR-T细胞，它们都经历了体内外基因的传递，然后再给病人注射(图1)。1)。目前的体外自体CAR-T细胞治疗模式包括在白细胞采集中心收集患者T细胞的劳动、时间和成本密集型供应链，运输到集中式制造设施进行CAR基因转移和T细胞扩增，并将冷冻细胞产品运回医院进行治疗(如图所示)。1).

有强烈的兴趣和需要促进汽车-T细胞治疗的制造和供应，以确保这种治疗确实可以整合并成为临床实践中的“常规”，并确保患者能够适当和平等地获得这种治疗。我们和其他人认为无病毒基因转移技术是通过促进基因工程治疗细胞的简化和成本效益的制造来确定可持续市场价格的关键杠杆。因此，我们一直致力于无病毒应用。睡美人(B)用于汽车T细胞工程的基因转移。CARAMBA项目是这项技术在人类首次临床应用中最先进的体现。

CARAMBA项目的中心目标是对患有多发性骨髓瘤(MM)的患者进行sLAMF 7特异性car-T细胞的首次人类临床试验。CARAMBA联盟由来自6个欧盟国家的10个合作伙伴组成。这包括四个骨髓瘤临床护理和研究中心：Würzburg大学医院(德国)、Ospedale San Raffaele医院(意大利)、Navarra大学(西班牙)和医院区域和大学中心(法国)。进一步的项目合作伙伴包括欧洲骨髓瘤患者组织、良好制造实践(GMP)制造商DRK-Blutspenddienst Baden-Württemberg-Hessen(BSD-BRK，德国)、Paul Ehrlich研究所-联邦疫苗和生物医学研究所(德国)、设在瑞士的生物技术公司NBE-治疗技术公司、总部设在德国的T-CURX，以及法国项目管理供应商ARTTIC S.A.S。欧洲委员会在Horizon 2020研究和创新计划中从大量具有高度竞争力的项目提案中选择了CARAProject MBA。CARAMBA项目的启动始于2018年1月，该项目的持续时间已计划为52个月。

DNA转座子是具有改变其在基因组中位置的能力的遗传元件。1]。在自然界中，这些元素作为携带转座酶结合位点的DNA中的移动(“跳跃”)单元而存在，其两侧有一个转座酶基因，由末端倒置重复序列(TIRS)组成。重要的是，转座子的两个功能成分(TIRS和Transsposase)可以以双组分载体系统的形式分离(见[2, 3])。基于转座子的载体能够将转座子之间几乎所有感兴趣的dna序列结合起来，并通过以下方式进行动员：反式-补充转座酶。2)。在转位过程中，转座酶介导从供体载体中切除元件，然后将转座子整合到染色体位点中(如图所示)。2)。这一特性使转座子成为能够有效整合基因组的非病毒基因传递系统，可作为基因工程(包括基因治疗)中广泛应用的工具。3]).

根据从鱼类基因组中分离出来的古而不活跃的转座子序列，重建了一个活性转座子，并以格林兄弟的著名童话命名为SB。4]。SB是第一个能够在脊椎动物细胞中有效转位的转座子，从而为基因工程提供了新的途径，包括基因治疗。2, 3, 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14])。SB转座子基因传递的优点在于它结合了病毒载体和裸dna分子的优点，即(I)转基因盒的永久基因组插入可使转基因表达持续有效。7]，(Ii)与非整合病毒载体不同，病毒载体在体内重复给药可引起对载体编码蛋白的免疫反应。15)，只需单一剂量的SB载体，就会降低体内免疫原性[16，(Iii)与腺相关病毒载体[17, 18]和逆转录病毒载体[19, 20]，对于基因货物的大小，sb载体没有严格的限制[21, 22]、(Iv)优越的生物安全概况[10, 23,24,25,26,27]和(V)与病毒载体不同的是，转座子载体可以作为质粒DNA来维持和传播，这使得它们制造起来既简单又便宜。12，这是临床实践中实施和推广的一个重要考虑因素。

SB转位非病毒基因传递在为一系列单基因疾病提供创新和潜在的治疗方法方面具有突出的潜力。5,6,7,8,9, 11,12,13,14, 28,29,30,31,32,33])。仅举几个例子，候选疾病包括与生俱来的错误，如酪氨酸血症I型、粘多糖或脂蛋白受体缺乏、肺疾病如囊性纤维化、家族性肺纤维化、原发性肺动脉高压、血友病A和B等凝血障碍、镰状细胞病等球蛋白病、各种形式的大疱性表皮松解症(由某些层粘连蛋白或胶原基因突变引起)、肌肉营养不良综合症和年龄相关性黄斑变性。此外，癌症被认为是一种治疗靶点，要么通过直接靶向肿瘤细胞，要么通过过继免疫疗法间接治疗。14]).

SB于2011年成功进入临床阶段，两项临床试验作为第一批非病毒载体用于产生CD 19特异性car-T细胞，用于针对NHL微小残留疾病的辅助免疫治疗，以及所有自体免疫治疗(n=7，ClinicalTrials.gov标识符NCT 00968 760)或异基因(n=19，ClinicalTrials.gov标识符NCT 01497184)造血干细胞移植(HSCT)[34]。自体HSCT术后30个月无进展，总生存率分别为83%和100%.异基因HSCT后12个月率分别为53%和63%.未观察到急性或晚期毒性和移植物抗宿主病(GvHD)的恶化(在异种环境中)。这些试验研究确定了安全性，并说明了在汽车-T工程中使用锑的潜力.此外，最近有报道[35[]用SB系统构建的供体来源CD 19 CAR细胞诱导杀伤细胞(CIK)在I/II期试验(NCT 03389035)中表现出高膨胀、低毒、完全缓解的特点。CIK细胞具有良好的安全性，异基因细胞移植后GvHD的发生率极低；因此，本研究提供了证据，证明用SB转座子构建的供体细胞是所有患者在异基因HSCT后的一种安全有效的治疗选择，即使移植来自不匹配的供者。目前，利用SB基因转移技术进行基因治疗的临床试验共有14项，计划中还增加了14项。14].

将SB转座子系统送入细胞的典型装置是作为常规质粒提供载体系统的两个组成部分(图1)。2)。然而，裸质粒DNA的使用与阻碍其基因治疗的几个问题有关。首先，通过电穿孔或其他dna转染技术将质粒DNA导入原代细胞的效率一般较低。36, 37]。事实上，基于sb基因转移的car-T临床应用依赖于提供转座子和转座酶的质粒载体的使用，从而限制了稳定的基因转移水平，从而要求进行长时间的体内外培养，以获得治疗患者所需的car-T细胞剂量[34]。第二，裸露质粒dna的转移通过一种与tlr 4或tlr 9刺激无关的Ⅰ型干扰素(IFN)对人T细胞的剂量依赖性细胞毒性而损害细胞活力。38]，表明质粒DNA是由天然免疫系统的细胞内DNA传感器识别的。最后，质粒载体中通常存在的抗生素耐药基因的存在引起了基因治疗中的安全问题，这是由于水平基因转移的潜力。SB载体技术的最新进展表明，利用小环(MC)载体编码转座子和在体外转录反应中合成的mRNA或重组蛋白来编码转座酶，可以提高SB基因传递的效率和安全性。38,39,40,41](图1.2).

MCS是为应用于非病毒基因传递而开发的超螺旋、极简式表达盒.它们是通过分子内重组过程从亲本质粒中提取的，在此过程中，大部分细菌主干序列从载体中被耗尽。42]。因此，MC载体的大小明显减小。在SB转座子基因传递的背景下，我们至少考虑了与MC载体相关的三个优点。首先，MCs在整体基因转移效率方面优于质粒，因为它们比质粒更有效地跨越细胞膜(细胞膜和核膜)。43, 44]。其次，MC转座子载体中转座子之间相对较短的~200 bp距离可能有助于转位反应[45]。第三，治疗载体中缺乏细菌质粒骨架元件与临床应用高度相关，因为包含在治疗细胞产品中的抗生素耐药基因可能引起安全性问题。

利用体外转录的mRNA编码转座酶为治疗细胞工程提供了额外的优势。例如，原代人类细胞，包括造血干、祖细胞和T细胞的电穿孔，与质粒DNA核移植相比，其细胞毒性明显降低。39, 40, 46]。这很可能是因为RNA不能在转染的T细胞中引起细胞干扰素反应。38]。第二，mRNA绕过了转录的需要，因此，一旦转染，就可以立即在细胞质中进行蛋白质翻译。最后，实现Sb转座酶瞬时传递的mRNA源增加了这一方法的生物安全性，因为mRNA不承担染色体整合的风险，从而减轻了由于长时间和不可控的转座子表达导致已整合的SB转座子的持续清除而导致基因组不稳定的潜在风险。

最近证明，将mc技术与合成mrna技术相结合，可使sb转座子载体的先进car-T细胞工程在人类T细胞中具有更高的稳定基因转移效率。39, 47]。因此，CARAMBA联盟决定采用独特的mRNA组合，编码SB100X超活性转座酶[37]并携带装有SLAMF 7车的SB转座子的MC载体。

战略设置和方法

为了便于首次在人CARAMBA中进行针对难治性MM中SLAMF 7抗原的自体T细胞的实验，我们建立了一种全新的制造工艺，利用我们的临床前期工作。48]。结果的过程(图。3)遵循国家和欧洲法律和准则规定的严格的GMP框架。CARAMBA制造过程伴随着大量的过程内控制(Ipc)，以减轻风险，并有大量的经过正式验证的质量控制测试，既作为预定义的质量规范，也作为“仅供信息”的辅助测试，以确定cra mba产品的药品质量(表)。1)。过程开发遵循从研究实验室开始的临床前过程技术转让的通常顺序，确定和鉴定合适的起始材料和原材料，确定规格，并开发必要的测试，包括正式的鉴定验证、过程升级和过程验证。获得了CARAMBA IMP的制造授权，同时得到国家主管监管机构的协议审查和批准。

GMP条件下SB基因转移的实施

该基因转移系统由两部分组成，如上文所强调的，它们是通过电穿孔共转染的(Nucleofector，Lonza，BaselCh)。与以前的治疗性基因转移相反34]，CARAMBA项目利用了最近关于SB基因转移有效性和安全性的两项技术进展：体外转录mRNA(BioNTech，Mainz，德国)，编码最先进的超活性sb100x转座酶[37]和MC载体(质粒工厂，德国比勒费尔德)[39, 49编码SLAMF 7汽车。将mRNA作为转座酶的来源，可使转座酶在SLAMF 7 CAR-T细胞中的瞬时表达和快速丢失[47，这对于监管机构批准CARAMBA试验至关重要。汽车盒式录音带(无花果)3A)以前曾被描述过[48]；它是一种传统的第二代CAR，具有CD 28衍生的共刺激结构域，并共同表达截断的EGFR(TEGFR)盒[50]通过T2A序列。TEGFR为药物抗体西妥昔单抗所认可，可用于三个目的：(1)在制造和配制过程中定量检测car传导细胞；(Ii)检测病人血液中的car-transducted细胞；(Iii)在严重毒性情况下，用治疗剂量的cetuximab进行car-T细胞耗竭[50]。CAR的靶向结构域来源于抗SLAMF 7抗体的靶向性，其安全性和耐受性已被证实。51].

过程概述

Caramba细胞制造(图1.3B)总共需要14天。从未动员的针对≥5×10的白细胞清除术开始9白细胞总数(Wbc)，白细胞被分裂，使得这两个部分包含的CD4总数大致相同。+和CD8+T细胞，从此以后是分开处理的，尽管是相同的和同步的(如图所示)。3B)。这两批细胞对CD4都有富集作用。+或者是CD8+T细胞采用临床级抗体微珠复合物和缓冲液的免疫磁选择，在开放系统中研究规模为Miltenyi磁柱(试剂、消耗品和硬件：Miltenyi Biotech，Bergisch-Gladbach，德国)。这些细胞是按顺序处理的，在一个A在B洁净室的环境中。分离产品上的IPC包括不育(bact/Alert硬件和瓶子，BioMérieux，Nürtingen，德国)，总存活WBC和CD4分离的T细胞计数。+和CD8+数数。免疫磁分离后的IPC包括总活CD4的回收、纯度和计数。+或CD8+细胞，[FACS Canto II流式细胞仪，Diva软件，抗体和试剂，Becton-Dickinson，Heidelberg，德国，除自我标记的西妥昔单抗(ImClone，Eli Lilly，印第安纳波利斯，IN，美国)和Alexa Fluor 647标记试剂盒(LifeTechnologies，Bleiswijk，荷兰)]。纯度通常接近100%，具有良好的活力，但回收率在20-30%范围内表明有改进的潜力。T细胞活化2天，CD4细胞分别活化。+和CD8+T细胞，用CD3/CD 28交联剂(Dynabeads)®CD3/CD 28 CTS；Gibco-Life Technologies，挪威奥斯陆)，与SB100X转座子酶mRNA和SLAMF 7 Car MC共同电穿孔，在G-Rex培养瓶中再扩增12天，第6天去除珠使培养基完全改变，第12天增加半中位变化。每2/3天增加一次IL-2。第14天，收集细胞，按1：1的比例(允许范围：0.5：1-2：1)配制药物产品。+和CD8+T细胞阳性。与目标剂量范围相对应的细胞剂量被悬浮在盐水缓冲液中，其体积为1mL/kg体重。质量控制测试，包括规范描述和辅助测试，都是对cd4的大量混合进行的。+小汽车+和CD8+小汽车+和/或最终药品。CARAMBA产品尽快注入新鲜，但不迟于处方后48h。在4-8°C时，CARAMBA产物至少稳定72小时，这一点在指定的稳定性练习中得到了正式证明。

配方和装运

一个特别的挑战是，在第一阶段研究过程中使用一个剂量发现臂的T细胞剂量的范围特别广泛，因为较低的剂量会导致细胞浓度远远低于常规细胞计数器检测的技术水平，从而禁止评估最终药物产品中的细胞剂量-只有10,000个细胞-在1毫升/千克体重的接受者体重范围内。最后的输液袋至少过量了20%；由于不孕症，内毒素(Endosafe NexGen PTS硬件和消耗品，Charles River，Sulzfeld，德国)和支原体检测(Microsart ATMP支原体，Sartorius，G ttingen，德国)，以及保存样品和辅助测试，都会立即取出。后者包括载体拷贝数分析，采用数字滴状PCR(QX 200，BioRad，Feldkirchen，德国)和广泛的T细胞表型。利用维克托X4多标签平板阅读器(德国罗道珀金埃尔默)或用MM.1S细胞进行异种移植的NSG小鼠(ATCC参考文献)进行4小时Europium分析，还评估了在体外和体内提供的剩余细胞的有效性。以CRL-2974为靶标，通过westernblot和载体插入位点谱分析，检测SB100X蛋白的残留。所有后一种，而不是规范-定义的检验，遵循正式建立的协议和包括相关的控制，但不像那些定义产品规格没有根据欧洲药典指南进行验证。CARAMBA产品由一名合格的德国红十字会血液服务人员和一名赞助商代表向患者发放。

CARAMBA临床试验包括I期剂量上升部分和IIa期剂量扩张部分，并将招募多达38名MM患者。CARAMBA临床试验将在德国、西班牙、法国和意大利的特定地点招募。为了参与CARAMBA的临床试验，患者必须满足一些包容和排除标准，例如，患者必须至少接受过三种先前的治疗，包括蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米和卡夫唑米)、免疫调节剂(如来那度胺或柚皮酰胺)、单克隆抗体(如达瘤单抗)，以及大多数患者接受了高剂量化疗和随后的自体HSCT治疗，才有资格接受这一治疗。此外，患者必须有可测量的骨髓瘤疾病标志物。以前接受过针对SLAMF 7的单克隆抗体elotuzumab治疗的患者有资格参加CARAMBA临床试验。由于CAR-T细胞治疗是一种很强的治疗方法，可能有细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性等潜在副作用，因此患者也需要有良好的表现状态，这是通过东方合作肿瘤组(ECOG)评分来衡量的。患者必须有低于2的ECOG评分，这意味着更高的健康水平，以参加试验。患者必须有足够的心脏，肝脏和肾脏功能，通过超声和血液检查，才能确定他们是否符合CARAMBA试验的资格。接受过异基因HSCT治疗的患者，如果HSCT发生在计划的白血球发生日期之前至少12个月，就有资格参加CARAMBA试验。患有gvHD并服用药物以抑制其免疫系统的患者或包括艾滋病毒、梅毒、乙型肝炎和丙型肝炎在内的活动性感染患者不符合参加CARAMBA试验的资格。CARAMBA临床试验的关键分析终点包括使用sLAMF 7 CAR-T细胞治疗骨髓瘤的可行性、安全性(根据不良事件的数量和严重程度(如CRS和神经毒性)评估)以及抗骨髓瘤疗效。此外，CARAMBA临床试验还将测量CARAMBA临床试验中CARAMBA临床试验的生活质量和医院资源利用情况。

MM是一种罕见的恶性血液病的异常浆细胞。MM的常规治疗包括化疗和蛋白酶体抑制剂等新的药物；然而，在过去的十年中，MM治疗被重新定义为体液和细胞免疫疗法。CAR-T细胞治疗是MM治疗中最令人兴奋的新进展，而针对B细胞成熟抗原BCMA的CAR-T细胞的应用已经有了新的临床证据。一些bcma car-T细胞产品目前正处于临床开发阶段，对于那些已经复发且对所有已建立的抗MM治疗无效(难治性)的患者来说，已经取得了很高的应答率。52]。总体而言，BCMA CAR-T细胞治疗显示出良好的安全性，CRS和神经毒性发生率较低.然而，bcma car-T细胞的临床经验也暴露出与靶向这种抗原相关的一些挑战，复发或耐药的潜在机制包括抗原下调甚至丢失。53]。目前正在采取几种策略来应对这些挑战，包括使用γ-分泌酶抑制剂来提高MM细胞的bcma分子密度和减少血清中可溶性bcma的数量。54]并使用具有明确T细胞子集组成和人性化靶向结构域的CAR产品，以降低免疫原性，促进植入和体内扩张[55].

此外，我们正在努力在MM中识别和验证额外的CAR靶抗原，我们已经将SLAMF 7作为CARAMBA试验中的一种新的候选抗原进行了评估。几项研究表明，恶性浆细胞上存在高水平的、均匀的SLAMF 7表达；一幅具有代表性的图像如图所示。4A。重要的是，SLAMF 7在复发/难治性多发性骨髓瘤(MM)患者中仍有表达，在强化治疗后仍有表达。48, 56, 57]。在以前的工作中，我们已经证明T细胞表达一个SLAMF 7 CAR。4B)在体外和体内的临床前模型中，抗MM的能力明显高于抗sLAMF 7抗体elotuzumab[48因此，人们热切期待CARAMBA临床试验的结果。

在ClinicalTrials.gov上，使用“car-T”作为查询术语出现了数百条条目。事实上，针对血液和实体肿瘤的广泛抗原的临床试验目前正在开发中；因此，预计对CAR-T细胞疗法的需求将在不久的将来增加。然而，制造自体细胞产品(每一种治疗细胞批次只适用于分离细胞的病人)的成本预计将成为主要的瓶颈，有可能限制整个地理区域和社会获得这些新药的机会。此外，集中式和高度专业化的GMP生产设施的制造能力可能会耗尽，特别是如果CAR-T疗法将适用于影响更多患者群体的更常见的癌症形式。因此，为了在不久的将来解决对CAR-T疗法的重大和可预见的需求[58]为使更广泛地获得这种治疗，目前正在研究更适合于减少细胞产品的生产时间和成本的制造协议，在这方面，CARAMBA项目取得的进展是进入汽车-T细胞疗法新时代的一个突破。

SB具有降低基因治疗产品(如CAR-T细胞)制造成本的巨大潜力，从而提高公众的可用性。目前的估计约为每名病人减少90%的病媒制造成本[12]，因为按照SB系统的要求，GMP级的裸核酸制造很容易扩展，并且不需要耗费大量工作和时间的额外质量控制。与病毒基因转移相比，SB技术还有其他优势，即生物安全水平较低，生产和质量控制的基础设施成本较低，模块化程度较高。最近，通过对SB100X蛋白的一些修饰，产生了重组的可溶性SB蛋白。41]，这将在未来允许更短的体内外种植，具有明显的生物和经济利益。

汽车改装CD4的分离生成与扩展+和CD8+T细胞允许以1：1的比例优化两者的配方，尽管它可能会牺牲一些扩展潜力，特别是CD8。+T细胞由于缺乏T细胞的帮助，然而，这很容易被较高的起始细胞数目所补偿。CD4分离+和CD8+细胞独特地允许使用不同的CAR结构，因为新的证据似乎表明，对协同刺激域的不同偏好有利于CD8的快速启动和增殖。+CD4的寿命+细胞[55, 59, 60为支持CARAMBA研究而建立的高度模块化的过程，可以很容易地和低成本地适应任何其他汽车或TCR-T或NK效应细胞产品，因此具有远远超出CARAMBA和MM的价值。

鉴于主要制药公司在细胞和基因治疗以及免疫肿瘤学领域与转基因免疫效应细胞(通常为自体免疫效应细胞)的大量投入，学术界为何仍活跃于这一高度竞争的领域？现有的公共研究资金数额已经相当有限，典型赠款的规模和持续时间大大低于适当开发药物所需的数额和期限，任何此类建议失败的可能性都是过大的。然而，在可预见的未来，我们预计，细胞和基因治疗领域的大多数创新，尤其是汽车-T细胞疗法，将继续从学术机构中汲取，直到工业界发展出自己的专门知识，并适应于将真正新颖的细胞产品从长凳上引入临床应用所需要的风险和勇气。很多时候，这些想法会被工业界所接受并发展成适销对路的药品，我们预测CARAMBA的一些创新将是其中之一。