乳腺癌浸润B淋巴细胞的成对单细胞RNA序列分析及抗原受体谱分析

为了了解肿瘤浸润免疫细胞，特别是B淋巴细胞的功能和发育动态，我们结合单细胞RNA测序和抗原受体谱系分析，对大量三阴性乳腺癌浸润免疫细胞进行了分析，并报道了肿瘤浸润B淋巴细胞的综合图谱。单细胞转录谱显示肿瘤浸润的B细胞亚群具有显著的异质性.单细胞抗原受体分析表明，与外周血相比，肿瘤浸润B细胞具有更成熟和记忆性更强的B细胞特征、更高的克隆性、更多的类切换重组和体细胞高度突变。联合分析提示乳腺肿瘤内浸润性记忆B细胞的局部分化。基于单细胞RNA测序结果的B细胞信号与乳腺癌患者的生存率显著相关。对肿瘤浸润B细胞群体的功能分析表明，B细胞亚群可能通过各种途径促进免疫监视。进一步解剖肿瘤浸润的B细胞群将为肿瘤免疫治疗提供有价值的线索。

虽然免疫系统在肿瘤发展和治疗中的作用早已被提出，但它们在最近才被人们认识和机械地研究。1,2。先天免疫系统(巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、髓系细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞)和适应性免疫系统(T和B淋巴细胞)都有助于建立免疫抑制性肿瘤微环境，这是癌症的特征之一。3。更具体地说，适应性免疫系统在对特定抗原(如肿瘤抗原)的初始反应后产生免疫记忆，并在随后与该抗原发生接触时产生增强的反应，以提供持久的保护。因此，在肿瘤发生发展过程中，它在肿瘤免疫监测假说和免疫编辑假说中起着至关重要的作用。4.

T淋巴细胞介导的适应性细胞免疫在肿瘤免疫应答中具有重要作用。5B淋巴细胞在肿瘤发展和治疗中的作用，无论是阳性的还是阴性的，都是最近才被提出来的，目前仍有很大争议。6,7,8,9,10,11,12,13。B细胞可能通过抗体的产生、抗原的提呈、细胞因子和趋化因子的产生以及其他免疫调节机制参与肿瘤的免疫学研究。14,15,16,17。例如，调节性B(Breg)细胞可能通过分泌细胞因子(如IL-10)和/或与靶细胞相互作用，在维持免疫稳态方面发挥重要作用。6,7,18,19。有趣的是，最近的三项研究20,21,22表明当个体接受免疫治疗时，B细胞和三级淋巴样结构(TLSs)可能与更好的预后相关，尽管详细的细胞和分子机制仍有待确定。

肿瘤浸润性T(TIL-T)细胞最近通过单细胞RNA测序(rna-seq)被鉴定为多种肿瘤类型。23,24,25,26,27,28,29,30。然而，完整的肿瘤浸润B(TIL-B)细胞图谱仍未找到.B细胞通过B细胞受体识别抗原。在B细胞发育和分化过程中，BCRs的多样性是由V(D)J重组、体细胞超突变(SHM)和类开关重组(CSR)产生的。31,32。抗原受体库分析提供了直接的发育谱系信息。32,33。为了深入了解浸润性免疫细胞(尤其是B细胞)在乳腺癌中的功能和发育动态，我们结合抗原受体克隆谱系分析和单细胞RNA-seq分析，提出了一套TIL-B细胞bcr序列、克隆谱系和转录特性的图谱，为B细胞肿瘤免疫学的研究奠定了基础。

人类乳腺癌是一种异质性疾病，含有多种组织学上不同的亚型。34,35。我们分析了浸润的hCD 45。+流式细胞术检测新分离的乳腺癌组织中hCD 19的表达+/20+B细胞在三阴性乳腺癌(TNBC)中明显高于其他乳腺癌亚型(补充图)。1)。为了鉴定浸润性免疫细胞，尤其是B细胞在人乳腺癌中的作用，我们纯化了hCD 45。+6例TNBC(TNBC-6和PBMC 1-6)、3例A腔A型乳腺癌(LABC 7-9和PBMC 7-9)、1例HER 2阳性乳腺癌(HER2BC10和PBMC 10)患者手术分离的乳腺癌组织及相应外周血单个核细胞(PBMC 10)中的细胞。1A)。其中9对(TNBC 2-6，LABC 7-9，HER2BC 10，PBMC 2-10)用液滴基(10×基因组)技术制备了5‘单细胞RNA-seq文库。26,36，而另一对(TNBC 1和PBMC 1)则用于3‘库的建设(补充表)1和2)。此外，还获得了所有5‘库的单细胞免疫库信息，包括bcrs和T细胞受体(Tcrs)(补充表)。3和补充数据1).

采用组织学分析、免疫组织化学(IHC)和荧光原位杂交(FISH)技术对乳腺癌标本进行亚型鉴定。1A)。根据国际TIL工作组的指导方针，将肿瘤间质中的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)评定为占占基质面积的百分比。37,38(无花果)1A).

质量控制后去除潜在细胞双链39我们从10个肿瘤样本中获得了44,497个单细胞的rna-seq数据，每个细胞有1573个中间基因，从相应的外周血样本中获得了68,441个单细胞和1651个中位基因的单细胞(补充表)。2)。无监督聚类40在低分辨率的这112,938个单细胞从所有的测序样本显示了四个主要的细胞簇，包括T细胞(标记为CD3D表达)，B细胞(CD 20)、NK细胞(NKG 7)、巨噬细胞/单核细胞/中性粒细胞(CD 14)(图1.1B和补充图。2A)。来自不同样本的细胞对每个簇的贡献相似，表明缺乏样品批处理效应(补充图)。2B-d和补充表4)。不同浸润的淋巴细胞群在各肿瘤中的分布在不同患者之间是不均匀的(如图所示)。1C)。例如，B细胞在肿瘤标本中所占比例在4.6%至50.5%之间，平均为22.1%。T细胞占21.4%~73.7%(平均46.2%)，NK细胞占0.5~5%(平均2.6%)。

利用10×基因组学5‘V(D)J和基因表达铬平台，确定了每个B、T细胞抗原受体位点的重排状态。经过质量控制，我们重新组装了BCRs(IgHTCRs(TCRα-β对)和TCRs(TCR对)分别用于26,401个B细胞和44,621个T细胞，除了TNBC 1/PBMC 1(补充图1)。3和补充表3)。其中，有5951个B细胞和16485个B细胞含有单一生产力。IgHBC和PBMC样本的等位基因(补充图)。3)。由于TNBC肿瘤有更多的浸润B细胞(补充图)。1B在其余的分析中，我们主要关注5例TNBC患者的B细胞(TNBC 2-6和PBMC 2-6)。单生产分析IgHTNBCs中3695个浸润的B细胞和相应PBMC中8037个B细胞的重排没有显示肿瘤与PBMC之间VH、DH或JH基因使用的差异(附图)。4A)。然而，在TNBC中浸润的B细胞所占比例较高。IgG-阳性细胞和较低的百分比IGM-和IGD-阳性细胞比外周血中的阳性细胞(图1)。2A和补充图。4B)。与这一发现相一致的是，B细胞与生殖细胞产生的比例是一致的。IgHTNBC肿瘤的等位基因显著降低(图一)。2A)，提示大部分浸润于TNBC的B细胞均遇到抗原，并经历BCR活化。SHM分析41,42从整体上看，TNBC浸润的B细胞明显增多。IgH突变比PBMCs(图1)。2B)。有趣的是，这一差异不仅是由于种系百分比较低所致。IgH-肿瘤中含有细胞--浸润的B细胞。非种系和非交换的SHM率(IGM-和IGD-阳性)B细胞在肿瘤中也明显高于PBMCs(图1)。2B)。整体而言，tnbc与pbmc样本间无显着性差异。IgH变异类型除G>T(附图)。4C-d).

我们可以鉴定出含有相同重排和突变的单个B细胞IgH等位基因和B细胞克隆，其中所有B细胞都有相同的生殖系IgH(补充图。4E)33。如图所示。2CTNBC-浸润B细胞的B细胞克隆率(19%比7%)明显高于PBMCs中的B细胞克隆(19%vs.7%)，比PBMC中的B细胞克隆更大、更复杂(图1)。2C和补充图。4F)。TNBC克隆的SHM率高于PBMC克隆的SHM率。二维空间)。不同肿瘤标本不具有共同的B细胞克隆。

公共克隆是不同群体共享的克隆类型。43,44。当将TNBC患者的克隆型匹配到Briney等人的数据集时。45PBMC和TNBC标本中均检测到公共克隆，其中PBMC为2.50%(193)，TNBC为2.23%(72)，TNBC与PBMC之间差异无显着性(P>0.05)。p=0.45)(附图。4G).

在TNBC肿瘤中，LABC和HER 2BC肿瘤中浸润的B细胞也表现出相似的bcr(IgH)表型(附图)。5).

为了进一步分析TNBC中浸润B细胞的细胞多样性，我们分析了2526个和6106个具有rna-seq数据和一个单一合成产物的B细胞。IgH等位基因分别在肿瘤和外周血标本中。联合样本(TNBC2-6和PBMC 2-6)在低分辨率下的无监督聚类显示出四个具有不同转录特征的簇(如图所示)。3A，b、补充图。6–8，补充表5和补充数据2)。来自不同肿瘤和血液样本的细胞参与了每个簇，表明缺乏样本批量效应和保守的分化过程(补充图)。7C，d和补充表5)。这四组包括幼稚的B细胞(IGM+和IGD+)，内存B细胞(CD 27+)，血浆细胞(CD 38+)，以及CD 14+非典型B细胞(CD 14+)。与上述结果一致的是，在TNBC标本中浸润的B细胞主要是记忆性B细胞，而PBMC样本中含有更多的幼稚B细胞(图1)。3C)。这个IgH记忆B细胞和血浆B细胞的SHM率显著高于幼稚B细胞(附图)。9a，b)。总体上，不同B细胞组的SHM率均高于PBMCs，但PBMCs的SHM率高于TNBCs(附图)。9C，d).

精确IgHV(D)J和SHM信息对于单个B细胞，我们能够追踪B细胞在肿瘤中的增殖和分化。归一化后，在热图中显示B细胞克隆的簇内和簇间分布。IgH细菌系(图1.三维空间)，我们发现在TNBC浸润的B细胞中，记忆B细胞的克隆数最多，并且具有相同的推测性。IgH生殖细胞和浆细胞的克隆数最多，检测到的克隆数也最多。IgH顺序。

在较高的分辨率下，无监督聚类进一步将8632个B细胞分离成13个具有不同转录特征的簇(图1)。4A，b，补充图。8B，补充图。10A-d，补充表6，以及补充数据3)。通过组合分析已知B细胞标记基因的表达46,47,48多产IgH序列，我们注释了这13个子群。他们包括幼稚的B细胞(C1和C2)，IGM+CD 27+记忆B细胞(C3，C4，C6和C7)，IGM+CD 27−非典型记忆B细胞(C5)，类切换记忆B细胞(C8-C10)，血浆细胞(C11)，生发中心B细胞(C12)，以及CD 14+非典型B细胞(C13)。这些B细胞簇的组成在肿瘤和PBMC之间是不同的(见图)。4C和补充图。11).

生发中心B细胞(C12)的存在，CD1C高记忆B细胞(边缘区B细胞，C6)49，tnbc肿瘤中不同的类切换记忆B细胞亚群(C8-C10)提示在潜在的TLSS中局部进行csr和shm。50,51肿瘤内部。我们鉴定了T细胞簇中的T滤泡辅助细胞(Tfh)。补充结果)。此外，生发中心(C12)B细胞表达高水平的活化诱导胞苷脱氨酶(AICDA)和MKI 67，并表现出较强的增殖基因特征(附图)。10E)。用免疫组织化学方法检测CD 20、CD3、CD 21、Ki-67和PNAD(附图)也证实了TNBC的TLS结构。12ACD 20、CD3和CD 21的多重免疫荧光染色(附图)。12b)。通过CD 20、CD3和Ki-67的多重免疫荧光染色，我们还鉴定了TNBC中的增殖生发中心B细胞(附图)。12C)。以上结果提示TNBC肿瘤组织中存在功能活跃的生发中心。52.

我们还试图在TNBC中鉴定潜在的Breg细胞。尽管伊-10在单核细胞和巨噬细胞中可以很好地检测到基因的表达，我们不能识别出特定的。伊-10-表达B细胞群(附图)。13A，b)。颗粒酶B(GZMB)和PDCD 1表达，另外两个Breg标记基因(补充图。13C-f).

与TNBC一样，LABC和HER 2BC的TIL-B亚型分布相似。记忆B细胞亚群是肿瘤中的优势B细胞亚群，记忆B细胞的百分率显著高于PBMCs，而幼稚B细胞的百分比明显低于PBMCs(附图)。14).

为了检验TIL-B亚群的分布是否特定于癌症类型，我们映射了来自结肠癌的TIL-B细胞数据(n=2)，肺癌(n=2)和肾癌(n=3)53B细胞的4个亚组或13个亚组。记忆B细胞亚群是上述所有肿瘤类型中的主要TIL-B亚型，4种B细胞亚群在不同肿瘤类型中的百分比分布相似(附图)。15A)。对于13个B细胞亚群的百分比分布，同一肿瘤类型的样本在主体聚类分析中倾向于聚类在一起，但每种癌症类型的样本需要更多的样本来进一步证实这一聚类结果(补充图)。15B，c).

在tnbc样本中，主要是非交换记忆B簇(C4-C7)显著参与了IgHBCR无性系树4D)。特别是，CD 27−非典型性记忆B细胞(C5)的光内多样性最高，提示该簇内有更多的SHMs。在TNBC，CD 27−非典型记忆B细胞与IGM+CD 27+记忆B细胞(C4)，CD1C高记忆B细胞(C6)CD 24高记忆B细胞(C7)。

在相同的热图中IgH不同B细胞簇内部和之间的序列(图)。4D)，血浆细胞(C11)的比例最高。IgH在TNBC和PBMC样本中的簇内等位基因，表明它们的克隆扩展。然而，这些浆细胞(C11)的增殖评分最低(附图)。10E)。有趣的是，在TNBC，CD1C高记忆B细胞(边缘区B细胞，C6)的克隆扩增也明显高于其他集群。此外,CD1C高内存B细胞共享大量相同的IgH与其他B细胞集群一起使用，例如CD 99高记忆B细胞(C10)、血浆细胞(C11)和非开关记忆B簇(C4-C7)。

近年来，通过对人黑色素瘤浸润T细胞的单细胞分析，发现T细胞亚群与细胞增殖活性和肿瘤反应性有关。25。在我们的TNBC样本中，一些浸润的T细胞也显示出明显的持续增殖，这是通过细胞增殖和细胞周期标记(补充图)来评估的。16A，c)。相比之下，除生发中心B细胞外，大多数TNBC-浸润的B细胞(补充图)。16)，不活跃增殖。

B淋巴细胞浸润在乳腺癌及其他类型癌症中的作用仍存在争议9,10。在大多数研究中，浸润的B淋巴细胞的存在是由CD 20等泛B细胞标记物的IHC来确定的。我们推测不同浸润的B细胞簇在肿瘤免疫学中可能具有不同的功能，并且基于所有差异表达的标记基因的组合转录特征(补充表)7)单个B细胞簇可能是肿瘤存在的一个更好的指标。事实上，我们利用METABRIC财团的TNBC患者的表达数据和临床信息，发现幼稚B细胞和记忆B细胞的转录特征与TNBC患者的整体生存和无病生存显著相关(图一)。5A)。更重要的是，与经典的单个B细胞标记物相比CD 20在单因素和多变量的TNBC患者分析中，这些B细胞信号显示出更强的危险比(图1)。5B和补充图。17)，表明它们提供了比CD 20独自一人。

TNBC肿瘤标本有较高的表达幼稚和记忆B细胞特征比其他类型的乳腺癌(补充图)。18)。这两个B细胞征象与非TNBC患者的整体生存率和无病生存率无关(补充资料)。4)。我们进一步分析了肿瘤基因组图谱(TCGA)中不同类型癌症中朴素和记忆B细胞特征的表达水平(Https://www.cancer.gov/tcga)。如附图所示。19两种B细胞信号在不同类型的肿瘤中均有不同程度的表达。有趣的是，这些B细胞转录信号可能与不同肿瘤类型的预后有关。例如，在宫颈鳞状细胞癌和子宫颈腺癌(Cesc)、肉瘤(SARC)、皮肤黑色素瘤(SKCM)和子宫体子宫内膜癌(UCEC)患者中，记忆B细胞特征与更好的整体生存率和较强的HRs有显著的相关性(附图)。20和补充数据5).

免疫微环境在肿瘤的发生和治疗中起着至关重要的作用。1,2,54。当T细胞在肿瘤免疫学中得到广泛的研究和治疗的同时，B细胞的作用直到最近才被注意到。6,7,8,9,10。TIL-B细胞在各种肿瘤中已被确认并与预后更好或更差相关。10，如卵巢癌55,56、乳腺癌57,58、肺癌59,60、结直肠癌61，以及肾细胞癌62。特别是，TIL-B细胞与乳腺癌预后的关系一直备受争议。9，这可能与乳腺癌患者和B细胞亚型的异质性有关。13,63,64,65。我们重点研究了免疫原性最强的乳腺癌亚型TNBC，并通过配对的单细胞抗原受体库和全转录组测序对肿瘤浸润的B细胞群体进行了解剖。我们对TNBC浸润的B细胞进行了全面的单细胞分析，发现TNBC浸润的B细胞表现出更成熟和记忆性的B细胞特征。这些TNBC浸润的记忆B细胞具有较高的克隆性和广泛性。IgHCSR和SHMs，可能发生在肿瘤内，并经历肿瘤抗原识别。我们的结果也证实了功能活跃的生发中心在TNBC肿瘤中的存在。另一方面，我们无法检测到明显的调节性B细胞群伊-10在TNBC中的表达。以单细胞rna-seq结果为基础的TIL-B基因转录信号与TNBC患者的生存率有关，与经典的B细胞标记物相比，具有更好的预后。CD 20).

B细胞可通过多种免疫调节机制积极参与肿瘤免疫学研究。6,7,8,17。治疗性肿瘤反应抗体通过FC驱动的天然免疫效应介导肿瘤的溶解。此外，最近的证据表明，肿瘤抗原特异性抗体也可以驱动治疗性T细胞反应。15。肿瘤抗原特异性抗体在联合免疫治疗中发挥最大的抗肿瘤作用是必需的，这种联合免疫治疗既涉及先天免疫反应，也涉及适应性免疫反应。16,66。在动物模型中，肿瘤反应性B细胞过继转移可通过分泌抗体和激活T细胞免疫而导致肿瘤消退。14,67。活化的B细胞也能作为抗原提呈细胞有效地刺激肿瘤抗原特异性T细胞的应答。68,69。另一方面，消耗内源性B细胞是否能抑制或增强肿瘤免疫学仍是一个有争议的问题。17,70,71。我们发现，TNBC浆细胞免疫球蛋白的表达水平显著升高。IG)基因比PBMC血浆细胞(补充图)。21)。基因集富集分析(GSEA)还显示，参与抗原处理和提呈的基因以及干扰素-α应答基因在TNBC B细胞中的表达明显高于PBMC B细胞(补充图)。22)。有趣的是，这两组基因的相对表达水平在不同B细胞亚群之间有显著的相关性。最后，在METABRIC TNBC数据集中，朴素和记忆B细胞特征的表达水平可能与一般T细胞标记基因的表达高度相关(例如CD3G和CD8A)和不同T细胞群(如Tfh和组织驻留记忆T细胞)的基因标记(补充图)。23和补充表8)。在乳腺癌和卵巢癌患者中也观察到了类似的结果。57提示TIL-B细胞在肿瘤免疫学中可能与TIL-T细胞协同作用。

Breg细胞最初被定义为伊-10-表达B细胞，可调节其他免疫细胞，特别是T细胞的功能18,19,72。尽管在包括乳腺癌在内的各种人类癌症中已经发现了Breg细胞。19,73,74,75，我们无法清楚地定义Breg细胞的种群伊-10表情。通过分析巨噬细胞和单核细胞伊-10(补充图。13)，我们排除了单细胞测序的技术限制可能导致对伊-10B细胞表达。另外，伊-10-表达的B细胞不能与其他B细胞形成明显的团簇。此外，我们没有发现任何B细胞亚群的基因表达特征与TNBC患者的预后呈负相关。这些结果提示TNBC患者缺乏Breg细胞。有趣的是，在最近的tnbc小鼠模型中也没有检测到Breg细胞。17.

TIL-B细胞在TNBC中的起源和发育动态的鉴定将是下一个重要的问题。在此，我们发现TNBC中的TIL-B细胞与外周循环B细胞有不同程度的差异.特别是，浸润性记忆B细胞与最近定义的小鼠肺驻留记忆B(BRM)细胞有一些共同的特点。76。例如，他们的克隆BCRs与外周血中的循环B细胞没有明显的重叠。他们也有较高的bcr克隆性。由PBMC和TNBC B细胞组成的克隆树的BCR谱系分析表明，PBMC B细胞主要占据TNBC浸润记忆B细胞上游(附图)。24)。这些结果提示TNBC浸润的B记忆细胞可能在肿瘤内发育和分化。然而，为了完全确认它们确实是BRM细胞，与循环记忆B细胞相比，还需要进一步的工作。例如，识别这些优势bcr克隆的潜在肿瘤抗原。77了解肿瘤浸润B细胞在TNBC中的来源将是下一步迫切需要解决的问题。

解剖肿瘤浸润B细胞亚群的异质性，为揭示其在肿瘤发生和治疗中的作用提供了重要信息。需要进一步的研究，以探索导致肿瘤浸润的B细胞与更好的生存在TNBC患者之间的明确关联的机制。调节TIL-B细胞浸润、增殖和分化的途径可作为TNBC免疫治疗的新靶点。78,79.

虽然我们只对TNBC浸润的B细胞进行了深入的分析，但我们也获得了88,254种其他免疫细胞类型的单细胞转录数据和58,095个T细胞(HRA 000477)的单细胞TCR结果。这些数据对于了解肿瘤的整体免疫环境和不同免疫细胞类型之间的潜在相互作用，以及确定新的免疫治疗靶点具有重要意义。进一步研究TNBC中所有浸润免疫细胞类型的特征以及TNBC逃避人类免疫监视的机制，将为TNBC的免疫治疗提供必要的指导。我们的分析和实验策略也可广泛应用于其他肿瘤类型的B细胞分析。

试剂和抗体

荧光活化细胞分类(FACS)抗体包括PE抗人CD 45(生物图谱，猫#304008)(1：100稀释)，APC抗人CD3(生物联想，猫#300312)(1：100稀释)，FITC抗人CD 20(生物图谱，猫#302304)(1：100稀释)，FITC抗人CD 19(BioLegend，Cat#302206)(1：100稀释)。本研究使用的免疫荧光抗体包括CD3(Celnovte，CCM-0332)(准备使用，不稀释)，CD 20(Celnovte，CCM-0461)(准备使用，不稀释)，CD 21(Celnovte，CCR-0471)(准备使用，没有稀释)，pnad(BD，553863)(1：25)，Ki-67(Celnovte，CKM-0032)(准备使用，不稀释)。

病人样本

本研究经新乡市中心医院人类研究伦理委员会批准。所有参与的患者均提供书面知情同意。乳腺癌组织是在手术期间从未接受任何化疗或其他治疗的患者中收集的。同时采集患者外周血标本。

用Lymphoprepp分离PBMCTM(西格玛-奥尔德里奇)根据制造商的指示解决方案。将新鲜乳腺肿瘤标本切成小块，在含2%胎牛血清的RPMI-1640培养基(Invitrogen)中，用5 ml注射器在70μm细胞滤器(BD)上轻轻研磨，直至获得均匀的细胞悬液。这些细胞随后通过细胞过滤器，400×离心。g10分钟。细胞颗粒再悬浮于6ml的RPMI-1640培养基中，加入2%的FBS。接下来的步骤与外周血样本的准备步骤相同。

病人诊断

本文对河南省新乡中心医院的乳腺癌患者进行了病史和乳腺X线检查。然后，收集手术患者的组织进行组织学和免疫组织化学分析，检测HER 2、ER、PR和Ki 67。鱼类分析是为了确认HER 2当IHC结果为2+(++)时的状态。IHC和FISH结果将乳腺癌亚型定义为tnbc(Her 2)。−，ER−、PR−)，HER2BC(HER 2)+，ER−、PR−)，LABC(HER 2)−，ER+，和/或公共关系+、Ki 67低层)和B型腔乳癌(LBBC)(HER 2)+/−，ER+和/或公共关系+、Ki 67高).

排除样本排除标准如下：(1)排除术前接受化疗的患者；(2)剔除少量B细胞标本；(3)排除单细胞RNA-seq文库构建过程中质量控制不合格的样本。更多有关病人的资料载於补充表格内。1.

组织学分析

在新乡市中心医院中心实验室对肿瘤标本进行组织学和免疫组织化学分析。图像由奥林巴斯VS 120采集。根据国际TIL工作组的指导方针，将肿瘤间质中的TIL评定为占占基质面积的百分比。37.

免疫荧光染色

用TSA系统扩增CD3/CD 20/CD 21和CD3/CD 20/Ki-67三重染色。辣根过氧化物酶结合聚合物孵育后用TSA试剂孵育，在97℃下进行抗体剥离10 min。该方案被重复用于第二和第三初级抗体和相应的聚合物孵育。TSA的稀释度为：CY3-TSA为1：300，FITC-TSA为1：500，CY5-TSA为1：500。所有荧光染色用2μg/ml的DAPI溶液染色10 min。用PannoramicScaner(PannoramicP 250；3D HISTECH)扫描幻灯片。

FACS分析与排序

淋巴细胞TM(Sigma-Aldrich)液在FACS分选缓冲液(添加2%FBS的磷酸盐缓冲液)中重新悬浮，用所指示的FACS抗体染色。DAPI阴性细胞和hCD 45阳性细胞用BD FACSAriaⅡ分类，用Flowjo(Version 10)进行分析。

单细胞RNA-seq与TCR/bcr文库的构建

FACS-分类可行的hCD 45+细胞在5×10时再悬浮5-1×106细胞/ml，最终存活率>85%。用3‘文库V2或5’V(D)J和基因表达平台进行单细胞文库的制备。细胞悬液被加载到铬单细胞芯片上，以及反转录母细胞混合物和单细胞凝胶珠，目标是每个通道有2000-10000个细胞。在产生单细胞凝胶珠乳状液(GEMS)后，进行逆转录和扩增.然后，对扩增出来的cDNA进行纯化和剪切。每个样本都有一个独特的样本索引，从而生成测序库。利用Illumina HiSeq×10或NovaSeq对文库进行测序。

单细胞RNA-seq数据的质量控制与过滤

10×CellRanger软件包(版本2.1.1，10×基因组)用于破译细胞条形码，映射读取hg 38参考组件(v1.2.0，10×基因组)，并生成一个特征条形码矩阵(与特征(ROW)和条形码(列)相关联的唯一分子标识符(UMIS)数量)。对20个单细胞rna-seq文库进行了测序，平均为74,161(40,341-191,921)个细胞，测序饱和度为88.3%(80.2~94.7%)(补充表)。2)。为了去除多个捕获，这是基于微液滴的实验中的一个主要问题，我们排除了顶部。X用DoubletFinder计算出Pann得分最高的单元格(1.0.0版)39分别用于每个库，其中X被推断为公式(1)：X=(0.000879*)N+0.702)*N用补充图10×平台数据进行线性拟合。1A36，在哪里N表示单元格游标符检测到的单元格号。发现基因数<200或>5000的细胞和线粒体基因UMI计数>50%的细胞也被省略。最后，从20个文库中保留112,938个细胞进行下游分析，其中4811个中位UMIS和1600个中间基因。

典型相关分析、降维和聚类

经过质量控制和过滤，每个库的特征条形码矩阵由seurat处理(版本2.3.4)。40用于规范化、降维、批量效应去除、基于图形的聚类、特定于聚类的标记基因检测和可视化。每个单元格的库大小规范化是由NormalizeData执行的。用ScaleData回归出UMIS数量的变异性。用FindVariableGenes计算可变基因。然后，用RunMultiCCA对角化CCA将所有20个文库组合在一起。相关分量(CC)计算所用的基因是每个文库前2000多个离散基因的组合(至少在两个样本中出现了3175个基因)。利用10个CC维数将细胞与Alignsubspace对齐。通过对DimHeatmap结果的检测，确定CC数。用CalcVarExpRatio计算每个细胞10 CCS解释的方差百分比，有95.68%的细胞能解释50%或更多的变异。使用10对齐CCS进行聚类，分辨率为0.1(共四个组)。一组规范标记(CD3D, CD 20, CD 14，和NKG 7)在不同的簇中呈高水平表达(附图)。2A)。利用RunTSNE(10对齐CCS)和ggplot2-R软件包对聚类结果进行t分布随机邻居嵌入(t-SNE)降维。

BCR和TCR数据质量控制与分析

BCR和TCR文库的原始序列读取由细胞Ranger VDJ管道(版本2.1.1，10×基因组)处理，默认参数用于组装代表每个细胞转录序列最佳估计值的Contigs。连体IgH, IGK，和IGL都是从BCR图书馆收集的。在这里，我们只使用了IgH不考虑IGK或IGL在进一步分析中纳入更多的B细胞80。细胞IgHContigs被定义为bcr阳性细胞.

对B细胞IMGT/HighV-Quest(V1.5.7.1)的注释结果用Chang-O(V0.3.12)进行处理。41和自定义脚本来选择具有单个生产性的单元格。IgH。生产性IgHS是使用ParseDb.py参数-f Function-UT选择的，如果有多个生产性的。IgH在一个细胞里检测到，最丰富的IgH当最丰富的UMI计数时，序列被保留。IgH序列是第二位最丰富的10倍以上。IgH顺序。最后，有22,436个(86%)B细胞具有单一的生产力IgH和3736(14%)B细胞多产IgH具有多种生产力的B细胞IgH在进一步分析之前，移除了S，因为它们的UMIS比单一的生产性要多得多。IgHB细胞，表明它们是B细胞双链(补充图)。3A，b)。我们只获得了11,732个细胞。IgH以及8632个同时具有转录体和转录体的细胞IgHTNBC2-6和PBMC2-6样品的序列数据(补充表)3和补充数据1)。用IMGT/HighV-Quest对组装的Contigs(滤光_contig.Quicka文件)进行了处理。42使用人类的默认设置将V(D)J生殖线段分配给每个连续体IgH等位基因。克隆相关B细胞被定义为具有相同生殖细胞序列的B细胞，这意味着同一克隆内的B细胞具有相同的V、D、J用法和相同的连接长度。IgH序列。仅用V区和J区(不包括D区和结)计算SHM数和频率。利用PhylipVersion3.69推断谱系树81.

在TCR库中，两个单元格都具有特拉和TRBContigs被定义为TCR阳性细胞.BCR和TCR双阳性细胞(1195个细胞，4.5%BCR阳性细胞或2.7%TCR阳性细胞)。在B细胞亚群分析前，他们被移除，因为他们比bcr单阳性细胞、tcr单阳性细胞和bcr/tcr双阴性细胞有更多的UMIS，这表明它们是双链细胞(补充图)。3A，c)。滤过后有26,172个bcr阳性、TCR阴性的B细胞.

公共B细胞克隆分析

公共B细胞克隆被定义为不同群体共享的克隆型。我们从Briney等人那里下载了数据集。(Https://github.com/briney/grp_paper)，其中包括来自10个血液样本的1亿多个克隆型，B细胞克隆型被定义为使用相同的V和J基因并编码相同的CDRH 3氨基酸序列的序列集合。45。公共克隆的百分比被定义为当前研究与Briney等人的数据集之间共享的唯一克隆类型的总数。除以目前研究中独特的克隆类型的数量。利用R中的chisq.test函数对公共克隆数和非公共克隆数进行卡方检验。

TNBC2-6患者B细胞聚类分析

经过对单细胞rna-seq数据的质量控制和过滤，B细胞具有单一的生产力。IgH在BCR文库和TCR文库中，选择TCR文库中的阴性进行B细胞亚群分析(TNBC2-TNBC6患者8632个细胞)。对于每个库中的B单元，由NormalizeData对每个单元进行库大小规范化。用ScaleData回归出UMIS数量的变异性。用FindVariableGenes计算可变基因。所有文库中的B细胞用RunMultiCCA组合，Alignsubspace采用10个CC维数。Find集群被用于使用10对齐CCS进行细胞聚类，分辨率为0.1，用于低分辨率分组(如图所示)。3)的分辨率为1.0，用于高分辨率分组(如图所示)。4)。通过对DimHeatmap结果的检测，确定CC数。用CalcVarExpRatio计算每个细胞10 CCS表达的方差百分比，有94.24%的细胞能解释50%以上的变异。使用RunTSNE(10对齐CCS)和ggplot2R软件包对聚类结果进行t-SNE降维。规范标记(CD 19, CD 20, CD 27, CD 38, IGHD, IGHM，和CD 14)在不同的簇中呈高水平表达(附图)。6A)。除min.pct设为0.25外，用FindAllMarkers函数检测每个簇的标记基因。这些基因按其折叠变化(从最大到最小)排列，每个簇的前10个标记基因显示在补充图中的热图中。8。本文描述了TNBC2-6患者的T细胞聚类分析。补充结果，补充数据6,和补充表9.

我们定义了每个细胞群的特征基因，以进行生存分析。24。从TNBC肿瘤样本中提取的细胞被用来鉴定体面组织所定义的特征基因(版本1.0.0)。82使用不带尖峰的默认参数。标记基因的截止值为折叠变化>2和错误发现率(Fdr)(benamini-hochberg调整后)。p值)<0.01。由于每组细胞来自不同的样本，我们通过在组合数据的模型中包含一个虚拟批处理变量来修正可能的批处理效应。

各聚类的相关基因表达热图和特征评分

的平均表达式级别。AICDA和MKI 67，每组的平均增殖分数(补充图)。10E)，az-每个细胞的标准化表达值的评分。然后，我们计算出同一簇中单个细胞的平均z分数，并在热图中绘制它们。

在附图中绘制热量图。21A和补充图。22b，计算平均表达水平。IG基因,IgH基因,IGK基因,IGL基因(附图)21A京都基因和基因组百科全书(KEGG)抗原处理和呈递基因集中的基因，以及标志干扰素-α应答基因集中的基因(补充图)。22b)每个B细胞。然后，z-每个细胞的评分。平均z-TNBC或PBMC中同一组中单个细胞的分数显示在热图中。

基因集富集分析

用GSEA(Version 4.0.3)对分子标记数据库(MSigDB)中的特征基因集、C1位点基因集、C2序列、C3基序集、C4计算基因集、C5 Go基因集、C6癌基因集和C7免疫基因集进行了分析。从C2基因序列中筛选出KEGG基因集，用于谷胱甘肽过氧化物酶(GSEA)。完整的结果包括在补充数据中7.

LABC和HER2BC B细胞注释

使用Scmap(1.4.1版)映射每个LABC和HER2BC B细胞，根据表达式分析相似性对TNBC B细胞集群进行注释83。每个TNBC患者的B细胞特征-条形码矩阵，参考数据，是标准化的图书馆大小和日志2由SingleCellExperiment包转换。然后，将参考数据中与B细胞簇潜在生物学差异最相关的特征基因定义为基于选择特征的log(表达式)和log(退出)分布的线性模型的前2000位残差。使用带有默认参数的索引聚类，计算参考数据中每个B细胞簇2000所选基因的质心。最后，使用默认参数，将LABC和HER2BC中的每个B细胞表达数据集映射到引用库。

吴等人的TIL-B单细胞RNA-seq数据分析。53

所处理的单细胞RNA-seq数据和包含细胞类型信息的元数据从基因表达总括(GEO)数据库下载，登录号为GSE 139555(File GSE 139555_RAW.tar和GSE 139555_CD 45_nont_metadata.txt.gz)。两份结肠癌标本的TIL-B细胞数分别为648和904；两份肺癌标本的TIL-B细胞数分别为1421和359；三份肾癌标本的TIL-B细胞数分别为55、172和1832。Scmap(1.4.1版)用于根据表达式分析相似性将这些B细胞映射到带注释的TNBC B细胞集群83，用于LABC和HER2BC B细胞的细胞类型注释。未分配细胞百分比分别为0.6%和3.7%，分别定位于4个B细胞亚群和13个B细胞亚群。

在对象聚类分析中，首先计算B细胞亚群在每个样本中所占的百分比，然后通过去除均值和除以标准差的方法在被试之间进行比例划分。在计算百分比之前，排除上述scmap分析中未分配的B细胞。利用相关相似和完全连锁进行聚类。

生存分析

从tcga数据门户下载rna-seq基因表达谱(第3级)和所有肿瘤类型的临床数据(Https://gdc-portal.nci.nih.gov/)。METABRIC基因表达谱和临床数据从cBioPortal网站下载(Http://www.cbioportal.org/study?id=brca_metabric#summary)。Ihc结果将tnbc样本定义为her 2。−，ER−，以及公关−，去除PAM 50正常亚型的样品(n=279)。HER2BC、LABC和LBBC亚型均来自PAM 50分子亚型。TNBC样本按基因或基因集的表达水平进行分类，前33%(n=92%与最低的33%(n用92)的样本生成存活曲线。多变量分析根据淋巴结状况、肿瘤大小、诊断年龄和组织学分级进行调整。在Cox回归模型中，采用相同的样本进行HR计算，以基因/签名作为分类变量，分别以顶部0.33和底部0.33为基础。对于生存分析和HR计算，R包生存(2.42-6版)84被利用了。

配对bcr和单细胞rna-seq数据分析

为了追踪不同B细胞簇的增殖和分化，我们计算了相同的数目。IgH种系事件和相同的IgH每个B细胞集群内部和之间的序列事件。当两个细胞在同一克隆B细胞树中时，相同的生殖线事件被计数，而在同一克隆B细胞树中相同。IgH当两个细胞有相同的观测值时，序列事件被计数。IgH序列。相同的种系事件和相同的IgH序列事件可分为PBMC(两个细胞均来自PBMC样本)、TNBCs(两个细胞均来自TNBC样本)或PBMCs/TNBCs(其中一个细胞来自TNBC样本，另一个细胞来自PBMC样本)。若要比较同一种系事件和同一种系事件的级别，请执行以下操作IgH不同B细胞簇之间的序列事件，它们按照公式(2)进行规范化：(n_{rm归一化}}=\frac{{N}{N_A}}\\frac{N}{N_B}\\x 10,000)在热图上(如图所示)。三维空间、图1.4D). N归一化是图中所示的归一化值。三维空间还有无花果。4D. N是相同的生殖线事件号还是相同的IgH序列事件编号。NA和NB是两个B细胞簇的细胞数，在这两个B细胞群中，同一种系的两个细胞或相同的B细胞IgH序列来自。然后，同一种系或同一种系的热图IgH为PBMCs、TNBCs或PBMCs/TNBCs生成序列。