脂质纳米粒包被核苷修饰的mrna疫苗可获得与非人类灵长类动物蛋白质相当的多功能hiv-1抗体

研制有效的艾滋病疫苗仍然是一项挑战。核苷修饰的脂质纳米粒(mR-lnp)修饰的mRNAs在临床前的研究中被证明是一种有效的传染病免疫方式，目前正在人体内进行SARS-CoV-2的检测。一个关键的问题是mR-LNP疫苗的免疫原性如何与灵长类传统的佐剂蛋白疫苗相比较。在此，我们发现与蛋白质免疫相比，mR-LNP免疫可以引起相同或更好的HIV-1 Env特异性多功能抗体的数量和广度。用编码寨卡病毒前膜和包膜的mRNA-LNP或HIV-1 Env gp 160进行免疫，可诱导至少41周的持久中和抗体。低至5μg的mR-lnp在猕猴体内具有免疫原性.因此，mRNA-LNP可用于快速产生单组分或多组分疫苗，如预防HIV-1感染所需的顺序疫苗。与灵长类重组蛋白疫苗相比，这类疫苗的免疫原性更强。

以信使核糖核酸(Mrna)为基础的疫苗经恒河猴一次免疫后，可获得对寨卡病毒(Zkv)感染的保护性免疫。1，已被设计用于许多其他病原体，包括埃博拉、流感、丙型肝炎、巨细胞病毒和呼吸道合胞病毒。2,3,4,5,6,7.

MRNA疫苗的最新发展克服了使用这些疫苗的最初障碍。Mrna疫苗最初受到mrna天然免疫感知的阻碍。7,8,9。然而，修饰mrna核苷的进展改善了mrna的翻译，同时消除了先天模式识别受体的识别作用。7,8,10。具体来说，假尿苷和1-甲基假尿苷的结合阻止了Toll样受体7和8以及其他核酸传感模式识别受体对mrna的识别。7。通过对mRNA的修饰，结合hplc和fpc的纯化方法和密码子优化方法，提高了mRNA的产生效率和mrna疫苗的接种效果。8,11,12。为了使mRNA在体内有效地传递细胞，必须保护其不受RNase的影响。保护mRNA不被降解的方法之一是将其包裹在脂质纳米颗粒(LNP)中。7,8,13。重要的是，lnp中的小干扰RNA(SiRNAs)已被fda批准用于治疗一种淀粉样变的遗传形式。14。因此，随着基因封装技术和mRNA免疫感知技术的发展，使mRNA疫苗成为一种可行的疫苗平台。

MRNA疫苗作为疫苗平台也很有吸引力，因为它们可以接受各种病原体抗原的基因，并且可以迅速大规模生产。这两个方面使mrna疫苗成为应对sars-cov-2疫情的首选疫苗。15,16。在人体试验中，我们观察到sars-cov-2中和抗体的水平高于新冠肺炎患者恢复期血清的几何平均值，包括核苷修饰的mrna-lnp和基质-m1辅助性亚基蛋白。16,17,18。考虑到mRNA疫苗产生中和抗体的能力8,16,17该平台可提高抗HIV-1抗体的中和性。然而，关于非人类灵长类动物的mR-LNP和蛋白质的相对免疫原性的研究还不多见.因此，HIV-1疫苗研制的一个关键问题是，编码HIV-1免疫原的mRNA疫苗的免疫原性是否可与体外生产后可纯化的蛋白质相媲美。HIV-1免疫原蛋白是一种免疫原性差的蛋白质，需要进行广泛的翻译后修饰。

旨在激发保护性抗体反应的hiv-1疫苗可能需要诱导多功能非中和效应抗体(NnAb)和/或广泛中和抗体(Bnbs)。19,20。NnAb易于诱导和结合到病毒感染的CD4+T细胞表面，从而介导抗体依赖的细胞细胞毒性(ADCC)。然而，由于HVTN 702 ALVAC-C、gp 120-C试验未能显示出疗效，它们在高传染率环境下预防或控制艾滋病的效果受到质疑。21,22。迄今为止，唯一一项证明rv 144有效的hIV-1临床试验，是通过免疫从hiv-1分离株a 244和mn中提取的gp 120蛋白诱导nnAb的。23。该试验中的保护作用与将IgG与Env和ADCC上的第二个可变区结合在一起，但保护性抗体的应答并不持久。24.

与nnAb相比，bNAb很难诱导，其原因包括糖聚糖对bNab抗原表位的屏蔽、Env构象的亚稳态、中和表位的构象掩蔽等。25,26,27，防止bNab发展的宿主免疫控制。28,29，以及获得抗体中和宽度所需的多重极不可能的体细胞突变的要求。30,31,32。Mrna免疫可诱导抗原特异性的滤泡T辅助细胞，这些细胞是生发中心抗体亲和力成熟的关键。33,34，并已被证明与bNab在自然感染期间的发育有关。35,36。无论是nnAb还是bnbs的靶标，hiv-1 env抗体应答的耐用性较差。37，以及设计一种具有多种成分的bNab诱导疫苗的必要性。19,20需要额外的疫苗平台，以保持保护性抗体水平。

在此，我们比较了以核苷修饰的mR-LNP编码的HIV-1 Env或作为佐剂的HIV-1 Env重组蛋白的同一候选疫苗对恒河猴的抗体反应。在每一项比较中，mRNA-LNP作为蛋白质诱导的免疫应答与蛋白质相同或更好.此外，编码可溶性HIV-1Env三聚体或ZIKVPRM-E的mRNA-LNP疫苗可诱导稳定1年的持久中和抗体。

蛋白和mrna疫苗均能产生高滴度的血清hiv-1结合抗体。

我们比较了缺少gp 120前11个N端氨基酸的hiv-1 env a 244 gp 120的免疫原性(Δ11 gp 120，如RV 144试验中的那样)。38用核苷修饰的mRNA-LNP或辅助性重组蛋白在恒河猴体内进行处理。我们用不同佐剂配制的重组蛋白免疫了两组5只猕猴。一组五只猕猴接受了A 244Δ11 gp 120与氢氧化铝佐剂重组凝胶的配方(图)。1A)。该组仿照RV 144 ALVAC/B/Egp 120试验中使用的A 244Δ11 gp 120蛋白氢氧化铝(RV 144 ALVAC/B/Egp 120)配方。23。佐剂的免疫刺激强度不同；因此，在第二组5只猕猴中，我们结合由单磷脂A(TLR-4激动剂)和QS 21(ALFQ)组成的脂质体佐剂，评估了A 244Δ11 gp 120 Env的免疫原性。39。此外，两组猕猴用不同形式的A 244Δ11 gp 120核苷修饰mR-lnp免疫。一组猕猴接受A 244Δ11 gp 120，另一组接受编码A 244Δ11 gp 120的mRNAs，D368R突变破坏CD4结合位点(图1)。1A)。CD4结合位点基因敲除突变的目的是确定env是否与CD4结合。+体内T细胞改变了HIV-1 Env gp 120的免疫原性。在0周和6周用蛋白或mRNA-LNP免疫猕猴，并随访18周的抗体反应(见图)。1A).

与环境免疫原结合的nnAb与猕猴抗志贺病毒感染的保护作用密切相关。40,41。因此，我们首先测定了每个mRNA/LNP或蛋白质组诱导的血清结合IgG。无论免疫部位如何，单次免疫后可检测到猕猴血清中gp 120特异性IgG滴度，并在第二次免疫后继续升高(图二)。1B)。与A 244Δ11 gp 120免疫猕猴相比，mR-LNP诱导的血清IgG抗体效价基本一致(图1)。1B)。编码野生型gp 120的mR-LNP与CD4变异的gp 120的比较显示了相同的结合IgG激发(图1)。1B)。接受A 244Δ11 gp 120配伍的猕猴产生的A 244Δ11 gp 120与A 244Δ11 gp 120的平均血清IgG结合滴度最低。对这些ELISA检测，一次免疫后，羊水凝胶组与其他组间差异最大，但每组猴数较少，无法进行统计分析。尽管如此，ALFQ佐剂诱导的A 244Δ11 gp 120抗体水平高于重水凝胶中的gp 120(如图所示)。1B)。从一株非疫苗匹配的HIV-1分离物中，还观察到了与HIV-1 Env gp 120 B.63521结合IgG的同一组排序(图1)。1B)。血清抗体与A 244 gp 120的结合并不是通过引入CD4结合位点、甘氨酸-V3位点和糖基-V2位点的突变来降低的(如图所示)。1B)。因此，mR-LNP gp 120疫苗在强效佐剂ALFQ中作为重组gp 120蛋白在血浆中产生了相当的IgG效价。

在RV 144试验中，对HIV-1 Env第二变量(V2)区的IgG反应与降低感染风险相关。24。同样，在RV 144试验期间，V2区的K169也是一个免疫压力的部位。42。为了评估核苷修饰的mR-LNP疫苗是否在血浆中产生类似的V2区IgG抗体，我们检测了血清IgG与各种重组HIV-1 Env V2区的最小抗原的结合情况。这些抗原包括V1V2蛋白、V2肽和gp 70上的V2支架。与每种抗原的结合与gp 120的结合模式相同。重组蛋白经AFLQ和mRNA-LNP免疫后，可产生几乎相同的血浆IgG反应。2)。重组gp 120对所有被测抗原的应答最弱，单次免疫后组间差异最大(图1)。2)。V1V2特异性结合IgG效价是相当的，无论是V1V2抗原与疫苗株相匹配，还是来自非匹配病毒1086C(图一)。2A)。第一可变区(V1)不需要与V2结合，因为血浆IgG与V2短肽K178结合(如图所示)。2B)。在RV 144试验中，结合IgG与降低感染风险相关的抗原是B.CaseA V1V2支架，构建在gp 70上。24,43。每组猕猴产生与gp 70 B.CaseA V1V2蛋白结合的IgG抗体。2C)。这些抗体是针对HIV-1 V1V2的特异性抗体，因为没有检测到针对对照gp 70支架提出的小鼠白血病病毒V1V2的抗体(如图1所示)。2C)。K169突变对B.CaseA V1V2结合IgG效价影响不大。同样，A 244 gp 120 V2区K169突变对结合IgG效价的影响不大(图1)。1B)。因此，V1V2抗体并不完全依赖于RV 144试验中观察到的免疫压力部位的K 169。

为了确定每种疫苗诱导的第一和第二可变区抗体(V1V2)的反应性宽度和表位特异性，我们进行了线性V1V2肽阵列。疫苗只导致低水平的V1-结合抗体，但高滴度的V2抗体跨不同的疫苗(图一)。3A-d和补充图。1)。V2抗体结合量与ALFQ形成的mRNA-LNP和蛋白相似。3)。每个疫苗诱导的抗体能够结合V2肽从CLADE和C(图1)。3和补充图。1)。因此，mRNA-LNP和辅助性蛋白疫苗产生的V2抗体反应在大小、宽度和表位特异性上都是相似的。

接下来，我们在V1V2位点外的HIV-1 Env gp 120位点比较了蛋白质或mRNA-LNP免疫诱导的血浆抗体特异性。与佐剂形成的蛋白相比，mRNA-LNP诱导的A 244 gp 120线性表位抗体有两种例外。第一，重组蛋白，而不是mRNA-LNP，激发血浆IgG到第二常量区(C2)的C末端(如图所示)。3e-h和补充图。2)。第二，mRNA-LNP免疫可诱导抗第三恒定区的血浆IgG，而重组蛋白免疫则不能。3e-h和补充图。2).

为了进一步比较多克隆血浆IgG的特异性，我们评估了免疫后血浆阻断gp 120单克隆抗体(MAb)与HIV-1 Env结合的能力。从辅助性蛋白或mRNA-LNP免疫猕猴血浆中加入HIV-1 Env蛋白，然后加入生物素化mAb，以确定血浆抗体阻断与Env结合的单克隆抗体。我们检查了nnabs CH 58的阻断，它的目标是rv 144中识别的免疫压力的v2位点。44，以及A32，它定义了一个免疫显性的ADCC gp 120位点。45与V2抗体协同介导ADCC46(无花果)4A)。接下来，我们确定血浆是否能阻断HIV-1受体CD4与Env的结合(如图所示)。4B)，或阻断V2-甘氨酸bNABS PG9和CH 01和N 332糖基依赖性bNAbs 2G12和PGT 125 Env结合(图1)。4C，d)。免疫佐剂重组gp 120蛋白或mRNA-LNP可诱导血浆抗体阻断CH 58、A32、CD4、CH 01、2G12和PGT 125的结合。4)。MR-LNP诱导的抗体与gp 120蛋白诱导的血浆抗体的比较表明，mR-LNP免疫在两次免疫后引起的阻断程度与ALFQ辅助的蛋白相同(见图)。4)。用瑞氏凝胶辅助蛋白免疫的动物阻断活性最低(图1)。4)。CH01与A 244结合的阻断最有可能是CH 58样抗体的结合，而不是V2-糖基bNab结合，因为CH 01的结合可被CH 58样线性V2抗体所阻断(如图1所示)。4).

佐剂Env gp 120蛋白与mR-lnp免疫诱导的中和和非中和抗体功能的比较

在RV 144试验中或在猕猴的Env免疫研究中，有几种IgG FC受体(R)介导的免疫反应与降低传播风险有关，随后出现了小剂量的粘膜Shiv挑战。41,47。这些免疫反应包括与hiv-1感染的CD4结合。+T细胞、ADCC和抗体依赖性细胞吞噬功能(ADCP).为了评估第8周血浆IgG对感染细胞介导效应功能的可能性，我们首先检测了血浆IgG与HIV-1.CM 235感染T细胞的结合情况。四组猕猴的血浆IgG均能与HIV感染的细胞结合(如图所示)。5A，b)。当IgG结合水平被量化为结合IgG的平均荧光强度或HIV-1蛋白p24阳性细胞百分比和血浆IgG阳性率时，mRNA-LNP疫苗接种和ALFQ辅助重组蛋白无差异(见图)。5A，b)。与整体较低的IgG滴度一致，重组蛋白的细胞结合反应最弱。5A，b).

流式细胞仪检测ADCC活性。两种蛋白免疫组间有明显的佐剂作用。用ALFQ作为佐剂时，ADCC效价比重水凝胶高约1个数量级。同样，mRNA-LNP免疫诱导活性(平均±标准差=22,916±22,102)低于ALFQ表达的重组蛋白，但比重组蛋白高出3倍(平均±标准差=7324±7024)。5C)。消除与A 244Δ11 gp 120结合的CD4对ADCC活性无影响(图5)。5C)。最后，我们比较了添加辅助性重组蛋白或mRNA-LNP后第8周猕猴血浆抗体的ADCP活性。血浆ADCP对A 244 gp 120包被珠的活性中位数在所有组间相似，A 244Δ11 gp 120在羊水凝胶中可引起更广泛的反应(图1)。5D)。与以前的研究一致，核苷修饰的mrna-lnp疫苗可以激发抗体效应器功能，这已经被证明与降低感染风险有关。24,48.

A 244Δ11 gp 120免疫的目的是诱导非中和效应功能，如RV 144试验所见，我们比较了每种疫苗对中和抗体的诱导作用。我们选择了1级HIV-1株CRF_01AE 92TH023进行检测，A 244一直对其产生中和抗体。24,44。我们发现不同的疫苗接种方案对HIV-1 92 TH023中和抗体的诱导无显着性差异(附图)。3)。这些研究表明，核苷修饰的mRNA-LNP疫苗免疫gp 120单体以获得潜在的保护性非中和性V2抗体优于用氢氧化铝配制的重组蛋白，与用更复杂的TLR-4/QS 21/脂质体佐剂配制的重组蛋白相当。

序贯Ch505 Env gp 160 mRNA-LNP、SOSIP gp 140 mRNA-LNP或佐剂重组SOSIP gp 140蛋白免疫猕猴

我们以前从非洲个体Ch505中分离到cd4结合位点bnbs。49,50。从Ch505中，我们克隆了一系列不同的ch505 env作为免疫原来诱导类似类型的bnbs进行免疫接种。49,50。为此，我们研究了一种mRNA-LNP顺序免疫策略，该策略中的每一个单独的信封是一个特定的顺序一次交付。将HIV-1包膜免疫原设计为跨膜HIV-1 gp 160(50μg/免疫)或可溶性、稳定的gp 140 SOSIP三聚体(50μg/免疫)。6A)。通过一个嵌合gp 41和E64K和A316W突变的加入，使SOSIP gp 140稳定下来。51。用TLR-4佐剂GLA-SE配制的可溶性gp 140 SOSIP蛋白，将这两组mR-LNP的免疫原性与1 0 0 0μg的免疫原性进行比较。6A)。四只恒河猴每四周接种一组免疫原(见图)。6A)，检测结合抗体和中和抗体。

3种疫苗在猕猴体内均具有免疫原性。在诱导gp 120抗体结合效价方面，编码序列Ch505 gp 160的mRNA-LNP诱导的gp 120效价高于编码可溶性gp 140 SOSIP三聚体或可溶性gp 140 SOSIP三聚体的mRNA-LNP。6B)。在用gp 160 mRNA-LNP免疫两次后，这些结合滴度显著升高，但在5次免疫过程中，SOSIP gp 140免疫猕猴的效价逐渐升高(图1)。6B)。血浆IgG与gp 120的结合效价与辅助性可溶性gp 140 SOSIP三聚体蛋白免疫动物相当。6B)。可溶性gp 120暴露了非中和表位，因此我们研究了gp 160 mRNA-LNP免疫猕猴中gp 120抗体的高效价是否是由于针对这些位点的抗体所致。事实上，gp 160 mRNA-LNP诱导了对线性Ch505 V2肽的抗体滴度很高，而gp 140 SOSIP三聚体组的滴度没有或略高于基线(图1)。6C)。线性V3表位在gp 160 mRNA-LNP免疫猕猴中也具有较高的免疫原性，而在可溶性gp 140 SOSIP三聚体蛋白免疫猕猴中的免疫原性较小。6d)。有趣的是，gp 140 SOSIP三聚体mRNA-LNP不能产生V3抗体，提示V3在体内表达时与佐剂的潜在作用存在差异。为了检测gp 120抗体对保守中和表位的诱导作用，我们评估了依赖CD4结合位点的gp 120抗体结合量。我们突变了CD4结合位点，在371位缺失异亮氨酸，并测定了与Ch505 TF gp 120结合的血浆IgG的减少。两组接受SOSIP三聚体蛋白gp 140或mRNA-LNP的猕猴均优于编码gp 160的mR-LNP。6E)。用gp 140 SOSIP三聚体免疫诱导突变型gp 120和野生型gp 120之间的差异结合，在每次免疫后迅速消退，但免疫停止后维持16周。6E)。与线性V2和V3肽抗体相似，gp 160 mRNA-LNP可诱导较高水平的gp 41抗体，而gp 140 SOSIP三聚体作为mRNA-LNP或辅助性重组蛋白，其水平接近基线水平。6f)。因此，gp 160 mRNA-LNP免疫产生的非中和gp 120和gp 41表位抗体的效价高于SOSIP三聚体编码的gp 120和gp 41抗原表位，而预期CD4结合位点抗体的效价低于SOSIP三聚体编码mRNA-lnp或佐剂重组蛋白。然而，由于需要高亲和力的B细胞靶点和选择bNab不可能突变的序贯Env方案的设计，没有一种方案能诱导出明显的二级或异源中和抗体(补充表)。1–3)20,31,32,52,53.

Gp 160 mRNA-LNP免疫诱导的抗体水平较高，可能是由于细胞表面表达的HIV-1包膜不佳所致。我们假设，保持Env三聚体天然构象的氨基酸替换使HIV-1包膜稳定，可以减少HIV-1包膜与非中和抗体的结合。我们在包膜中引入了稳定氨基酸H66A和A582T。54。此外，我们在113和429或113和431位置制作了带有G458Y和半胱氨酸的信封。55。半胱氨酸已被证明形成二硫键，使hiv-1包膜保持闭合构象。55G458Y使包络第五变量回路稳定。53。在M5 gp 160包膜的变体中，加入H66A和A582T可减少抗V3和gp 41的非中和抗体的结合，而使三聚体特异性(PGT 145)或定时器优先(PG9和CH 01)抗体结合保持不变(图1)。6g)。因此，稳定的HIV-1包膜gp 160的mRNA免疫是一种可能的方法，可以改善中和抗体的激发，同时不与产生不能结合天然的、融合的HIV-1包膜的B细胞受体发生作用。

核苷修饰的mrna-lnp免疫诱导抗寨卡病毒PRM-E和hiv-1 env的持久抗体应答

诱导持久的环境病毒抗体应答是HIV疫苗研制的一个关键目标。然而在RV 144试验中，保护性抗体在接种后的前42周急剧下降。24。因此，如果用mRNA-LNP免疫产生持久的抗体反应，将有利于它们作为多种传染病的疫苗平台。我们使用第1级Ch505 w4.3病毒的中和试验评估抗体反应的持久性，因为没有产生能够中和第2级Ch505传播的方正病毒(TF)病毒的抗体(补充表)。1–3)。Ch505 w4.3是一种早期的病毒分离物，与2级ChTF病毒相同，但W680G突变使其对HIV抗体中和高度敏感。49,56,57。对Ch505 w4.3病毒中和的纵向比较分析表明，gp 160编码mrna-lnp的中和抗体效价高于gp 140 SOSIP三聚体编码mrna-lnp或gp 140 soSIP三聚体蛋白在gla/se中的效价。58(无花果)7A)。值得注意的是，Ch505 w4.3病毒在最后一次免疫后12周仍可检测到。7A)。此外，Ch505或426 C病毒的中和水平也较低，这些病毒经修改后对CD4结合位点抗体高度敏感(补充表)1–3).

虽然这些结果表明，每种疫苗方案都能产生持久的中和抗体，但这些猕猴和A 244免疫猕猴的中和效价呈下降趋势，这就提出了中和抗体在可检测水平上能持续多久的问题。在这项研究中使用的猕猴的一个子集以前是50μg的mR-lnp编码ZIKV前膜和包膜(PRM-E)。这些猕猴产生保护性的抗寨卡中和抗体反应。1。使用这些同时注射HIV和ZikamRNA-LNP疫苗的猕猴，我们在52周内测定了血清中和抗体滴度。7b)。我们发现抗ZIKV的中和抗体一直维持到免疫后52周随访的最后时间点。对HIV-1的中和抗体持续了41周的随访期.在这41周内，HIV-1滴度在最后一次免疫后最初下降了10倍，但在1：100滴度稳定下来(图1)。7b)。相比之下，寨卡病毒中和抗体水平在第2周被检测后的52周内保持在同一水平(如图所示)。7b)。血浆IgG滴度与Ch505 gp 120和Zika PRM-E的结合模式相似。7C)。核苷修饰的mR-LNP免疫诱导了抗HIV-1和ZIKV的持久血清中和抗体.

中和抗体滴度与mrna-lnp剂量有关。

在我们之前对非人类灵长类动物进行的zIKV疫苗研究中，我们使用了50,200或600μg的mrna-lnp。1。考虑到每个剂量的mRNA都能有效地激发中和抗体，我们试图确定mRNA的剂量是否可以进一步降低。我们用编码寨卡病毒PRM-E的mR-lnp基因50、20或5μg免疫了4只猕猴。8A)并比较了IgG与中和抗体的结合效价。50微克剂量的mRNA-LNP可诱导出相似的IgG结合效价和中和抗体滴度(图1)。8B，c)。当mR-lnp剂量降至5μg时，ZIKV结合IgG和中和抗体的滴度显著降低，但在猕猴中只注射少量的mR-LNP即可检测到。注射50μg的mR-lnp，无论是肌肉内还是皮内注射，均能获得与之相当的寨卡包膜结合IgG和寨卡中和抗体，免疫途径并不关键。8B，c)。总之，猕猴的mR-lnp剂量可以从50μ降低到20 g，而不会对抗体反应产生不利影响。因此，通过减少60%的剂量，每一次制备mR-LNP都可以进行更多的免疫接种。

在此，我们在28只恒河猴身上证明了核苷修饰的mrna-lnp免疫。n=16)等于或优于辅助性Env蛋白的免疫原性。核苷修饰的mRNA免疫对病毒蛋白具有很强的免疫原性，其原因是多方面的。首先，mrna由lnp传递到树突状细胞和其他可能的免疫细胞，这些细胞能够激活幼稚T细胞对疫苗免疫原作出反应。59,60,61。第二，核苷修饰的mrna-lnp免疫产生鲁棒的抗原特异性生发中心T和B细胞反应。2。在生发中心内，滤泡T辅助细胞为进行亲和成熟的B细胞提供帮助34。亲合成熟过程对于疫苗接种后高亲和力抗体的发展至关重要，特别是对hIV-1来说，bNab的发育是必需的。62。用编码hiv-1 env或流感病毒血凝素的核苷修饰mrna-lnp免疫动物模型可产生高水平的T滤泡辅助细胞。33。考虑到HIV-1中和抗体的宽度与循环T滤泡辅助细胞的频率有关35,36核苷修饰的mR-LNP免疫作为HIV-1疫苗平台值得进一步研究.核苷修饰的mRNAs与蛋白质相比具有许多潜在的优势，包括生产速度和成本节约。此外，mRNA-LNP增加了在目前良好的生产实践下生产多组份疫苗的可行性，这是诱导HIV-1 bNAb和nnAb的两种疫苗所必需的。

在RV 144中，使用氢氧化铝(重水凝胶)，观察到保护性免疫反应的耐久性较差。24,63。ALFQ是一种有效的佐剂，含有阴离子脂质体qs 21和tlr-4激动剂mpl。39两种强效佐剂。因此，与RV 144方案相比，mRNA-LNP与瑞海拉凝胶的比较直接显示了它的疗效，而与ALFQ的比较则显示了它与更强的佐剂相比会有多大的效果。稳定乳液中的佐剂GLA(合成MPL)58已在HVTN 115中使用多个gp120s，并且具有免疫原性，虽然在灵长类动物中对重水凝胶和GLA-SE进行了头对头比较，但它们在促进免疫原性方面相似，但在V2反应中，瑞海洛凝胶更优越。ALFQ和GLA稳定乳液中含有脂质，但与LNPs不同。LNPs含有离子化的阳离子脂质，使LNP具有中性的表面电荷，而大多数商业脂质体缺乏离子化的阳离子脂质。中性电荷有助于减少体内非特异性蛋白质结合。与gla或alfq不同，lnp不激活tlr-4，而是激活滤泡辅助T细胞。33。一般而言，在蛋白质与mRNA-LNP的研究中使用的剂量和佐剂，核苷修饰的mRNA-LNP免疫在重组凝胶或GLA-SE中优于或等于蛋白质，在ALFQ中等于蛋白质。使用不同的疫苗接种间隔、佐剂和蛋白质剂量的未来研究可以证实这一结论。

目前有两个正在进行的药效试验，测试非中和HIV-1抗体的保护能力与病毒载体素，Env蛋白增强，以确定是否可以复制42个月的疗效ALVAC/gp 120。此外，刚刚完成的HVTN 702试验(NCT 02968849)使用的ALVAC以CLADE C Env插入为主要，而ALVAC-C+二价C gp 120 Env Boost在南非艾滋病毒-1感染率高的地区未能提供任何预防艾滋病毒-1感染的措施。目前正在进行的HVTN 705试验(NCT 03060629)测试了含有嵌合体HIV-1基因的腺病毒(Ad)26载体的功效，以AD 26+clade C gp 140 Env作为增强剂，HVTN 706试验(NCT 03964415)测试AD 26嵌合HIV病毒作为主要病毒，AD 26+双价clade C gp 140 Env+a镶嵌gp 140 Env作为增强剂的效果。64。A26，ad 26+gp 140 Boost Shiv挑战研究中降低传播风险的相关研究不包括抗体的中和宽度，而是包括clade C env ELISA结合抗体和干扰素-γenv Elispot值。64。因此，后两种疫苗将测试非中和抗体效应器功能是否能在人体内发挥重要的保护作用。

相对于通过良好的制造实践(GMP)技术生产多种重组蛋白而言，mRNA-LNP生产的简便性和成本效益使得mRNA-LNP尤其具有吸引力。此外，mR-LNP在数千到数百万剂量下的可伸缩性再次使mRNA-LNP的成本和生产变得更加容易。这些生产考虑是改进rv 144的关键，并显示出目前正在开发的新冠肺炎疫苗的巨大前景。17。然而，mrna疫苗的分布和储存所需的低温仍然是该疫苗平台的一个挑战。65.

虽然mRNA疫苗是有希望的，但在HIVmRNA-LNP疫苗接种方面仍有改进。具体来说，对于由mRNAs诱导的bNab，需要稳定近天然的Env三聚体，使其能够被转染细胞在良好折叠状态下产生。这一挑战并不是mrna独有的，因为dna疫苗接种也面临着类似的障碍。66。基因疫苗的这一方面不同于在免疫和免疫系统识别之前可以被纯化的重组蛋白。然而，有大量的可以稳定HIV-1包膜的突变，每个包膜都有不同的内在稳定性，可以进一步增强。我们只研究了两个电位集，发现H66A和A587T还原的非中和抗体结合在体外。非中和抗体结合的减少表明由mRNA表达的天然类包膜的百分比更高。未来的疫苗研究将需要确定减少的非中和抗体结合在体外是否转化为改善中和抗体激发在体内。尽管有最好的信封稳定设计，但并不是所有的信封都会折叠得很好，就像土生土长的三聚体一样。在体内，我们和其他人的研究旨在确定折叠良好的包膜的百分比，以获得最佳的中和抗体反应。这两个重要的问题都是深入研究的领域，也是mRNA成为被广泛接受的HIV-1疫苗平台的关键。

总之，三种佐剂中核苷修饰的mRNA-LNP与重组Env蛋白的比较表明，mRNA-LNP作为诱导nnAb的一种方式，有望对逆转录病毒的攻击起到保护作用。我们认为，将核苷修饰的mR-LNP移植到下一代临床试验中进行多价Env免疫，将有利于并加快全球可获得的HIV-1保护性疫苗的研制。