1型嗜睡症患者T细胞对调节因子X4的反应性

1型嗜睡症与人类白细胞抗原(HLA)Ⅱ类DQA 1*01：02/DQB 1*06：02(DQ 0602)密切相关，与T细胞受体(TCR)α位点多态性及其他免疫调节位点高度相关。2009年H1N1大流行后发现嗜睡症发病率增加，并与潘德母线疫苗接种有关，这有力地支持了嗜睡症是一种自身免疫性疾病。虽然最近的研究结果表明CD4+T细胞对神经肽的反应性涉及到神经肽、低肽/食欲素和交叉反应的流感肽，但其他自身抗原的识别仍未确定。在这里，我们研究针对调节因子X4(RFX 4)的自身免疫，这是一种与低肌肽共定位的蛋白，是否参与了一些嗜睡症的发病过程。通过对人血清的研究，我们发现抗RFX 4的自身抗体是罕见的。利用与DQ 0602四聚体结合的RFX 4肽，在4/10例患者和2个未受影响的兄弟姐妹中检测到抗原RFX4-86、-95和-60人CD4+T细胞，而其他患者则未检测到。通过与各同源肽共同培养，采用单细胞分选法分离富集的自身反应性TCRαβ克隆，并对其进行序列测定。在患者和一个孪生对照者中鉴定了带有TRBV 4-2和识别RFX 4-86的同源克隆。这些结果表明RFX 4 CD4+T细胞自身反应性参与了一些发作性发作，但也参与了健康献血者。

1型嗜睡症(T1n)是一种致残性神经功能障碍，影响1/2000人。它的特点是过度白天嗜睡，夜间睡眠紊乱，睡眠麻痹，低能幻觉和突然的双侧失去肌肉张力，触发情绪(昏迷)。1。这种情况是由(>90%)食欲素/次克次丁(HcRT)产生的神经元丢失所致。2,3与人类白细胞抗原(HLA)Ⅱ类单倍型DQA 1*01：02/DQB 1*06：02(DQ 0602)高度相关(98%)。4,5,6,7,8,9,10,11。此外，这种疾病还与T细胞受体(TCR)α多态性和其他免疫应答基因(包括组织蛋白酶H(CTSH)和肿瘤坏死因子超家族成员4(TNFSF 4))密切相关。4,12,13。在2009-2010年甲型H1N1流感大流行和与Pandemrix相关的疫苗接种运动之后，从芬兰、瑞典和挪威等欧洲不同国家的数百名患者中发现了更多的嗜睡症发病率。14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24。另据报道，T1n病例是由其他环境因素引起的，包括链球菌感染，这种感染以前曾与许多自身免疫性疾病有关。15,25,26,27,28,29,30。综合来看，这一数据有力地表明T1n是一种自身免疫性疾病。

尽管做了大量的努力，但到目前为止，在T1n中还没有发现一致的自身抗体。最早发现的最有前途的自身抗原之一是TRIB 2。31，一种最初被认为在HCRT细胞中富集的蛋白质。三项不同的研究，包括我们小组的一项研究表明，TRIB 2自身抗体水平在最近发作的发作性嗜睡症患者中升高。32。然而，后来的努力始终未能证实这一发现。33,34.

同样，在T1n患者和健康对照者中，为筛选抗HCRT、HCRT受体1(HCRTR 1)和HCRTR 2的自身抗体作出了大量的努力。35,36,37。虽然Ahmed等人。20份血清中17份抗HCRTR 2自身抗体检测报告38，其他使用类似协议的人报告说，散发性嗜睡症患者(181人中有5人，61份血清中有3人)和后潘德米克斯嗜睡症患者(40人中0人)的结果相互矛盾。37。结果提示抗链球菌溶血素O(Aso)和抗DNase B(亚行)抗体与近期嗜睡症发病的关系在我国也是不可复制的。25,27,39。值得注意的是，Deloumeau等人。与对照组相比，T1n患者血清中HCRT 1复合物IgG水平较高，两组患者血清总IgG水平无明显差异(P>0.05)。40,41。最近使用的技术包括放射配基结合。35细胞型酶联免疫吸附试验(ELISA)38和基于流式细胞术的分析37,42,43结果均为阴性。虽然目前的普遍共识是T细胞介导的反应很可能是T1n的主要机制，但这种级联是否也会产生体液反应，是否能产生与T1n仍有争议的特异性和可靠的抗体，仍是一个谜。

与抗体介导的免疫研究相比，适应性细胞免疫在嗜睡症的病理生理学中的作用越来越明显。44,45，其结果与HLA和TCR基因座的遗传数据吻合较好。由于HLA I类和II类多倍体和基于荧光激活细胞分类(Fcs)的单细胞分类和测序技术，现在可以更详细地研究自身免疫性疾病中对感染因子和自身抗原的细胞免疫反应。46,47。具体来说，四聚体HLA靶向T细胞有助于在高度多样化的tcr库中识别抗原特异性tcr-群。48,49，它们是由V(D)J重组随机产生的，这是一个在每个T细胞中重新排列生殖系TCR基因座的过程。50,51。使用这项技术，越来越多的证据表明，针对hcrt本身的CD4自身反应性可能确实是人类嗜睡症的一个主要的自身反应过程。46,52。值得注意的是，在一种嗜睡症小鼠模型中，致病的CD4 Th1细胞和细胞毒性CD8 T细胞都很容易渗入下丘脑，后者的细胞类型也会导致这些动物的低克汀病神经元和嗜睡症表型的特异性破坏。53.

在本研究中，我们推测调节因子X4(RFX 4)可能是T1n中另一个重要的CD4+T细胞自身抗原，因为它在HCRT细胞中高度富集。34,54,55。Rfx成员共享一个高度保守的脱氧核糖核酸(Dna)结合结构域。56调节靶基因的表达，包括主要组织相容性复合体Ⅱ类(mhcⅡ)和白细胞介素-5受体α链(IL-5Rα)。57,58,59,60,61,62,63,64。已鉴定出六种RFX 4亚型。65。而RFX 4变异体1(RFX4_V1)、RFX 4_v2和RFX4_v4在睾丸中特异表达。62,66，RFX_4_v5和RFX_4_V6在胶质瘤中均有表达。66。RFX_4_v3在脑中特异表达，在脑形态发生过程中起重要作用，参与脑发育和疾病的许多方面。65,66,67,68,69,70。值得注意的是rfx 4_v3在视交叉上核(Scn)中表达，它是哺乳动物的起搏器，负责产生24小时昼夜节律。71,72,73。它也可以通过主观性夜间特定的方式被光照所诱导，这是其他几个scn生物钟核心基因的一个典型特征。74暗示了在生物钟调节中所起的作用。格拉泽和他的同事(2005)的发现进一步支持了这一假说，他们将RFX 4_v3确定为双极紊乱(Bpd)的潜在危险因素。75，一种常以严重的昼夜不稳定为特征的疾病。76,77,78。有趣的是，根据核糖体亲和纯化(TRAP)的结果，rfx 4高度富集于hcrt神经元，并且对hcrt神经元有显著的特异性。34,54,55。然而，对于RFX 4的调控网络及其对HCRT神经元的作用知之甚少。综上所述，RFX 4在生物钟调节中的意义、其低肌肽神经元的特异性表达以及相关成员对MHCⅡ类基因的影响，使其成为T1n中作为自身抗原的一个有趣的候选基因。另一个令人感兴趣的事实是CD8+诱导的T细胞对这种细胞内抗原的活性在最近的一项关于嗜睡症患者的研究中也被证明了。45.

为了进一步探讨RFC 4的免疫反应性与嗜睡症病理生理和低克汀病细胞丢失有关的假设，我们采用高通量流式细胞仪(FACS)染色方法，对86例T1n患者和88例正常人进行了抗RFX 4 v1/v3/v4自身抗体的研究，并探讨了T细胞对与DQ 0602结合的RFX 4肽的反应性。流式细胞仪检测自身抗体阳性标本，采用细胞免疫染色法和免疫印迹法进行鉴定.在未发现自身抗体的情况下，4例患者及2例同胞对照中发现T细胞结合的DQ0602-RFX4四聚体。相应的RFX 4抗原，DQ 0602限制性特异性CD4+T细胞是TCR序列中的第二个单细胞分类序列，并在TCR序列中观察到独特的克隆富集和优先的v-基因片段。最后，研究了RFX 4肽对富TCR克隆的体外激活作用。总之，我们的结果为RFX 4在一些T1N病例和健康献血者中的参与提供了证据。

道德声明

这项研究已经过斯坦福大学机构评审委员会的审查和批准(协议编号14325，注册编号5136)。从每个参与者那里获得了知情同意。我们确认，所有方法都是按照有关准则和条例进行的。

参加者

为了检测抗RFX 4自身抗体，我们建立了两组匹配的T1n患者和健康对照者。一组为PP-N后患者39例(平均年龄±标准差：平均(SEM)：14.9±1.26，男性30%)和18例PP-C(平均年龄±SEM：13.17±0.97，男性39%)；另一组为47例近期初发T1n(EO-N)(平均年龄±1.43，男性58%)和70例其他对照组(O-C)(平均年龄±1.31，扫描电镜：18.85±1.31)。(表)1，数据集沙一)。所有患者均符合国际睡眠障碍分类3(ICSD 3)标准(Http://www.aasmnet.org/store/product.aspx?pid=849)为T1N。所有的DQ 0602都是阳性的，除了一个例外，一个病人已知的低脑脊液(CSF)低肌肽-1水平。在T细胞反应性检查方面，对2例早期T1n患者、7例Pandemrix T1n后患者、5例Pandemrix后对照者和1例其他对照者进行了检测，并在表中总结了详细信息。1和数据集S2。15例均为DQ 0602阳性。罗氏等人的S11也显示了15例患者中10例的流式细胞术点图。46.

疫苗

Pandemrix(A/California/7/2009(H1N1)NYMC X-179A单价体(灭活、无菌))(批次#AFLSFDA 280)在整个研究过程中使用。2010年1月，葛兰素史克(葛兰素史克)德累斯顿公司生产了HA含量为139μg/ml(用单向扩散法测定)的产品。这批疫苗已在2009-2010年欧洲疫苗接种运动中使用。有关潘德母线特征的摘要见欧洲药品管理局图书馆(Http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Other/2010/05/WC500091295.pdf).

RFX 4结构

从Origene获得RFX4v1(Cat#RG 205481，Origene)、RFX4v3(Cat#RG 223334、Origene)、RFX4v4(Cat#RG 233113，Origene)和绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pCMV 6-AC-GFP(CAT PS 100010，Origene)。将其转化到TOP 10活性细胞(Cat#C 404003，Invitrogen)中，用无内皮质粒maxi试剂盒(CAT#12362，QIAGEN)从细菌培养中纯化质粒。

流式细胞术检测抗RFX 4自身抗体

详细的协议和量化分析方法已经在前面描述过了。42,43。在Dulbecco改良的Eagle‘s培养基(Cat#ATCC 30-2002，atcc)中，加入10%胎牛血清(cat#26140079，gibco)和1%青霉素链霉素(pen/Strep)(cat 15140-122，gibco)，培养人胚肾293 T细胞(atcc crl-3216)。2组织培养瓶(参658175，CELSTAR)，37℃，5%CO2在Opti-MEM I还原培养基(参考文献#31985070，吉布科)中，用脂质体3000试剂(Cat#L 3000015，Invitrogen)转染RFX4v1、RFX4v3、RFX4v4或pCMV6-AC-GFP。24小时后，取细胞，用僵尸近红外(Cat#423106，BioLegend)染色，然后按照制造商的指示用FIX/PERM缓冲器(Cat#421403，BioLegend)固定和渗透。用两种阳性抗体：鼠抗-RFX 4抗体(猫#H 00005992-B01P，Abnova)进行验证和敏感性检测(补充图)。沙一)和兔抗RFX 4抗体(猫#NBP 2-48967，Novus)(补充图1)。S2分别用R-藻红蛋白(PE)抗小鼠免疫球蛋白(Ig)G(参考文献12-4010-82，eBioscience)和抗兔IgG(参考文献12-4739-81，eBioscience)染色(1：100)。细胞与人血清(1：20)在4℃下孵育1h，然后用PE抗人Igλ抗体(参考文献12-9990-42，eBioscience)(1：100)和PE抗人Igκ抗体(Ref#12-9970-42，eBioscience)染色(1：100)。用0.05%吐温-20洗涤PBS去除非特异性结合。在BD LSRII上运行单元，用Flowjo对数据进行分析。79.

定量分析方法改进如下：对每个样品，平均荧光强度(MFI)的PE通道(MFI)。体育)活GFP阳性的HEK293T细胞(HEK293T)GFP+GFP阴性HEK293T细胞(HEK293T)绿色荧光蛋白−)进行计算，然后计算ΔMFI。体育是通过减去MFI来确定的体育HEK293T绿色伙伴关系-来自MFI体育HEK293TGFP+。ΔMFI的截止值体育被确定为ΔMFI的平均值。体育对照样品+3×标准差(SD)35.

显微镜下检测自身抗体的细胞检测法(CBA)

前面描述的协议36被利用了。简单地说，HEK293T细胞在12孔板(参考#353043，康宁)中被培养并转染到玻璃盖板(参考文献#354085，康宁)上(如前所述)。24小时后，细胞被固定和渗透，然后与人血清(1：20)或兔抗RFX 4抗体(1：500)在室温下(RT)在黑暗中孵育2h，然后分别与Alexa Fluor(AF)555-结合抗人IgG抗体(猫A-21433，热费舍尔)(1：500)或AF 555-结合抗兔IgG抗体(Cat#A-21428，热Fisher)(1：500)孵育。所有抗体或血清均在PERM缓冲液中稀释，每次孵育后用PERM缓冲液冲洗两次。图像由Evos FL成像系统(猫#AMF 4300，热Fisher)拍摄。利用ImageJ2.0.0图像处理软件对图像进行分析80。选择感兴趣区域的一个区域，使用ImageJ2.0.0中的单元计数器插件对所有DAPI+GFP+DAPI+GFP+AF 555+细胞进行计数。80.

免疫沉淀(IP)

培养HEK293T细胞，转染75 cm。2如上所述的烧瓶。24 h后，取细胞，用冷磷酸盐缓冲液(Cat#10010-049，吉布科)洗涤，用RIPA缓冲液(猫#89900，热费舍尔)加完全蛋白酶抑制剂(参考文献#11873580001，罗氏)在冰上浸泡15 min。12,000 rpm离心15 min即可清除碎片。上清液与抗tGFP结合琼脂糖珠(CAT#TA 183081，Origene)在4°C下进行端到端旋转培养。加入4×Laemmli缓冲液(CAT#1610747，Bio-Rad)50μl后，在95℃下水洗3次，煮沸10 min。上清液被装入预制凝胶(猫#4561093，Bio-Rad)进行西部杂交。

WESTERNBLOTTING

有关WESTERNBLOTTING协议，请参见Https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_2895.pdf。简单地说，将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜(Cat#ipvh 00010，EMD微孔)，然后与原抗-RFX 4抗体(猫#H 005992-B01P，Abnova)(1：2000)或人血清(1：50)(10毫升阻断缓冲液中200μl)在RT上培养2 h，然后与次级过氧化物结合抗鼠IgG抗体(代码#715-035-150，Jackson ImmnuoResearch)(1：5000)或抗人Igλ(NBP1-73715，Novus)(1：5000)和抗人Igκ(NB 7466，Novus)(1：5000)。分别。用0.05%吐温-20在PBS中广泛洗涤3×10 min，去除非特异性结合。将化学发光底物(Prod#32106，热费雪)应用于印迹实验，用片剂处理器(Konica，SRX-101A)研制了Cat#28906838，GE Healthcare膜。

RFX 4肽库

一个重叠的15-聚肽(11-氨基酸重叠)文库涵盖6个RFX 4变异体.在GenScript上合成纯度>90%的多肽，在5 mm浓度下溶解于二甲基亚砜(DMSO)中。

竞争结合试验

肽结合试验如前所述。81,82。DQ 0602与生物素化的EBV表位(Bio-EBV)共同孵育。486–500、Bio-(GGG)RALLARSHVERTTDE和RFX 4肽在37℃作用72h，然后与单克隆抗DQ(SPV-L3)抗体(Cat#BNUM 0200-50，Biotium)在高结合96孔板(参考文献#9018，Corning)中孵育。DELFIA时间分辨荧光(TRF)强度用Tecan Infined M 1000与Europium(EU)标记的链霉亲和素(Cat#1244-360，PerkinElmer)和增强液(猫#1244-105，9 PerkinElmer)连续孵育后检测(补充图)。S7a)。用300升/井洗涤缓冲液(0.05%吐温-20在PBS中)冲洗5次，去除非特异性结合。BIO-EBV 486-500单独作为参考(阳性对照)，无任何肽作为阴性对照.与文献比较，荧光强度小于25%和25%~50%的RFX 4肽分别被认为是强肽和弱肽。

四聚体DQ 0602-肽染色与单细胞TCR序列分析(TCRseq)

完整的协议在前面已经描述过了。81,83。总之，生物素化的DQ 0602在pH5.2时负载多肽，与PE结合链亲和素孵育。用浓缩纯化的四聚体DQ 0602肽和抗体鸡尾酒染色外周血单个核细胞(PBMCs)，然后进行荧光活化细胞分选(FACS)(补充图)。S4, S6, S7)。四聚体DQ 0602肽阳性CD4+T细胞分为96孔板，进行单细胞TCR测序。

荧光素酶活性

将标记有绿色荧光蛋白(GFP)的TCRαβ链克隆到N 103载体(MarkDavis博士的礼物)上，由IDT(IntegratedDNATechnologies，Inc.)克隆。Jurkat 76(J76)-NFATRE-Luc细胞(马克·戴维斯博士的礼物)用脂质体3000试剂(Cat#L 3000015，Invitrogen)转染TCR。用抗人TCRα/β抗体(CAT#306702，BioLegend)对TCR阳性细胞进行分类.在含10%fbs和1%pen/Strep的完整rpmi培养基(cpmi#61870-036，gipco)中，有10万个j76-tcr细胞与10万rm3-dq 0602共同培养。84PHA 10 M存在下的细胞273–287、NP17–31，HCRT54-66-NH2，HCRT86-97-NH2、RFX4-43、RFX4-86、RFX4-95、RFX4-60或0.2l DMSO作用8h，用Nano-Glo荧光素酶分析试剂盒(Cat#N 1130，Promega)检测荧光素酶活性。

统计分析

抗RFX 4自身抗体分析和J76-TCR发光分别表示为均值±SD和均值±标准差(SEM)。用双尾法进行统计比较。t-测试。数据是用GraphPad Prism版本5.0.0 for Windows绘制的(美国加州圣地亚哥，GraphPad软件，Www.graphpad.com)和R85。P值<0.05被认为具有统计学意义。

抗RFX 4的自身抗体在病例和对照组中不存在或非常罕见。

为检测T1n细胞中是否存在抗RFX 4的自身抗体，在人胚肾(HEK)293 T细胞中表达了带有绿色荧光蛋白(GFP)的RFX4v1、RFX4v3和RFX4v4。对39例PP-N后患者、18例PP-C后对照、47例近期发病早期T1n(EO-N)和70例其他对照组(O-C)的HEK293T细胞进行染色后，用流式细胞仪定量测定其平均荧光强度(MFI)。比较ΔMFI体育通过减去MFI来确定体育HEK293T绿色伙伴关系-来自HEK293T的MFIPEGFP+无论是v1、v3或v4，患者与对照组之间均无显着性差异，但PP-N患者抗RFX4v3自身抗体水平明显高于未接种或接种对照组(p值分别为0.018和0.006)。1a)。174例受试者中，1例(O-C)、3例(2 PP-N和1 O-C)和2例(1 PP-N和1 O-C)分别检测到抗RFX 4_v1、v3和v4的自身抗体水平(图1)。1A，数据集S3)，因此表明抗RFX 4自身抗体是罕见的。此外，2例PP-N患者和1例O-C患者的RFX_4_v3与PE和GFP信号呈正相关，而v1或v4无明显相关性(图5)。1B)，经细胞免疫染色(CBA)证实。1(C)并使用Westernblotting(图1.1(D)以高灵敏度流式细胞仪为基础，对检测结果进行验证.综上所述，这些发现表明抗rfx 4的自身抗体非常罕见，不太可能如先前的研究所建议的那样，在t1n中起调节作用。35,36,37.

RFX 4抗原特异性CD4+T细胞的检测

为了检测抗原特异性CD4+T细胞，将3种EO-N、7 PP-N、5 PP-C和1 O-C的外周血单个核细胞(PBMCs)分别用Pandemrix或单个RFX 4肽培养，然后用DQ 0602四聚体染色，负载32条强肽和6条弱rfx 4肽(表)。2)。潘德母线的散发型(补充图)S3)刺激表明Pandemrix与RFX 4之间没有交叉反应。值得注意的是，三种不同的多肽RFX 4-60、-86和-95是强肽，至少在四个RFX 4变异体中共有，导致4例患者和2例同胞对照的CD4+T细胞明显分离(图1)。2(A)提示在这些嗜睡症病例和对照组中，T细胞反应与RFX 4有关。

2例PP-N(021例和948例)和2例PP-C组(5688例和901例)均检测到DQ 0602所表达的T细胞对RFX4-86的反应性，而对RFX4-95的识别仅见于2例PP-N患者(021例和900例)。2a)。T细胞对RFX4-60的反应性仅见于一例EO-N患者(848例)。2a)。值得注意的是，病人021对rfx 4-86和rfx 4-96都有反应，它们在所有6个rfx 4-变体中都是共享的。2)。总之，这些发现揭示了RFX 4特异性CD4+T细胞在后潘德母线和早期发作性嗜睡症患者，因此暗示RFX 4参与T细胞免疫在这些嗜睡症患者和对照组。

RFX 4抗原特异性单个CD4+T细胞TCR序列测定

下一步，我们的目标是确定RFX 4特异性CD4+T细胞的特性。6例人rfx 4-86、-95和-60三种多肽的7种阳性反应的抗原特异性CD4+CD8-T细胞被分成96孔板进行tcrα和β测序(共7×96细胞)(数据集)。S4)。对于每一肽-主体反应，96/96(68%)细胞中，除RFX4-86/5688(病例对照，40细胞，42%)和RFX 4-60/848(PP-N，12细胞，13%)外，其余细胞恢复率均在65以上(68%)。2B，数据集S4)。至少有一个独特的TCR克隆被富集在43%以上(≥7计数)。例如，1例患者(021例)识别RFX 4-86(73%，22%)或RFX 4-95(46%，38%)，其中1例患者(948例，79%)和2例对照组(5688例，58%；901例，43%)识别RFX 4-86，1例患者(900例，89%)识别RFX 4-95，1例患者(848例，58%)识别RFX 4-60(见图)。2b)。值得注意的是，RFX4-86TRBV4-2，它与T1n相关联。131例(79%)，1例对照组(58%)。2b)。

其次，分析TCR V基因片段在患者和对照组中的使用情况。TRBV 28(34%)和TRBV 4-2(32%)分别是患者和对照组中使用频率最高的V基因片段。2c)。值得注意的是，以前与T1n相关联的TRBV 4-2。13也常用于患者(19%)和对照组(32%)。然而，与此形成鲜明对比的是，经常使用的Trav基因在患者和对照组之间显示出更多的差异(图一)。2c)。

在RFX4-86、-95和-60之间，经常使用TRBV和Trav/TRBV配对(见图4)。2c，D)。在RFX 4-86中，TRBV 4-2(36%)与TRAV 2(52次，20%)和TRAV 38-2/DV-8(23次，9%)最常配对，而在RFX 4-60中，TRBV 14(58%)与TRAV 29/DV5(7次，58%)配对(对照组未发现多于5个细胞)。在RFX4-95中，TRBV 28(69%)与TRAV 19(74次，49%)和TRAV 3(26次，17%)配对。2d)。综上所述，这些结果表明TCR在四聚体DQ 0602阳性CD4+T细胞中富集，V基因片段在患者和对照组之间有部分相似之处，而RFX4-86、-95和-60之间差异有显着性。

RFX 4自身反应性CD4+T细胞中的TRBV 4-2

在最后一步中，我们的目的是探讨特异性TCRs对RFX4-86、RFX4-95和RFX4-60的反应性。因此，丰富了tcrαβs(≥7克隆，表)3)在Jurkat 76(J76)-NFATRE-Luc细胞中表达，后者缺乏天然TCRs，并与抗原提呈细胞RM3-DQ 0602共同培养。荧光素酶活性显示TCR 162(TRBV28_CASSSSGQGGNSPLHF_TRBJ1-6/TRAV19_CALSGDVYGGSQGNLIF_TRAJ42)，、TCR 166(TRBV2_CASSGQGSYEQYF_TRBJ2-7/TRAV9-2_CALSSLWGEKLTF_TRAJ48)和TCR 170(TRBV28_CASSFSGTRTGELFF_TRBJ2-2/TRAV12-2_CAVMPNDYKLSF_TRAJ20)对RFX4-95有显著反应。4种tcrs对rfx 4-86均表现出反应性，即tr 163(TRBV12-3_CASSLRGLNYGYTF_TRBJ1-2/TRAV41_CAVLNRDDKIIF_TRAJ30)，tr 165(TRBV4-2_CASSQEGGKETQYF_TRBJ2-5/TRAV6_CALDRGTDKLIF_TRAJ34)，tr 172(TRBV5-6_CASSLGPRTPKGQYF_TRBJ2-7/TRAV39_CAVENNNDMRF_TRAJ43)和tr 173(TRBV4-2_CASSQDVRQGGYGYTF_TRBJ1-2/TRAV29/DV5_CAASDQAGTALIF_TRAJ15).。最后，TCR 174(TRBV14_CASSLQGRRGDTQYF_BJ2-3/TRAV29/DV5_CAASAGAGSYQLTF_TRAJ7)被证明对RFX4-60有反应。3)。如前所述，TRBV 4-2是在嗜睡症背景下感兴趣的一些tcr片段之一，因为调节其使用的基因qtl位置与这种情况密切相关。13。在这里我们发现两个TCRs(TCR 165来自1例患者，TCR 173来自一个对照组)共享TRBV 4-2，因此这两种供体的CD4+T细胞自身反应性与通过RFX 4-86的TRBV 4-2之间有一定的关系。值得注意的是，没有检测到RFX 4和HCRT/Pandemrix之间的交叉反应，表明这些TCRs是RFX 4特异性的。3)。RFX 4激活TCR进一步提示RFX 4参与T1n和对照组。

嗜睡症的自身免疫假说产生于30多年前，其基础是人类白细胞抗原-DQ 0602的强烈关联，虽然最初支持这一假说的证据很难证实，但最近的数据表明T细胞参与了HCRT细胞的破坏。在本研究中，我们研究了在HCRT细胞中高度富集的RFX 4是否是T1n中的相关自身抗原。这是通过检测自身抗体和/或DQ 0602限制T细胞对它的反应性来完成的。

自身抗体是否参与了嗜睡症的病理生理过程是有争议的。嗜睡症患者抗次克次体和次克次体受体自身抗体的研究结果喜忧参半。35,36,37,38。其他研究小组也研究了对hcrt细胞中表达的其他蛋白质的反应性，如trb 2，结果也类似地不同。31,41。此外，最近的一项研究调查了甲型h1n1血凝素抗体水平和疫苗相关t1n的亲和力，认为这些抗体不太可能参与发病机制。86。结果表明，抗RFX 4的自身抗体在T1n患者中是罕见的，仅2例(1%)患者抗RFX 4_v3自身抗体的反应性显著升高(1%)，两者均接种了潘德母线(Pandemrix)。所有患者均未检测出抗hcrtr 2自身抗体。37。抗RFX4_v1/v4自身抗体ΔMFI体育以上被试的断线不能重复，点状图显示PE与GFP通道之间没有明显的相关性(图一)。1)，提示抗RFX4v1/v4自身抗体水平过低，无法检测到。综合起来，这些发现支持了我们实验室和其他人以前的数据。34支持自身抗体不太可能参与嗜睡症的病理生理过程。此外，我们的发现也证实了高通量流式细胞仪自身抗体检测法作为一种筛选自身抗体的方法是可靠的，而不仅仅是对表面抗原的检测。

其次，我们通过共培养早期和后PandemrixT1n患者的PBMCs或单一的RFX 4肽来探讨抗原特异性CD4+T细胞的存在。四聚体DQ 0602阳性CD4+T细胞在Pandemrix刺激下未见明显聚集，但在患者和对照组均有零星观察。例如，对RFX 4-36、-76和-172的细胞反应分别在早发患者(165)、PP-N患者(900)和PP-C(023)(补充图)中被确认。S3)。四聚体pDQ 0602识别的CD4+T细胞在CD3+T细胞中所占比例很小(一般低于0.085%，多数<0.05%)，除1例对照(901%)外，背景高(肽NC，0.12%)(补充图)。S3).

在探讨RFX 4抗原特异性CD4+T细胞存在的过程中，我们检测了1例EO-N、3例PP-N患者和2例正常人对RFX 4-60、-86和-95的反应性。因此，我们试图进一步确定这些细胞的身份，并对反应性细胞进行了单细胞TCR测序。对经常使用的Trav/TRBV配对的分析表明，虽然V基因片段在患者和对照组之间有部分相似之处，但它们在RFX4-86、-95和-60之间有显着性差异。为了探讨特异性TCRs对这三种多肽的反应性，我们在Jurkat 76(J76)-NFATRE-Luc细胞中表达了富集的TCRαβs，并与RM3-DQ 0602共同培养。1例TCR(TCR 165)和1例健康供者抗rfx 4-86反应TCR(TCR 173)使用TRBV 4-2，本实验室曾通过遗传分析证实Trr 165与嗜睡症病理生理学密切相关。13.

虽然T1n的自身免疫性病因最近得到了巩固，但这种疾病的确切病理生理学仍不清楚。我们的发现表明，未来的工作应该致力于研究RFX 4在T1n中的确切作用，以及对这种蛋白的反应性如何可能影响HCRT神经元死亡。早期的研究发现RFX 4仅限于睾丸。62然而，后来的工作也证明了这种转录因子在大脑发育中的作用。65。因此，我们可以想象，不仅HCRT神经元可能受到自身抗体或CD4+T细胞对RFX 4的影响，而且其他细胞类型和组织也会受到影响。然而，值得注意的是，对这种肽的反应并不是性别限制的，在男性和女性中都存在。

虽然在大量受试者中进行自身抗体筛选是可行的，但我们研究的一个局限性是，由于竞争结合试验和DQ 0602四聚体染色的非高通量和费力的方案，对自身反应性CD4+T细胞的检测还不算高。然而，竞争结合试验和DQ 0602四聚体染色法对T1n自身抗原反应性的筛选是可行和可靠的，因此，这些方法现在可以推广到使用高通量的新技术来研究更多的抗原和患者。这些额外的实验可以使用10×相容单细胞分析和DNA条形码标记，以及将四聚体反应的强和弱RFX 4聚合到DQ 0602。RFX 4特异性CD4+和CD8+T细胞的单细胞TCR序列测定和表型分析可阐明RFX 4在嗜睡症病理生理中的作用。

总之，由于rfx 4与次生质共定位，并且高度富集于亚克丁神经元。34,45,54,55我们假设RFX 4在T1n中是一种自身抗原，这是由于T1n失活(>90%)并与TRBV 4-2 10基因相关。虽然我们在本研究中提供的证据表明，抗该肽的自身抗体是罕见的，不太可能参与这一疾病的发病，但在一些嗜睡患者和健康献血者中，抗RFX 4肽的T细胞反应性良好。重要的是，TRBV 4-2在一例嗜睡症患者和一名健康供者中的富集表明RFC 4 CD4+T细胞自身反应性在这些供体中的参与。总的来说，一些针对RFX 4的自身反应性CD4+T细胞已经在嗜睡患者和健康供者中检测到。