占主导地位CDKN2B/p15INK4b9p21.3抑癌枢纽对细胞周期和糖酵解的抑制作用

人类染色体9p21.3在细胞永生化和癌症、冠状动脉疾病和2型糖尿病等疾病中易失活。虽然这个位点编码三种细胞周期素依赖性激酶(Cdk)抑制剂(P15)。INK4B，p14ARF和p16Ink4a)，我们对它们的功能和行动方式的理解仅限于后两者。在这里，我们展示了在体外p15INK4B明显强于p16Ink4a抑制pRb 1磷酸化、E2F活性和细胞周期进程。在小鼠中，表达致癌基因的尿路上皮细胞HRAS缺乏p15INK4B，但不是那些表达HRAS缺乏p16Ink4a发生早发性膀胱肿瘤。CDKN2B/p15的效价INK4B在肿瘤抑制中，CDK 4/CDK 6通过关键N端残基与CDK 4/CDK 6有很强的结合。P15INK4B还结合和抑制烯醇化酶-1，一种糖酵解酶上调在大多数癌症类型。我们的结果突出了p15的双重抑制作用。INK4B关于细胞增殖和揭示p15的机制INK4B异常可能是癌症和非癌症情况的基础。

CDKN2B基因位于人类染色体9p21.3上，编码p15INK4B，一种细胞周期调节因子，对细胞周期素依赖性激酶CDK 4和CDK 6表现出抑制活性。1,2)。连同CDKN2A基因，编码p14ARF和p16Ink4a通过使用单独的第一外显子，并通过p5 3和pRb通路分别发出信号。3这三种CDK抑制剂串联排列在9p21.3上，构成了一个显著的抑癌中心，在原代培养细胞永生化之前经常被删除或表观沉默。4,5,6肿瘤前病变7,8多种肿瘤类型3,4,9,10,11。与p14不同ARF和p16Ink4a其抑瘤活性已被证实，p15。INK4B通常被认为与p16在功能上等价。Ink4a以及9p21.3缺失期间的旁观者。然而，这些概念与(I)p15的现象形成了鲜明的对比。INK4B可以作为独立于p14的删除目标。ARF和p16Ink4a2,12三种CDK抑制剂可以通过启动子特异性甲基化分别下调，顺式-长时间非编码反式RNA(即ANRIL和c-ANRIL)13,14,15或发散的上游信号(即p15)INK4B转化生长因子β(TGF-β)16,17)；(3)第15页INK4B在没有p16的情况下变得至关重要Ink4a 18(Iv)基因工程小鼠失去p14。ARF和p16Ink4a不能与癌基因协同诱发某些细胞类型的肿瘤，如尿路上皮19。通过分析p15INK4B在体外，在体内，以及在人类肿瘤队列中，我们提出了多种证据来证明p15。INK4B作为一个明显比p16强的抑癌因子Ink4a通过双重抑制细胞周期和有氧糖酵解(Warburg效应)20。我们提供详细的结构基础，设置p15。INK4B除了p16Ink4a功能和机制INK4B发挥其强大的作用。我们的发现突出了p15的主导作用。INK4B9p21.3位点在抑瘤中的主成分及p15的重要贡献INK4B肿瘤发生缺陷。此外，我们的研究揭示了一个切入点来研究非癌症疾病(如冠状动脉疾病、2型糖尿病和青光眼)的难以捉摸的分子基础，所有这些都与9p21.3像差显著相关。9,21,22,23.

损失p15INK4B从表达致癌基因的小鼠尿路上皮细胞中触发早发性高穿透性肿瘤HRAS

我们最初的调查动机CDKN2B编码p15INK4B(以下简称P15)是由于9p21.3在人尿路上皮肿瘤中丢失的频率较高(高达70%)。11,24,25,26，但完全失败的损失CDKN2A(编码p14)ARF和p16Ink4a或p14和p16分别与致癌物质协同作用。HRAS(Q61L)诱导小鼠尿路上皮瘤19。我们推测，p15可能取代p14和p16在泌尿上皮肿瘤的抑癌作用中发挥更重要的作用。HRAS，p15损失可能更多地反映了9p21.3的损失。为了检验这个，我们穿越了Upk2-HRAS转基因小鼠，其中癌基因的表达HRAS是由泌尿系受限的小鼠驱动的。Upk 2启动子(如图所示)1A)19,27，随处可见CDKN2B敲除小鼠，其中第2外显子CDKN2B被一个neo基因所取代。1A)，它破坏了p15的表达。28。杂交后代产生了几个假设-可测试的基因型(图一)。1B)，我们追踪了长达10个月的尿路上皮肿瘤发生(图一)。1(c-f)用活小鼠尿斑的浸出试验作为血尿的初步筛选(图一)。1C人类膀胱癌患者的一种突出的临床表现29，我们能够识别潜在的膀胱肿瘤，这些肿瘤主要与HRASWT/*/p15−/−基因型(图1.1C、上面板、箭头)。一组小鼠尿囊的大体解剖，从2月龄开始每2个月献血一次(n10/时间点/基因型)显示膀胱明显增大(图1)。1C，下面板(如在膀胱)明显增加膀胱重量(图)。1D，上面板)在HRASWT/*/p15−/−)，即使体重并没有明显的差异(图中所示)。1D，下面板)。肾积水仅见于HRASWT/*/p15−/−组，特别是在4个月大的年龄组(图1)。1C，下面板(如在肾脏)，可能是由于膀胱肿瘤过度生长和阻塞的尿路出口。总体上，在HRASWT/*/p15−/−2 0%的小鼠、80%的小鼠在4个月内、10 0%的小鼠在6个月内证实膀胱肿瘤。1E，f)。膀胱肿瘤也在HRASWT/*/p15WT/−小鼠(例如，杂合子p15缺失)，尽管频率低得多(30%到10个月)，发病较晚(从4个月开始)和较小的大小(仅在显微镜下可见)。而相对较少的HRASWT/*/P15+/−(其中p15为杂合子)也发生膀胱肿瘤，肿瘤细胞保留一个p15等位基因。我们目前还不能排除剩余的等位基因是否被过度甲基化、ANRIL或上游调控物(如TGF-β)灭活(见下文)。这是一个值得进一步调查的重要问题。根据组织学，p15−/−小鼠显示正常的泌尿上皮和HRASWT/*小鼠尿路上皮增生1F)。相反，HRASWT/*/p15−/−小鼠膀胱肿瘤呈乳头状，病理分级低，局限于尿路上皮层，不破坏基底膜，是低级别、无侵袭性肿瘤(图一)。1F)。这些数据提供了第一个体内实验证据，表明p15丢失和HRAS激活是两种高度协同的事件，它们足以引发低级别、无侵袭性膀胱肿瘤，这是人类最常见、最复发、最昂贵的膀胱肿瘤类型。30,31,32.

P15在体内是一种比p16更有效的尿路上皮肿瘤抑制因子。

虽然我们之前已经表明CDKN2A未能与致癌HRAS诱导尿路上皮肿瘤19，我们在这里展示了p15的丢失和致癌HRAS尿路上皮细胞高度致瘤(图一)。1)，这两项研究是在不同的时间和环境下进行的。另外，因为CDKN2A同时编码p16和p14(P19)，在相同的实验条件下，我们有必要确定p15与p16(而不是p16和p19一起)在抑制尿路上皮肿瘤中的相对效力，以及它们在尿路上皮肿瘤发生过程中丢失的体内效应。考虑到这一点，我们在Upk 2-HRAS*转基因小鼠和p16基因敲除小鼠的第1外显子αCDKN2A用一个neo基因替代基因，该基因使p16失活，但不能替代转录p19(图19)。2A还有参考文献。33)。同时，我们在Upk 2-HRAS*转基因小鼠和上述p15基因敲除小鼠。2A)。我们从这些杂交中获得了许多不同的基因型，但我们选择了几种最相关的基因型来确定p16缺失和p15缺失在泌尿系肿瘤发生中的体内差异，即(I)野生型(WT)小鼠表现正常的泌尿上皮；(Ii)单等位基因。HRASWT/*我们之前发现的小鼠在10个月前就会持续发展为单纯性尿路上皮增生。19；(3)HRASWT/*/P15−/−小鼠；和(Iv)HRASWT/*/P16−/−老鼠(图1.2B)。Westernblotting证实上述组(Ⅲ)小鼠和(Iv)小鼠尿上皮细胞中分别有p15和p16的缺失(图一)。2C)。有趣的是，在人力资源评估*-表达尿路上皮增生，尤其是在人力资源评估*-表达和p16缺失的尿路上皮细胞。而p16则无明显的诱导作用。人力资源评估*-表达尿路上皮细胞，从这些细胞中缺失p15与强烈诱导p16相一致(见图)。2C)。因此似乎是致癌的HRAS当另一种蛋白缺失时，引起尿路上皮细胞p15和p16的相互代偿性诱导，尽管在抑制肿瘤方面具有不同的效力(见后见)。最后，p19的表达量大幅增加，仅限于人力资源评估*-表达及缺乏p15的尿路上皮细胞。2C)。然而，这种增加显然并没有阻止尿路上皮肿瘤的形成。这是否阻止了尿路上皮肿瘤的进展，即从无创期到浸润期，还需要进一步的研究。

肿瘤发生分析表明HRASWT/*老鼠没有任何尿路上皮肿瘤，只有10%和20%HRASWT/*/P16−/−小鼠分别在6月龄和8月龄时患上膀胱肿瘤(如图所示)。二维空间)，这只能在显微镜下可视化。对比和一般支持我们的初步队列如图所示。1，40%的患者出现膀胱肿瘤。HRASWT/*/P15−/−小鼠最早2个月，70%的小鼠6个月，80%的小鼠10个月(图1)。2D，e和附图。1)。毫无例外，这些肿瘤的病理分级低，表面位置和乳头状(图)。2E如需更高的放大倍数，请参见附图。1)。进一步建立p15和p16在肿瘤抑制中的不同效力。人力资源评估*突变，我们分析了另一组小鼠(补充图)。2)。这些数据具有很高的重复性，因为在3个月大的时候，40%的HRASWT/*/P15−/−小鼠出现尿路上皮肿瘤，而无一只出现尿路上皮肿瘤。HRASWT/*/P16−/−做了同样的事。我们确实认识到肿瘤的发生和发生频率的细微差别。HRASWT/*/P15−/−第一组之间的老鼠(图1)。1E)和队列2(图2)。二维空间)和3(附图。2)。我们认为，在遗传背景上的微小差异，即第1组小鼠更接近C57BL/6，第2组和第3组小鼠更接近FVB/N，这可能是造成这些差异的原因之一。

而肿瘤细胞在HRASWT/*/P15−/−小鼠继续表达尿路上皮标记物，如Upk3a。34，它们的强度减弱，伴随着细胞增殖的标记物显著增加，如Ki 67，或尿路上皮肿瘤祖细胞，如Krt 5和Krt 14(图14)。3A)35,36。相反的是HRASWT/*/P16−/−老鼠(图1.3A)。这些数据强烈表明，在人力资源评估*P15缺失在膀胱肿瘤的发生中起着比p16缺失更重要的作用。此外，我们观察到在没有其他蛋白的情况下，p15和p16的相互诱导作用(如图所示)。2C)，p15和p16同时缺失。HRASWT/*/Ink4ab−/−在两个独立的队列中，小鼠没有明显增加肿瘤频率或缩短肿瘤潜伏期(补充图)。3)超越了我们所看到的HRASWT/*/P15−/−老鼠(无花果)1E、F和2D、e和附图。1和3)。这进一步支持了p15丢失在功能上比p16丢失更重要的观点。人力资源评估*-介导的尿路上皮肿瘤的发生，p16和p15的缺失在尿路上皮肿瘤的发生过程中没有表现出协同或显著的相加作用。然而，需要对大量队列和更多时间点进行进一步的调查，以确定这一结论。

P15对细胞周期进程和增殖的抑制作用明显大于p16。

为了了解p15和p16在抑制尿路上皮肿瘤中不同效力的作用机制，我们采用荧光活化细胞分选法检测了细胞周期分布。3B)和pRB1磷酸化。3C)在小鼠体内，如图所示。2D，e和附图。1。尿路上皮细胞在G0+G1期的比例较低，S期和G2/M期的比例较高。HRASWT/*/P15−/−老鼠比HRASWT/*/P16−/−老鼠(图1.3B)。这与prb 1在S 780和S 807/811位点的磷酸化增强相一致。HRASWT/*/P15−/−老鼠(图1.3CP15缺失对CDK 4和/或CDK 6的抑制作用明显大于p16缺失。

为了独立验证体内结果，我们通过恢复P15和p16在9p21.3纯合子缺失的人膀胱癌细胞系UMUC 3和RT 112中的表达，研究了p15和p16对膀胱癌细胞生长抑制的作用(参考文献)。37)缺乏内源性p15和p16。首先用CMV驱动的四环素反式激活剂(CMV-RTTA)稳定转染细胞株，然后稳定转染四环素反应元件(TRE)、Myc标记的p15 cDNA或Tre驱动的p16基因，我们可以用四环素诱导表达、检测和半定量，通过Myc标记、还原的p15或p16。我们发现p15在这两种细胞株中对细胞增殖的抑制作用明显大于p16(图1)。4A)。此外，与p16相比，p15能显著增加G0+G1期细胞的比例，减少S期和G2+M期的细胞组分(附图)。4A)。此外，p15在S 780和S 807/811处对pB 1磷酸化的抑制作用明显大于p16，而p15和p16对其他Rb家族成员pB 2和p 107的磷酸化无明显影响。4B)。P15的表达降低了pRB1的磷酸化，导致pRB1/E2F结合增加，E2F释放减少，与此一致，p15表达细胞的E2F活性明显低于p16表达细胞(附图)。4B).

P15比p16更有效地与CDK 4和CDK 6结合。

因为CDK抑制剂通过直接结合来抑制CDK38,39我们用两种独立的方法检测p15与CDK 4和CDK 6的结合是否比p16更有效。首先，我们在UMUC 3细胞中诱导表达Myc标记的p15或Myc标记的p16，然后用一种抗Myc抗体进行免疫沉淀，然后用Westernblotting检测和半定量检测与p15或p16自然结合的CDK 4和CDK 6。经免疫沉淀标记的p15和Myc标记的p16后，p15免疫沉淀的CDK 4和CDK 6分别约为p16的6倍和5倍。4C)。在第二种方法中，我们通过表达重组的组氨酸标记的p15或组氨酸标记的p16，对总蛋白提取物中的cdk 4和cdk 6进行了拉下实验。大肠杆菌将任何一种蛋白与镍柱结合，与未转染的UMUC 3细胞中提取的总蛋白共同孵育。用咪唑在100 mm处洗脱组氨酸标记的p15和组氨酸p16时，p15洗脱的CDK 4比p16洗脱的CDK 4多4倍以上(图1)。4D)。另一项独立实验证实了这一结果，结果显示，p15为诱饵，CDK 4和CDK 6分别富集了4倍和8倍，而p16则是诱饵(图1)。4E).

P15的N端介导p15与CDK 4和CDK 6的强结合。

P15和p16具有高度同源性(氨基酸序列同源性为69%)，除了N-末端(N)和p16特有的较长的C端(C)外。为了识别p15与CDK 4/CDK 6之间强相互作用的区域，我们首先利用工程基因p15/p16C，即p15-N/p16-C和p16-N/p15-C，在p15与p16之间进行了结构域转换。在缺乏p15/p16的UMUC 3细胞中，Myc标记的杂交种及其野生型对照的转染和诱导表达表明，p15-N/p16-C在抑制pRB1磷酸化方面与野生型p15一样有效。5A)和细胞增殖。5B)。相比之下，p16-N/p15-C对pRB1磷酸化的抑制作用与野生型p16一样无效。5A)和细胞增殖。5B)。步骤性N端缺失，然后是转染和免疫沉淀。5C)或通过产生缺失突变体大肠杆菌和拉下实验(图一)。5D前15个氨基酸的缺失显著降低了p15与CDK 4的结合，前27个氨基酸的缺失完全消除了p15与CDK 4的结合。这些结果表明，p15的N端具有与CDK 4和CDK 6结合，抑制pRb 1磷酸化、细胞周期进程和增殖的能力。

P15和cdk 6之间的关键盐桥和氢键是强结合的基础。

由于p15的晶体结构不可用，我们利用了共结晶p16cdk 6的结构。40用于p15-CDK6相互作用的计算建模和分子动力学(MD)模拟。6补充图A，b。5和补充表3)。模拟结果表明，p15和CDK 6的N端之间存在几个关键的交互点，特别是在盐桥和H键中(图1)。6A)。具体而言，p15的N端残基Ser20和Arg 24可与CDK 6的Glu18和Glu21形成H键和盐桥。6A)。另外，p15的Glu16能与p15的Arg 45形成盐桥，从而稳定Arg 45，从而与CDK 6的Glu18形成附加的盐桥。6A)。这些相互作用可以相互配合，形成一个相对稳定的网络，如MD模拟所示(图)。6A)。相比之下，从p16-CDK 6晶体结构和p16-CDK 6 MD模拟来看，p16缺乏与CDK 6的这种N端相互作用。6A)。利用p15和p16序列比对的一对一残基作图(图1)。6BP15的Glu16、Ser 20、Arg 24和Arg 45分别与p16的Asp14、Thr 18、Arg 22和Ser43相对应。P16-CDK 6复合物的结构和动力学分析表明，由于CDK 6的Arg 168和p16的Arg 24(对应于p15的Leu 26)的排斥力，p16附近的Arg 22不能与Glu18和Glu21形成盐桥。6A)。因此，我们的模型提供了一个结构基础，扩展了实验结果，表明p15与CDK 6的相互作用比p16更强。

为了验证我们的计算假设，我们用丙氨酸取代Glu16、Ser 20、Arg 24和Arg 45，进行了结构导向的定点突变。这些突变体在UMUC 3中与Myc-Tag融合表达，然后用抗Myc抗体免疫沉淀CDK 4和CDK 6，或以组氨酸标记突变体为诱饵和从亲代UMUC 3细胞中提取总蛋白提取物作为诱饵，结果表明，与野生型p15相比，p15突变体与CDK 4和CDK 6的相互作用明显减少(见图)。6c，d)。虽然弱相互作用的程度在一定程度上取决于不同的突变体、检测方法以及与CDK 4和CDK 6的相互作用，但总体结果与我们关于关键氨基酸的模拟结果是一致的，这些关键氨基酸被认为是p15与CDK 6结合的关键(图1)。6a，b)。

为了进一步检验p16与cdk 6之间的弱相互作用是否部分是由p15的arg 24(对应于p15的leu 26)和cdk 6的arg 168之间的排斥力所致，我们用亮氨酸代替p16的arg 24，因为md模拟p16-cdk 6复合物显示arg 22是p16的arg 22。R24LCDK 6的Glu18和Glu21能部分恢复盐桥(附图)。6A和6B)。这种替换确实增加了p16和CDK 6之间的结合，但与CDK 4(补充图4)无关。6C)，提示p16中与p15有差异的其他残基也不太适合与CDK 4相互作用。

P15通过N端与烯醇化酶-1在体内外相互作用。

在确定p15是一种比p16更有效的细胞周期抑制剂之后，我们探讨了p15是否通过与其他细胞蛋白的相互作用在肿瘤抑制中发挥非规范作用。我们采取了一种不偏不倚的方法大肠杆菌-以组氨酸为诱饵，以组氨酸为诱饵大肠杆菌-产生组氨酸标记p16或组氨酸标记作为对照。将诱饵和对照分别连接到镍柱上，用从亲代UMUC 3细胞中提取的总蛋白孵育。结合蛋白经二维电泳洗脱后，选择与组氨酸p15特异结合的蛋白，而不与组氨酸或组氨酸p16特异结合的蛋白质进行质谱分析(附图)。7)。在分析的17个二维凝胶点中，2个属于烯醇化酶-1(α烯醇化酶)，一个的吉祥物评分为1823，其中117个肽序列经液相色谱串联质谱鉴定(补充表)。1).

为了确定p15和enolase-1之间的相互作用是否是特定的，我们使用大肠杆菌-从亲本UMUC 3中产生组氨酸标记的p15和总蛋白，以及诱导表达Myc标记的p15在UMUC 3细胞中的免疫沉淀。这两个实验都明确地验证了p15和烯醇化酶-1之间的特异性结合(图1)。7A)。相反，在相同的实验条件下，p16不能结合烯醇化酶-1。P15，而不是p16，在表达致癌基因的小鼠尿路上皮细胞中也与烯醇化酶-1结合。HRAS(无花果)7b)。值得注意的是，缺乏p15/HRAs表达的尿路上皮细胞明显升高了烯醇化酶-1(图1)。7b)，这与肿瘤细胞的糖酵解上调相一致(见下文)。此外，p15与烯醇化酶-1结合，但不与AKT或丙酮酸激酶2(PKM 2)结合。7b)，从而进一步证明了结合的特异性。利用上述p15/p16结构域转换突变体(如图所示)。5在强制表达和免疫共沉淀实验中，我们进一步证明是p15的N端介导了p15与烯醇化酶-1的相互作用(图1)。7C)。最后，野生型p15和p15-N/p16-C杂合物与神经元特异性烯醇化酶2(神经元特异性烯醇化酶)均无结合。7C).

P15、烯醇化酶-1和CDK 4的竞争性结合及其对烯醇化酶-1活性和好氧糖酵解的影响

为了评估p15与烯醇化酶-1的结合是否降低了后者的催化活性，我们在体外培养纯化的蛋白，发现p15，而不是p16，显著降低了烯醇化酶-1的活性(图1)。8A)。由于p15的N端介导了它与CDK 4和烯醇化酶-1的结合，因此我们接下来研究了烯醇化酶-1与p15的结合是否能竞争性地抑制CDK 4与p15的结合。在平板实验中，随着烯醇化酶-1浓度的增加，我们观察到CDK与p15结合的剂量依赖性降低(图1)。8B).

与无细胞系统一致，我们发现p15缺乏与体内烯醇化酶活性升高有很强的相关性。例如，烯醇化酶的活性在HRASWT/*/p15−/−老鼠比HRASWT/*/p16−/−老鼠(图1.8C)。此外，通过Seahors分析，糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备均显着地提高了大鼠的糖酵解能力和糖酵解储备。HRASWT/*/p15−/−缺乏p15表达的小鼠。8D)。同时，我们的数据揭示了p15通过其与烯醇化酶-1和糖酵解活性的相互作用和抑制作用在调节肿瘤细胞代谢中的作用。

烯醇化酶-1下调膀胱癌细胞增殖

为了探讨烯醇化酶-1的生物学效应，我们在表达p15的UMUC细胞中通过shRNA基因敲除来下调其表达(如图1所示)。9A)。与摇摇欲坠的对照组相比，烯醇化酶-1的减少与p15与CDK 4和CDK 6的结合增加有关(图6)。9A)和减少的细胞周期进展(图。9B)和细胞增殖。9C在体外观察到p15、CDK 4/6和烯醇化酶-1结合的竞争性。这些数据进一步表明，p15在抑制细胞周期进程和糖酵解方面具有双重作用。

我们在本文中提出的发现在几个方面都是非常有意义的。首先，我们在体外和体内获得的多条证据线建立了CDKN2B作为中心角色，而不是旁观者，9p21.3位点在尿路上皮肿瘤抑制中起主导作用CDKN2B导致低级别无浸润性膀胱癌形成的缺陷。在此过程中，我们解决了9p21.3缺失的高患病率(~70%)与RTK-RAS人膀胱肿瘤的活化(~95%)7,31,41以及活化的RTK对小鼠致瘤性的影响-RAS单独或与之结合的通路成分CDKN2A删除19,42,43。我们的数据强烈表明CDKN2B缺陷更多地反映了9p21.3的损失，是与RTK-的功能相关的合作伙伴-RAS启动膀胱肿瘤。因此，CDKN2B，而不是CDKN2A，再加上RTK-RAS活化应作为诊断和预测低级别非侵袭性膀胱癌复发的一组组合生物标志物。因为并发9p21.3灭活和RTK-RAS活化在非膀胱癌类型中非常普遍。8,9,13，我们的发现引起了人们的注意，有必要重新审视CDKN2B缺乏其他器官系统和细胞类型的肿瘤发生。应更多地注意其致瘤作用。CDKN2B肿瘤缺乏症CDKN2B优先删除，例如家族性黑色素瘤、胶质瘤和某些血液系统恶性肿瘤。2,12,44,45。第二，我们的数据显示CDKN2BCDK 4/CDK 6和烯醇化酶-1是连接细胞周期和糖酵解的重要分子。因此，缺乏CDKN2B不仅通过释放对肿瘤细胞的限制，促进肿瘤细胞的增殖。CDKN2B在G1到S的进展过程中，它还创造了一个在肿瘤诱导的低氧过程中代谢有利的环境，在这种环境下，肿瘤细胞需要更多的糖酵解，才能产生代谢中间体，用于细胞的生物合成，如氨基酸、脂类和核酸。46。通过编译基因表达数据(代谢基因快速可视化器)Http://merav.wi.mit.edu/)包括8名正常膀胱组和9名来自人类患者的膀胱肿瘤组(Https://www.cbioportal.org/我们发现，与正常对照组相比，烯醇化酶-1在所有肿瘤队列中都有明显的过表达，而与肿瘤分级无关(补充图)。8)。这些数据与两个早期基于微阵列的基因表达队列一致，这些基因表达组具有肿瘤分期的信息，表明在Ta-T1无肌侵袭性膀胱肿瘤和T2-T4肌浸润性肿瘤中，烯醇化酶-1明显高于正常膀胱标本(补充图1)。9)47,48。值得注意的是，在肌肉侵袭性肿瘤中，烯醇化酶-1通常是唯一高表达的烯醇化酶亚型，而不是烯醇化酶-2和烯醇化酶-3(补充图3).9)。这与正常情况下烯醇化酶-2和烯醇化酶-3主要在神经元和肌肉细胞中的表达相一致，可能不是正常尿路上皮细胞代谢的主要烯醇酶。烯醇化酶-1在不存在的情况下的特异性上调和非竞争性活性CDKN2B膀胱肿瘤细胞应开辟治疗抑制的途径。考虑到这样的可能性，即使当CDKN2B烯醇化酶-1为野生型，可竞争性地抑制其与CDK 4和CDK 6的结合。8和9)，阻断烯醇化酶-1可能会释放CDKN2B并恢复其作为细胞周期抑制剂的活性。通过将糖酵解转化为氧化磷酸化来重新规划葡萄糖在膀胱肿瘤细胞中的应用可能有助于阻止低氧诱导的肿瘤细胞增殖，降低低级别浅表性膀胱肿瘤的生长和/或防止其复发。通过导尿管将化学剂直接注入膀胱的可行性应有助于获得尽可能高的局部浓度，并可降低系统毒性。49。最后，我们的数据应该对膀胱癌和一般癌症有意义，因为9p21.3是与冠心病患者密切相关的最突出的易感位点。21,50,51患有2型糖尿病22,23。而这些序列变体，即用于冠心病的rs 10757278-G和针对2型糖尿病的rs 10811661-T，则位于CDNK2B，它们已被证明影响ANRIL的活动，而ANRIL又可能被下调。CDNK2B表达52。我们目前研究的数据CDKN2B作为细胞周期和糖酵解的双重抑制剂，在功能水平上建立疾病联系应开辟新的途径，并阐明9p21.3异常导致冠心病、2型糖尿病和青光眼的细胞机制。