正常的组织结构决定了癌症的进化过程

肿瘤的生长可以被描述为原发组织更新过程的一个漫画，在这个过程中，组织结构对肿瘤内部的进化动力学有很大的影响。使用一个经典的、经过深入研究的肿瘤进化模型(乘客驱动突变模型)，我们系统地改变了空间约束和细胞混合率，以显示组织结构如何影响功能(驱动)突变和遗传异质性随时间的推移。这一方法探索了患者间和瘤内肿瘤异质性背后的一个关键机制：对空间的竞争。时间变化的竞争导致了从达尔文的癌前生长到随后的侵袭性中性肿瘤生长的紧急转变。初始的空间约束决定了进化的新模式(达尔文到中性)，而不改变细胞特异性的突变率或适应度效应。达尔文癌前阶段的驾驶员习得过程中，可能通过空间约束和有限的细胞混合两种因素的结合，在向中性进化的过程中进行调制。这两个因素自然发生在导管癌中，导管网络的分支拓扑决定了空间约束和混合速率。

癌症被认为是起源组织更新过程的漫画：起源于(并由)能够持续生长的小亚群体所引起的。1。这种组织结构的强烈影响已在结肠癌中得到了令人信服的证明，在这种癌症中，由于干细胞维持的腺体分裂而生长的腺瘤，受到癌症祖细胞中异常细胞迁移的早期表达的影响。2,3。所谓的“天生就坏”的肿瘤起源于已经具备恶性肿瘤所必需的驱动突变的祖细胞。4,5和转移6。这些肿瘤随后以中性的方式进化，从而使肿瘤内异质性最大化，增加了治疗抗药性的可能性。

数以万计的体细胞改变的异质集合可分为驱动因素(赋予肿瘤细胞有利的癌变表型)和乘客(中性的、近乎中性的或轻微的有害突变)。高度有害的突变会被负选择，并被从人群中移除，而中度有害的突变可以逃避净化选择，在选择压力下继续存在于进化中的肿瘤中，这一过程被称为“搭便车”。7,8.

肿瘤内遗传异质性(ITH)和亚克隆结构是肿瘤生长演化动力学的直接结果。多区域测序已经证明达尔文进化论至少形成了ITH的一部分。9,10。在某些情况下，亚克隆适应度显著提高：结肠癌21%，胃癌29%，转移53%。11.

已经提出了几种进化模型来描述从癌前到侵袭性肿瘤生长的转变。12。例如，一些研究表明，导管原位癌(DCIS)肿瘤的细胞系与浸润性导管癌(IDC)肿瘤不同。13,14。这就产生了一个“独立的谱系模型”，它认为在原位和侵入性种群中分别有不同的起始细胞。15。相反，其他人则提出了一个“进化瓶颈”模型，其中多个克隆在导管内进化，克服了空间限制、营养限制和免疫攻击等障碍。16。能够克服这些障碍的亲代克隆是从早期达尔文进化论产生的亚克隆中产生的。这一进化瓶颈确立了侵袭性亲本克隆中的关键驱动突变，即在肿瘤生长的中性阶段测量到的普遍存在的突变。17,18。Casasent等人挑战这两种进化模式，使用单细胞dna测序来测量单个肿瘤细胞的拷贝数剖面，同时保留同步dcis-idc患者的空间信息。19,20。这些数据表明，多个亚克隆在原位阶段在导管中进化，随后又迁移到周围的组织，表明导管内外的异质性有高度的重叠。

组织结构是如何影响体细胞进化的？一些人推测进化论模式(达尔文进化论到中性)可能是肿瘤细胞结构的结果(例如结直肠癌的腺状结构或导管癌的导管结构可以限制选择的效果)，或恶性肿瘤的解剖位置，控制资源的获取，或对生长的强烈空间限制。5,11,21。有些结构是自然选择的“放大器”，增加了有利突变体的几率。22,23(例如，控制斑块间迁移速度的胰管)24和空间分离的结肠腺体和一个集中的干细胞池3)。明确的组织结构开始分解，因为癌症向不断增加的侵袭性过渡，通常伴随着突然出现的、“点缀”的拷贝数的变化，这是促进对基质的侵袭所必需的。25,26。我们的观点是，这种从达尔文到中性进化的转变很大程度上受到组织结构的影响，而这种组织结构是起源克隆的地方，在肿瘤进展的早期(在入侵之前)，向中立的转变可能会发生。

空间结构、扩散、迁移和组织更替的影响是种群生态学和种群遗传学研究的热点。空间结构允许具有差异适应度的种群间出现共存。27即使生与死在空间上是解耦的28。自更新组织中的层次组织结构限制了体细胞突变的积累。29。细胞分化“清除”有害的突变，而层次结构限制了维持组织所需的整体细胞更替，从而限制了发生新突变的机会。30。等位基因固定的概率与位置密切相关：靠近中心位置的等位基因，高周转率区域更有可能固定。31。巴顿等人表明由大区域引起的克隆扫描速度减慢也会减少基因组区域的大小，而基因组区域的多样性因扫描而受到抑制。32。分散在空间隔离生境或“斑块”之间的作用也得到了很好的研究，通常在弱选择下使用多路径集合种群模型。33。迁移势可以放大异质种群的入侵概率。34，当分散网络更有结构时，这种效果就会增加。23.

当许多数学乘客驱动的肿瘤演化模型使用分支过程时，35或者是随机的，混合的(非空间的)，基于代理的模型。21,36,37,38,39一些人研究了空间竞争对局部异质性和循环性肿瘤细胞的作用。40，对治疗的抵抗力41、转移6,27，以及移徙与扩散之间的权衡。42。这里介绍的模型是先前公布的乘客和肿瘤演化中驱动因素的非空间模型的空间显式扩展。7,36,37.

在本工作中，我们将这些关于结构、扩散、迁移和更替的重要性推广到一个更现实的环境：乳腺导管网络空间结构的三维分支拓扑，再现了导管原位癌癌前病变(DCIS)中的肿瘤内异质性。在这种情况下，另外两种完全相同的肿瘤可能会因组织结构的限制而在适应度上产生巨大的差异。这就引出了以下几点见解：周围的空间语境调节“已实现的肿瘤适应度”，即驱动突变与突变负担比率的变化率。

肿瘤的进化是在一个二维或三维网格上进行的，每个网格点最多可以包含一个细胞。每个细胞携带可遗传的遗传变化，分为驱动突变(例如，KRAS中的激活突变)或乘客突变。单元以单个驱动程序突变开始每个模拟，其中每个随后的驱动程序以一个健身优势参数的因子增加出生率(即乘性上位性)，sd。同样的，乘客突变会降低出生率，sp。在图中。1我们量化司机和乘客的异质性。在多个多样性度量指标中，中立和有害乘客的结果显示在补充信息中(参见补充图1-4)。Tp/d是司机/乘客的突变目标大小吗？36的有效突变率。μp/d = μTp/d。我们首先对图中的基本数学模型(具有不同的空间域大小和混合速率)有一个系统和广义的理解。1和2.

结构域大小对功能和遗传异质性的影响

肿瘤被限制到较小的区域大小(如图所示)。1，顶部；视频五1)显示出的司机和乘客的多样性一直低于更大的领域大小。小的、紧密耦合的同质细胞群能够迅速清除每一个连续的驱动突变.较大的区域由一个异质的种群组成；随着更多的细胞分裂，产生另一个驱动突变的几率增加，但它们几乎没有机会横扫大域。而异质性测度的差异(图1)。1A，b)对于不同的畴尺寸，它们会迅速发散，直到极端时间尺度才能接近稳态。总之，小的区域大小使得克隆扫描和低多样性成为可能。这个直观的模型结果在几种不同的多样性度量中是一致的(补充图)。4，对于中性的、几乎中性的或不存在的乘客突变(补充图)。4，栏)。

为了控制这种进化的军备竞赛中的种群规模效应，相同的域被分离成不同大小的非相互作用区域(图1)。1，底部；视频五2)。同样，较小(高度约束)区域更加均匀。任何克隆扫描都会停止在每个区域的边界上，从而导致局部同质区域的异质种群(如图所示)。1h)。边界限制了新克隆扩展到单一区域之外，减少了人口中的平均驱动数(图一)。1i)。

有限度扩散的功能和遗传异质性

有界的、不相互作用的区域在人类癌前病变中起作用，这些病变通常局限于单个腺体或导管。这种腺或导管结构允许有限的细胞混合在癌前生长，使肿瘤能够探索新的(往往是较少限制)环境。在图中。2，每个分离区域现在可以以较低或高的混合速率(分别为左列和右柱)将细胞循环到邻近区域。该模型模拟了癌前乳腺病变的结构，其中大部分可能起源于导管末梢小叶单位(TDLU)，这些小叶单位通过一系列的小叶外导管连接在一起。43。与生态模型中常见的空间分离斑块(或生境)相似，乳腺小叶的结构为分离(即小叶)提供了一些有限的分散(通过导管网络)。

为了说明这种分离扩散结构是如何加速进化的，我们在两个轴上绘制了肿瘤进化图：遗传(突变负担；x轴)和表型(驱动突变的平均数量)，({{k}}_{d})(y轴)未分离肿瘤的演化以黑色显示(图1)。2C，e)，随着时间的推移，遗传多样性(从左到右)积累，驱动因素积累缓慢(从下到上)。这个状态空间图可以让我们跟踪癌症前人群的加速获取，与肿瘤的大小有关。

随着时间的推移，肿瘤演化的轨迹量化了区域大小和混合的肿瘤规模效应。尽管种子模拟具有相同的参数化，肿瘤可能以中性或达尔文模式演化(或两者之间的连续尺度，如图所示)。2(B)受区域大小和细胞混合所施加的选择的限制。“中性”肿瘤以与所有突变的比率相等的速度获得驱动因素(图1)。2C，e；蓝色箭头)。相反，“达尔文”肿瘤在种群中扫过每一个新的驱动基因突变，导致垂直轨迹(图1)。2绿色箭头)。中立和达尔文演化之间存在一个连续体，它是随时间变化的，并且受到空间约束和细胞混合程度的调节。未分离的肿瘤追踪到一个略高于中性进化线的轨迹(如图所示)。2C；黑色)，但分离肿瘤有限分散追踪更多的垂直轨迹(图一)。2蓝色，红色，绿色)。

在这里，我们提出了一个时间依赖肿瘤演化的分类，作为它的“实现达尔文适应度”，在突变驱动状态空间上的时变角度(见图1)。2b)。肿瘤可以实现更高的健康水平(图一)。2(C)具有高度的空间约束和有限的混合，尽管亚克隆适应度没有变化，但能够快速获取驱动程序。

达尔文的这种观点代表了肿瘤中立的范式转变。以往的工作往往侧重于通过变异等位基因频率分布指标(例如1/f幂律分布)推断细胞特异性适应度(即亚克隆选择)。5,44,45。或者，我们认为有一个健身量表应该考虑：肿瘤规模。周围的空间语境调节“已实现的肿瘤适应度”。空间约束加速进化，而不改变细胞特异性适应度.

肿瘤多样性可以在Muller图上显示出来。46，显示每个克隆的丰度随时间的推移，颜色驱动程序的突变(图一)。2视频五3)。低混合率的肿瘤(如图所示)。2)倾向于以达尔文进化论的方式进化：克隆扫描，它保持了较低的遗传多样性。越来越小的区域允许新的司机更容易地在本地区域内横扫(如图所示)。2c)。引入分隔区域增加了空间限制，使肿瘤实现了更高的选择水平(如图所示)。2，左列)，即使没有改变细胞的特定适应度。重要的是，当区域间的混合过高时，这种加速的进化模式就失去了(见图)。2e)。高混合率(右列)概括了相对不受约束的肿瘤的进化轨迹，降低了肿瘤实现的适应度。

空间上下文调节DCIS实现的肿瘤适应度

正如引言中提到的，Casasent等人的开创性研究。对10例同步DCIS-idc患者进行单细胞dna测序，在保留空间信息的同时量化瘤内异质性。20。同步患者提供了一个优势，比比较DCIS和经常被收集多年的复发IDC样本。他们的发现，转载于图中。3A-f显示导管区肿瘤内存在高度异质性，主要克隆也存在于浸润区。这些数据为DCIS中的多克隆侵袭模型提供了证据，在DCIS中，一个或多个克隆逃离导管并迁移到邻近的组织中，维持了大量的异质性(IDC异质性在这里没有显示)。本节主要介绍组织结构在导管癌异质性形成中所起的作用。

DCIS启动后，乳腺导管和腺体网络结构的分支拓扑作为进化促进剂，其空间分离区域(导管分支)与细胞混合(受不同分支拓扑的影响)共同作用，加速肿瘤的进化。另一个先前发表的明确模拟导管结构的数学模型表明肿瘤的推进速度与导管半径成反比，但没有考虑扩散和迁移到邻近导管的关键作用。47.

在这里，数学模型被扩展到一个三维区域，并被约束生长在一个用拟人化乳房模型的数据重建的导管网络中。48。模型是参数化的(见图)。3(参见“方法”)，对驱动程序的突变率范围执行10,000次随机模拟(μd ∈[10−7)和健康(sd ∈[10−3，10)。DCIS的模拟演化被初始化，并被约束在一个连续连接的越来越小的分支的三维拓扑中生长，如图所示。4A(另见录像五)4和V5、补充图。5和6)。参考文献中所有多克隆DCIS肿瘤克隆异质性的测定。20并与数学模型的多样性结果(Eqn)进行了比较。(3))。各DCIS肿瘤异质性的参数化范围如图所示。3参数化遵循驾驶员适应度与变异率之间的线性关系(在对数尺度上；其特征是最适合Eqn)。(4))。随着a-f中异质性的增加，这种最佳拟合的斜率(m)也增加了g-l(见附图。7).

在图中。4，对两个病人参数化模型进行了模拟：Low(DC13；图1)。3A，g)和高(dc 16；图1)。3F，l)异质性，受不同初始空间条件的影响。如图所示。4B，高异质性DC18(虚线)开始于初始陡峭的达尔文斜率，达到较高的平均驾驶员数，尽管具有较高的突变负担。相反，低异质性患者DC13的特点是低斜率和低突变负担。

有一些证据表明，乳腺癌前病变通常起源于小叶区相关的细胞更替率最高，尤其是终末导管小叶单位(即在图顶部)。4a)43。虽然不太常见，但我们也模拟了起源于导管网络根部的肿瘤(即图中底部的肿瘤)。4(A)展示空间限制在肿瘤演化中的重要作用。肿瘤起源于网络根部附近较大的导管分支(z=25%，蓝色，图1。4(B)首先减少空间限制，增加进入新分支机构的机会。这些肿瘤更中立地进化(如图所示，从左到右的轨迹)。4b)。肿瘤起源于导管根部较小、限制性较强的分支(如紫色曲线)，其特征是早期进行克隆扫描(垂直轨迹)。后来，肿瘤扩展到新的未被探索的区域，向中性轨迹转移。起源于受严格约束的导管的肿瘤能在肿瘤进展的早期加速获得驱动因素(10)4细胞)，这可能是一个更危险，高度同质的恶性细胞群体，所有这些细胞都获得了新的特征，如侵袭性、运动性或转移能力。当考虑非空间模型的相同参数化时，这些重要的结论就会丢失(图1)。4B，黄色)，无约束二维模型(橙色)，或无约束三维模型(紫色).

中性进化以前是用肿瘤中相对于反向等位基因频率(1/f幂律分布)的累积突变数的分布来量化的。5。我们模拟了两位患者的测序(随时间的推移)，并量化了1/f幂律分布的线性度(如图所示)。4(e，f)和重复分析，在空间约束下，10个拟人乳腺体模导管网络重建，如图所示。4虽然所有的肿瘤(不管空间限制)最初都被定量地显示为非中性的(如图所示)。4E，f)，它们最终都会发展到一个中立或几乎中性的进化模式(中立的最小阈值为0.98)。5以黑色显示)。使用此指标，初始高空间约束(绿条)向中性演化的过渡要比缺乏空间约束(蓝色)慢得多，特别是对于患者DC16(图1)。4f)。因此，当肿瘤生长受到更大的空间限制时，它由较小的种群组成，从而使更适合的克隆的亚克隆扩展更容易(见补充图)。8和9；视频五6).

重要的是，另外两种完全相同的肿瘤可能会因组织结构的限制而在适应度上产生巨大的差异。在细胞规模上，任何特定的亚克隆都可能确实具有选择性优势(即更高的出生率)。然而，这种亚克隆优势的有效结果取决于该细胞周围的竞争环境。换句话说，细胞特异性的表型行为可以被组织结构“覆盖”，从而使肿瘤实现更高的适应度。这种亚克隆选择在细胞规模可能低于可检测的阈值，使用传统的度量，从批量测序方法选择(即1/f；图1；图1)。4E，f)。我们的方法增加了中立肿瘤进化辩论的清晰度，它探索了患者间和瘤内肿瘤异质性背后的一个关键机制：除了追踪时间变化外，还包括对空间的竞争。

无花果之间有明显的差异。1和2。获得最高水平的司机，kd，在图中的大域中发现。1(见第一小组)。相反，最大kd在小域的集合中发现，在图中有低混合。2(见C小组)。这说明了考虑时间的作用的重要性(图1)。1)，以及肿瘤大小的作用(如图所示)。2)在研究进化论时。例如，大域(参见图1)。2F，h，j)在相同的时间内累积更多的驱动因素，但肿瘤大小相同的比较(图1)。2F，h，j；垂直虚线)扭转这一结果。增加每个细胞的进化(或者简单地说，增加驱动程序的获取)的机制如下：空间限制使较小的肿瘤维持较长的时间，这有助于更容易地进行克隆扫描。

显然，在肿瘤进化模型中，空间竞争是不可忽视的。这些结果(在图中总结)。5)通过阐明空间在达尔文向中性演化过渡中的作用，有助于统一围绕中性肿瘤演化的争论。空间竞争和细胞混合对癌症演化的影响1和2)广泛适用于一系列癌前病变，包括这里所示的DCIS的特殊案例研究。

初始的空间约束决定了进化的新模式(中立到达尔文)，而不需要改变细胞特异性的突变率或适应度效应。肿瘤发生时导管网络的分支拓扑决定了两种重要的进化促进剂：空间约束和细胞混合。这种连接性很可能是病人之间的高度异质性，导致肿瘤内不同空间位置间细胞混合率的变化。虽然所有肿瘤都趋向中性，但空间限制允许肿瘤在非中性模式下逗留更长时间，每个细胞获得更多的驱动因素。由于空间约束，有限的连通性使亚克隆能够经历高水平的局部选择。我们的已实现适应度指标强调，在推断进化模式时，需要同时考虑空间和时间。这些结果表明，我们在解释非空间演化尺度时必须谨慎。