Shrna库筛选识别fbw 7稳定性的翻译后调节剂。
为了鉴定fbw 7蛋白稳定性的调节因子，我们采用了先前发表的实验策略。18。我们构建了一个双顺反子结构，表达DsRed荧光蛋白，然后是一个内部核糖体进入位点(IRES)，FBW 7α开放阅读框在N-端与EGFP融合。DsRed蛋白作为内部控制的EGFP-FBW7α蛋白稳定性，以响应遗传或药物干扰(DsRed-IRES-EGFP-FBW7α；图1)。1A)。我们构建了一株稳定的HEK293TDsRed-IRES-EGFP-FBW7α报告细胞系。GFP和FBW 7α特异性蛋白印迹抗体均能检测到EGFP-FBW7α(补充图)。1A)。此外，EGFP-FBW7α与内源性E3-环连接酶复合物伙伴CUL1和Skp 1(补充图1)相互作用。1B)，表明融合蛋白保留了与SCF-复杂蛋白伙伴相互作用的能力.我们使用EGFP-FBW7α/DsRed比值作为FBW 7蛋白稳定性的读数。蛋白酶体抑制剂(MG 132)处理使EGFP-FBW 7α稳定，使EGFP-FBW 7α/DsRed比值增加(附图)。1C，d)。相反，一种蛋白翻译抑制剂环己酰亚胺，导致EGFP-FBW7α/DsRed比值下降(补充图1)。1E).
图1：shRNA库屏幕识别FBW 7稳定性的翻译后调节剂.aDsRed-IRES-EGFP-FBW7α载体的原理图及稳定的HEK293T细胞株的建立。b聚合shRNA文库的原理图EGFP-FBW7α稳定性筛选。c富集位点的路径分析显示“蛋白酶体”和“Ubiquitin介导的蛋白水解”是屏幕上的顶级富集基因集。统计数据是由Fisher‘s精确地做的。t-测试和调整，以便进行多次比较。d热图显示来自泛素-蛋白酶体途径的每个基因的平均logr富集值。e的选定命中的westernblot验证d在HEK293T细胞中。数字代表标志-FBW7波段的量化，标准化为GFP加载控制，并显示为折叠变化。实验至少重复了三次，结果相似。f流式细胞仪检测FBW 7蛋白稳定性的两种阳性和两种负调节因子EGFP-FBW 7/DsRed比值，n=3项独立实验。另见附图。1。源数据作为源数据文件提供。
我们将DsRed-IRES-EGFP-FBW 7α报告细胞导入到一个shRNA文库中，该文库针对的是大约5500个可药基因，其中每个基因至少被27,500个shRNA池中的5个shRNA所靶向(见图)。1B)。根据低和高EGFP-FBW7α/DsRed比值，将转导细胞分为两个不同的群体(附图)。1C)。经过深度测序和DNA条形码反褶积分析确定的丰富的命中是泛素-蛋白酶体途径中最常见的基因(如图所示)。1C)。耗竭CSN 5，COP 9信号小体脱巢复合体的一个关键亚基，它使Cullin环连接酶失活，并耗尽Fbw 7其本身导致了EGFP-FBW7α蛋白水平的最大下降(图一)。1D)。相反，蛋白酶体的成分包括PSMA和PSMB家族和SCF的组成部分Fbw 7以及诸如CUL1, RBX 1，NEDD8，和UBE2M2，作为FBW 7稳定性的负调节剂得到了高度富集(图1)。1D和补充图。1F)。此外，我们还鉴定了一个Hect结构域E3连接酶TRIP 12，作为FBW 7稳定性的负调节因子。1D)。通过Westernblot和FACS分析，我们证实了包括TRIP 12在内的筛选文库对FBW 7抗原表位标记的α稳定性的影响。1E，f).
TRIP 12负调控FBW 7蛋白稳定性
击倒TRIP 12增加内源性FBW 7α蛋白的含量。2A)不受影响Fbw 7MRNA水平(图1.2B)，暗示TRIP 12以翻译后方式调节FBW 7蛋白。TRIP 12耗竭只稳定FBW 7α亚型，而不稳定β或γ亚型(附图)。2A)。CRISPR/Cas9-调解TRIP 12缺失也稳定了异位表达的标志-FBW 7蛋白(图1)。2C)，鉴于TRIP 12内源性mRNA过表达TRIP 12使用CRISPR/Cas9引导的协同激活介质的轨迹(TRIP 12(SAM)降低FBW 7α蛋白(图1)。2D，e)。因此，TRIP 12是FBW 7蛋白水平的限速调节因子.
图2：TRIP 12负调控FBW 7蛋白的稳定性。aTRIP 12作为内源性FBW 7负调节因子对转染两个独立siRNA靶点的细胞裂解物的Westernblot验证TRIP 12基因与非目标对照相比。bQRT-PCR分析TRIP 12和Fbw 7, n=3项独立实验。条形图表示三个独立实验的平均±SD。c表明FBW 7在CRISPR/Cas9HCT 116池中稳定的蛋白质的Western印迹TRIP 12与野生型亲本细胞相比。以GFP质粒为转染对照，以GFP和肌动蛋白印迹作为转染对照。d针对内源性的CRISPR/Cas9SAM sgRNAs的原理图TRIP 12轨迹。eWesternblot验证TRIP 12表达EGFP-FBW 7α的HEK293T细胞中FBW 7的SAM激活和负调控。f稳定表达慢病毒介导的gfp靶向调控细胞株FBW 7的蛋白稳定性绿色荧光蛋白)对shTRIP 12在两个独立实验中，fbw 7蛋白水平的定量显示为肌动蛋白。g. hΔFbox突变体和泛素化野生型FBW 7在稳定表达shRNA的HEK293T细胞中的ni-nTA下拉作用。除非另有说明，所有面板中的西方墨迹至少代表三个独立实验。源数据作为源数据文件提供。
环己酰亚胺的追踪实验表明，TRIP 12耗竭增加了标记蛋白和内源性FBW 7蛋白的稳定性。2f、g和补充图。2B)。相反，TRIP 12基因敲除不影响fbw 7 F盒缺失突变体(Δfbox)的蛋白质稳定性，该突变体是fbw 7突变体，不能由fbw 7自动修饰。Fbw 7因为它缺乏与Cullin环连接酶复合物相互作用所需的临界F盒结构域(如图所示)。2f、g)。提示TRIP 12介导的Fbw 7负调控需要SCF。Fbw 7-介导的自体泛素化。一直以来，FBW 7的泛素化明显减少，但没有被废除。TRIP 12-蛋白酶体抑制剂(MG 132)处理的敲除细胞，而FBW 7ΔFbox突变体大部分未修饰(图1)。2H)。相反，我们发现泛素化的FBW 7在TRIP 12-在没有MG 132的情况下击倒细胞(附图)。2C)。这些结果表明，在不存在TRIP 12的情况下，FBW 7可以有效地自动降解，但可能不能被蛋白酶体有效降解。
TRIP 12通过MCL 1和FBW 7调节化疗耐药
我们接下来研究的是TRIP 12SCF耗竭Fbw 7底物。MCL 1和CyclinE蛋白水平下降。3A)与相应的mRNA没有减少(补充图。3A)，而c-MYC水平在很大程度上没有受到影响(图中所示)。3A和补充图。3A).
图3：TRIP 12通过MCL 1和FBW 7调节化疗耐药。aWesternblots显示用对照siRNA或两个独立siRNAs处理的HEK293T细胞中所指示的FBW 7底物的水平。TRIP 12. bCRISPR/Cas9SAM靶向细胞TRIP 12和MCL 1的WesternblotsTRIP 12SgRNAs或空载体控制。微管蛋白用作装载控制。c对照组和对照组HEK293T细胞MCL 1的WesternblotsTRIP 12SiRNA±MG 132。微管蛋白用作装载控制。d用所述siRNAs对HEK293T细胞中所指示的蛋白进行Westernblot分析。吸干a–d代表至少三个独立的实验。eHCT 116细胞的增殖，以所指示的天数作为判断指标。图显示三个独立实验的平均±SD值。f在100 NM紫杉醇存在或不存在的情况下，用CellTiter-Blue活力法判断所指示基因型的HCT 116细胞的存活率，并显示为与未处理对照组相比的%活力。条形图表示三个独立实验的平均值±SD，**p=0.004和*p = 0.0001. g用CellTiter-Blue法测定100 NM紫杉醇处理大肠癌细胞72h后，细胞存活率为%。条形图表示三个独立实验的平均值±SD，**p=0.01和*p=0.04，N.S.，不显著。P-双尾式二学生计算值t-测试。另见附图。3。源数据作为源数据文件提供。
相反，mcl 1蛋白在TRIP 12-SAM细胞过度表达内源性TRIP 12(无花果)3B)。蛋白酶体抑制剂MG 132可使MCL 1水平恢复。TRIP 12-敲除细胞，表明在不含蛋白质的情况下，蛋白酶体能更有效地降解MCL 1蛋白。TRIP 12(无花果)3C)。抑制Fbw 7SiRNA在HEK293T细胞中的表达，或通过CRISPR/Cas9基因敲除在HCT 116结肠癌细胞中的表达。TRIP 12-沉默和TRIP 12-基因敲除细胞(图1)。三维空间和补充图。3B)。因此，MCL 1被TRIP 12通过FBW 7的负调控而稳定。
癌相关Fbw 7突变通过MCL 1蛋白的积累引起化疗耐药6。基因缺失TRIP 12对HCT 116细胞增殖无影响。3E)但使这些细胞对抗有丝分裂化疗紫杉醇敏感(图1)。3F)。这一效果被伴随的删除完全阻断。Fbw 7在……里面TRIP 12-敲除细胞(图1.3F)。此外，TRIP 12敲除还致敏的HCT 15和HT 29细胞，这是另外两个结直肠癌细胞株，含有野生型。Fbw 7等位基因，对紫杉醇，而SW 837和SNU175细胞，这是一个体细胞缺失。Fbw 7(L 403 Fs)和一个错误的突变((R465C)分别对紫杉醇有很大的抗药性TRIP 12删除(图1.第三代)。因此，TRIP 12通过调节FBW 7来调节紫杉醇的敏感性。
Fbw 7自动泛素化增强与TRIP 12的相互作用
为了了解TRIP 12对FBW 7负调控的机制，我们评估了这些蛋白质的潜在物理相互作用。内源性FBW 7的免疫共沉淀(IP)4A)揭示了与内源性TRIP 12的物理相互作用(图1)。4A，3号线)。有趣的是，内源TRIP 12的IP与一个分子量较大的FBW 7物种有优先结合(图1)。4A，4号线)。为了研究高分子量fbw 7是否代表泛素化形式，我们建立了一个有效催化scf的体外体系。Fbw 7自动酰基化(图1.4B)。与TRIP 12相互作用的内源FBW 7具有相似的分子量迁移。4C)。在体外泛素化反应中，这种高分子量FBW 7的产生依赖于泛素和E1泛素激活酶的存在，并通过与滥交的亚USP 2处理而去除。4C，d)，表明高分子量fbw 7是由泛素化生成的(因此被命名为fbw 7)。(UBI)n)。采用体外自泛基化FBW 7的拉下实验证实了TRIP 12与泛素化FBW 7的强优先结合(图1)。4E，f)。的确，MLN 4294是Cullin环泛素连接酶(CRLS)活性所必需的一种Cullin抑制剂，它能稳定FBW 7蛋白水平，并大大降低但没有废除与TRIP 12(补充图12)结合的FBW 7。4B还有无花果。4G)，确定了FBW 7和TRIP 12相互作用的自动泛素化要求。为了鉴定TRIP 12中潜在的泛素结合域(Ubd)，我们用已知拓扑结构的非锚定的双泛素结合TRIP 12与纯化的全长珠子结合的TRIP 12进行了孵育，并检测了在流通性(FT)中的di-泛素的丢失。如果TRIP 12包含一个连接特异性的ubd，它将与上清中的di-ubquitin结合，并将其从上清中移除，导致di-ubqutin在FT中的丢失。在本实验中，一个6×-胰蛋白酶串联泛素结合实体(Tr-管)有效地结合并去除了K11-和K48连接的双泛素，这是根据西方印迹对FT中特定带的丢失来判断的，而TRIP 12则不显示与游离或连接特异性的di-泛素结合(补充图)。4(c，d)，表明TRIP 12不包含一个UBD识别单键泛素链。
图4：TRIP 12优先与泛素化FBW 7相互作用。a在HEK293T细胞中，确认内源性FBW 7与TRIP 12相互作用，而在HEK293T细胞中，黑星(*)代表一个未知的非特异性带。b实验原理图c和d. c在35S-FBW7α泛素化实验中，所述试剂存在。dUSP 2对35S-FBW7α的体外去泛素化作用。e用MYC-TRIP 12从HEK293T细胞体外翻译35S-FBW7的原理图。f自显影显示MYC-TRIP 12与泛素化FBW 7的相互作用。gWestern印迹显示MYC-FBW7与HCT 116细胞中的标志-TRIP 12在NAE 1抑制剂(MLN 4924)或DMSO作用24h后相互作用。hGFP-TRIP 12缺失突变体的原理图。iWestern印迹显示MYC-FBW7与GFP-TRIP 12，GFP-TRIP 12的相互作用ΔHect、GFP-TRIP 12ΔHect/ΔWWE突变体在HCT 116细胞中，黑星(*)代表一个未知身份的非特异性带。所有的污迹都代表至少三个独立的实验。另见附图。4。源数据作为源数据文件提供。
为了了解TRIP 12-FBW 7相互作用的机理基础，我们产生了TRIP 12缺失突变体，缺乏其Hect结构域或Hect/WWE结构域-两个特征良好的TRIP 12蛋白-蛋白质相互作用域(图1)。4H)。我们发现TRIP 12与FBW 7的相互作用需要它的WWE域(如图所示)。4I)。因此，我们的数据表明TRIP 12与FBW 7弱相互作用，FBW 7的自动泛素化进一步增强了这种相互作用。
Fbw 7赖氨酸404和412是自动修饰的，是TRIP 12相互作用所必需的。
为了更好地描述FBW 7自泛素化对TRIP 12相互作用的贡献，我们对体外泛素化FBW 7进行了质谱分析。5A)。这一分析确定了七种FBW 7赖氨酸是自动合成的(图一)。5A和补充图。5A)。为了评价该突变体的相关性，我们制作了多个缺失突变体(ΔF)、二聚体结构域(ΔD)和两个WD 40螺旋桨缺失突变体(ΔWD 40-1和ΔWD 40-2)(图4 0-2)。5B)。FBW 7-ΔWD 40-2突变体缺乏所有WD 40螺旋桨，FBW 7蛋白稳定程度与FBW 7-ΔFbox突变体相似，而ΔWD 40-1突变体仅略大，FBW 7蛋白稳定性与野生型相似(图1)。5C)。Fbw 7-ΔWD 40-2的泛素化效率很低(附图)。5B)尽管与SCF-复合物蛋白Skp 1有有效的相互作用(补充图1)。5C)。值得注意的是，与不稳定突变体FBW 7-ΔWD 40-1不同，FBW 7-ΔWD 40-2缺乏经质谱鉴定的两个赖氨酸残基(K 404和K 412)。5A，b和补充图。5A)。K 404和K 412联合变异为精氨酸，但不是单独作用，强烈稳定FBW 7(图7)。5D，e)。与蛋白质稳定相一致，FBW7-K404/412 R的泛素化程度降低(如图所示)。5F)和减少与TRIP 12的交互作用(图1)。5G)。TRIP 12-FBW7-K404/412 R相互作用的减少很可能不是由于其他赖氨酸残基在FBW 7上的泛素化，因为MLN 4924阻断了Cullin环连接酶的活性和FBW 7的自动泛素化，也减少了FBW 7与TRIP 12的相互作用，但没有消除它(图1)。4G)。为了进一步证实这一点，我们将TRIP 12与野生型FBW 7、ΔFbox和ΔWD 40-2分别进行了共沉淀，这两种突变体均不能进行自动失活(补充图)。5B)。实际上，TRIP 12与ΔFbox和ΔWD 40-2突变体的相互作用比野生型FBW 7(补充图7)弱。5D)。因此，赖氨酸K 404和K 412是FBW 7自动泛素化所必需的，促进TRIP 12相互作用，并促进FBW 7蛋白酶体的降解。
图5：Fbw 7，lysine 404和412是自动修饰的，是TRIP 12相互作用所必需的。a体外GST-FBW7泛素化和质谱(MS)工作原理图。这幅漫画显示了被识别的泛素化赖氨酸(K)在FBW 7上的位置。b从实验中鉴定的FBW 7缺失突变体显示泛素化位点的原理图a. cMYC-FBW7缺失突变体的Westernblots。以GFP作为转染对照。d在HEK293T细胞中过度表达FBW 7野生型、单突变和双突变蛋白的Westernblots。eWesternblots显示了100μg/ml环己酮处理HEK293T细胞中所指示的标志-FBW 7蛋白在规定时间内的稳定性。以gfp质粒作为转染对照，然后用gfp和actin印迹作为载体。c–e. fHEK293T细胞泛素化标志FBW 7野生型和K 404/K 412突变体的WesternblotsgWesternblots显示标志-FBW 7野生型和K 404/412突变体在HCT 116细胞中与GFP-TRIP 12相互作用。所有的污迹都代表至少三个独立的实验。另见附图。5。源数据作为源数据文件提供。
TRIP 12介导的K11连接泛素化是FBW 7蛋白酶体降解的关键
其次，为了了解TRIP 12在FBW 7调控中的作用，我们分析了FBW 7在无细胞蛋白提取物中的体外降解作用(图1)。6A)。35s标记的fbw 7以蛋白酶体依赖的方式降解TRIP 12-野性提取物(图1.6B)。在蛋白酶体抑制剂MG 132存在的情况下，fbw 7的大部分以高分子量fbw 7的形式积累。(UBI)n(无花果)6B)。与之形成鲜明对比的是TRIP 12-敲除提取物，大部分FBW 7积累为FBW 7。(UBI)n在没有蛋白酶体抑制剂治疗的情况下(如图所示)。6B)，表明FBW 7是泛素化的，但在不存在TRIP 12因此，FBW 7蛋白体的降解需要TRIP 12。
图6：TRIP 12介导的K11连接泛素化是FBW 7蛋白酶体降解所必需的。a体外降解试验原理图。b体外35S-FBW7α降解实验对所述基因型的细胞进行无细胞提取，并进行放射自显影观察。c体外FBW 7降解实验在无细胞提取物中进行，在所示的泛素突变体存在下，用放射自显影法观察。d35S-FBW7体外泛素化及泛素酶消化实验原理图。e自显影显示被指示的二聚体切割珠子结合的多泛素化35S-FBW7。括号中给出了连锁特性。黑星(*)b, c，和e表示未知身份的非特定带。f实验上清液中泛素的银染色e，黑星代表各自的配音和红星标签未解泛素寡聚体。所有的污迹都代表至少三个独立的实验，除了e，用相似的结果进行了两次。源数据作为源数据文件提供。
为了检验TRIP 12是否通过泛素化介导FBW 7的降解，我们首先确定了参与FBW 7蛋白酶体降解的泛素链/s的类型。为此，我们在不同的泛素突变体存在下，用放射自显影技术在无细胞提取物中监测了35S-FBW7的体外降解情况。正如预期的那样，在野生型泛素的存在下，FBW 7被一个不能与底物结合的泛素突变体部分阻断(R74；图7)。6C)。令人惊讶的是，在K11R泛素突变体的存在下，自交基化的FBW 7以高分子量的形式积累起来(如图所示)。6C)，表明有效降解FBW 7蛋白需要K11泛素连锁。出人意料的是，K48连锁对于FBW 7的自动泛素化并不是必需的，因为在K48R泛素突变体FBW 7的存在下，FBW 7仍然被有效降解，K63R泛素突变体也是如此。6C)。为了更好地理解泛素链的组成，我们进行了泛素酶切酶消化(Ubi-Crest)和银染色的解理泛素共轭物(图)。6d)。USP 2去除了高分子量的fbw 7。(UBI)n带和生成的只有自由的单一泛素结构，而K11特异性的配音塞尚或OTUD 3(K6-和K11-特异性)没有影响(图一)。6E，f)。引人注目的是，OTUB 1(K48特异性)和AMSH(K63特异性)都能切割FBW 7。(UBI)n，但经常生成泛素低聚物产品(用红星表示)，表明fbw 7自动泛素化会产生混合连接的泛素链。多泛素化FBW 7纯化的Ubi-Crest实验TRIP 12-基因敲除细胞显示，在体内，自交基化的FBW 7主要由K48和K63链组成(补充图)。6一个,b)。这表明SCFFbw 7-自交基化FBW 7由K48和K63连接的泛素结合物组成。
TRIP 12和UBE2S催化FBW 7的支化泛素化
最近的报道提示K11特异性E2酶UBE2S和hect-结构域E3泛素连接酶在底物蛋白上构建支化K11/K48多聚泛素链以促进蛋白酶体降解的作用。17。为了了解UBE2S是否是FBW 7蛋白K11连锁所需的E2，UBE2S有两个独立的siRNAs(补充图)。7A). UBE2S敲除稳定的FBW 7蛋白(图1.7A，提示UBE2S可能参与FBW 7泛素化(图1)。7A)。接下来，我们研究了TRIP 12是否能直接泛素化FBW 7，以及TRIP 12是否是催化FBW 7上K11连接的多泛素链的酶。7b)。在体外，FBW 7不涉及K11连接的多聚泛素结合物(图1)。7C，如先前Ubi-Crest分析所建议的那样(图2)。6E，f)。引人注目的是，TRIP 12与UBE2S一起催化自泛素化FBW 7上的K11连接泛素结合物，但TRIP 12/UBE2S没有泛素化而未修饰的FBW 7(图7)。7C，分别为第3和第4条)。一个K11特异性的DUB(Cezanne)与TRIP 12(图12)对FBW 7泛素化有拮抗作用。7b，d)和K11连接的FBW 7多泛素化降低到背景水平TRIP 12-敲除细胞(图1.7E)。因此，TRIP 12催化将K11连接的泛素链加成在以前自动化的FBW 7上。
图7：TRIP 12和UBE2S催化FBW 7的支化泛素化。aWesternblots显示HEK293T细胞与对照和两个针对K11连锁特异性E2酶的独立siRNAs共同孵育的标志-FBW 7蛋白水平，UBE2S. b序贯体外泛素化试验及塞尚介导的K11-连锁断裂的原理图。泛素化步骤1：SCFFbw 7+UBCH 5+wt-ubi；步骤2：TRIP 12+UBE2S+K48R-ubi。cWesternblots显示FBW 7在体外泛素化和K11-连接加成TRIP 12。dTRIP 12与K11特异性去泛素酶Cezanne在FBW 7上的K11连接的确认。eWesternblots显示K11连接的多泛素化FBW 7在HEK293T细胞中富集。f概述了检测支化泛素化的方法。gWesternblots证实TRIP 12-Hect结构域在体外具有分支活性，黑星(*)代表一个未知的非特异性条带。hFBW 7体外分支泛素化实验原理图。iFbw 7-利用Ubi53TEV/标志突变体在TRIP 12上进行泛素化，然后用标志-M2-HRP抗体对TEV进行切割和印迹。jFBW 7蛋白酶体降解的潜在调控机制概述。另见附图。5。所有的污迹都代表至少三个独立的实验。源数据作为源数据文件提供。
为了确定trp 12在泛素化的fbw 7上是否有k11连接，以促进其蛋白酶体的降解，我们使用了一种先前建立的方法。19，利用一个带有内部烟草蚀刻病毒(Tev)蛋白酶切割位点的泛素突变体和一个内部标志表位。未分支的UbiTEV/标志结合物的TeV蛋白酶切割产生一条单泛素带，而支化泛素化则产生较高的分子量带(图1)。7F)。首先，我们确认了SCF是否Fbw 7可利用UbiTEV/LACK突变体进行体外自动泛素化。SCFFbw 7使用Ubi53TEV/旗子突变体有效地自动修饰FBW 7，正如预期的那样，TEV蛋白酶处理导致FBW 7蛋白的高分子量多泛素化物种的减少(附图)。7b，c)。在使用无底物E2酶(UBCH 5)的无底物反应中，TRIP 12-Hect结构域健壮地分枝了游离泛素(图1)。7g)。重要的是，在一个连续的泛素化反应中，由TRIP 12/UBE2S(图1所示)连接自泛素化FBW 7上的多泛素链。7h，i)。因此，我们的数据表明，TRIP 12介导的自泛素化FBW 7的K11连接分支泛素化促进了其蛋白酶体的降解(图1)。7J).
