细胞因子与共刺激信号整合mTORC 1/mTORC2对MAIT细胞效应极化的差异控制

黏膜相关不变T(MAIT)细胞在机体对病原体和疾病的免疫应答中具有重要作用，但其调控MAIT细胞发育和效应系分化的机制尚不清楚。本文报道IL-2/IL-15受体β链和诱导共刺激因子不仅是MAIT 1和IL-17A产生MAIT 17细胞的谱系特异性标记物，而且对其分化也有重要意义。IL-2和IL-15均能诱导mTOR激活、T-bet上调及随后的MAIT细胞(尤其是MAIT 1细胞)的增殖.相比之下，IL-1β诱导MAIT 17细胞的数量比MAIT 1细胞多，而IL-23单独促进MAIT 17细胞增殖和存活，但与IL-1β协同诱导MAIT 17细胞强增殖，呈mTOR依赖性。此外，mTOR对于MAIT细胞的早期发育是可有可无的，但对MAIT细胞的效应分化至关重要。因此，mTORC2整合了来自ICOS和IL-1βR/IL-23R的信号，对MAIT 17的分化起着至关重要的作用，而IL-2/IL-15R-mTORC-T-bet轴则保证MAIT 1的分化。

MAIT细胞是先天的T细胞，具有有限的TCR储备.虽然在小鼠中非常罕见，但MAIT细胞是人类中最丰富的先天性T细胞，占依赖于不同器官的T细胞的1-30%。它们不仅含有丰富的粘膜组织，而且还存在于其他淋巴和非淋巴器官中，这表明这些细胞在免疫反应、组织内稳态和疾病中发挥着广泛的作用。1,2,3,4,5。大多数MAIT细胞在小鼠中表达不变体tcrvα19-Jα33(IVα19)tcr，在人类中表达不变量tcrvα7.2-Jα33 tcr，尽管其他tcrα链也可用于人和小鼠mait细胞。6,7,8,9。这些不变的tcrα链与有限的tcrβ链配对，这些链主要是小鼠的Vβ6和Vβ8，以及人的Vβ2和Vβ15。6,9,10,11,12。MAIT细胞仅限于mhc-i相关分子mr 1，而不限于胸腺细胞上表达的经典mhc分子。13,14,15。MR1显示微生物衍生核黄素(VitB 2)代谢物、几种药物或药物衍生物，尚未被识别为内源性配体，而不是针对MAIT细胞的多肽。13,14,16,17,18,19。来自IVα19 tcr的信号在mr 1缺乏的小鼠中表达，表明ivα19 tcr转基因小鼠的mait细胞的生成增强。8,14,20,21，以及由共菌衍生的5-(2-oxopropylideneamino)-6-d-ribitylaminouracil(5-op-Ru)对诱导MAIT前体和成熟的MAIT细胞增殖的重要性。2223,24,25,2627,28。然而，对IVα19 TCR下游的其他信号通路和其他调控MAIT细胞发育的共刺激和细胞因子信号的了解甚少。

直到最近研制出带有核黄素衍生的5-op-ru配体的MR1四聚体，才有可能检测小鼠的MAIT细胞。11。MAIT细胞是从CD4在胸腺中产生的。+CD8+前体。它们的成熟经历了三个有序阶段：CD 24。+CD 44−第一阶段，CD 24−CD 44−第2阶段和CD 24−CD 44+第三阶段29。与传统的αβT(cαβT)细胞不同，MAIT细胞与iNKT细胞相似，在胸腺中分化为多种效应系，如产生干扰素的MAIT 1和IL-17A产生的MAIT 17细胞。11,29,30。转录因子PLZF和SATB 1、miR-181 a/b-1、DROSHA(微RNA加工机械的成员)和适配器分子SAP对MAIT细胞的功能成熟和分化为效应系至关重要。28,29,30,31。MAIT细胞经刺激后，可迅速产生多种细胞因子和趋化因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-17、GM-CSF、IL-10、TGF-β、CCL 3、CCl 4、CXCL 16等，可调节机体的天然免疫和适应性免疫以及组织修复。部分MAIT细胞表达颗粒酶B并显示细胞毒活性12,32,33,34,35。MAIT细胞参与对病原体和组织修复的免疫反应，异常的MAIT细胞与许多疾病有关，如感染、癌症、糖尿病、系统性红斑狼疮和多发性硬化症。15,25,35,36,37,38,39,40,41,42,43。目前，控制MAIT细胞发育和效应系分化的机制尚不清楚。

MTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞代谢、增殖、生长、自噬和分化等多种过程中发挥重要作用。它通过两个复合物(mTORC 1和mTORC 2)发出信号，它们分别包含必需的适配器分子Raptor和Rictor。44。在TCR、共刺激分子(如icos)和多种细胞因子受体的作用下，T细胞中的mTOR被激活。45,46,47,48。DAG介导的RASGRP 1-Ras-ERK 1/2和pkcθ-carma 1通路对tcr下游的mTOR激活非常重要，而tcr下游受dgkα/ζ负控制。45,46。Mtor及其通过tsc1和dgkα/ζ的紧密调控，确保了iNKT细胞的产生、效应细胞的命运决定、抗肿瘤免疫以及常规αβT细胞的发育和功能的许多方面。47,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60。TCR和IL-12+IL-18刺激可激活人MAIT细胞中的mTORC 1，促进糖酵解和IFN-γ的产生。61。然而，mTOR 1和mTORC 2及其上游受体和下游通路在MAIT细胞发育和效应系分化中的重要性尚不清楚。

在本报告中，我们发现CD 122(IL-2/IL-15Rβ)在MAIT 1细胞中有选择性表达，通过转导IL-2和IL-15的信号，从而促进MAIT 1细胞的增殖和存活，从而促进MAIT 1细胞的增殖和存活，从而对MAIT 1细胞的分化起关键作用。相反，ICOS在MAIT 17细胞中高水平表达。IL-1β、IL-23和ICOS信号通过mTORC2促进MAIT效应细胞，特别是MAIT 17细胞的分化和增殖。我们的数据提供了MAIT效应分化的新机制，并提出了选择性操纵MAIT 1/17细胞系的策略。

IL-2/IL-15Rβ和icOS作为MAIT 1和MAIT 17细胞的系特异性标记及T-bet对MAIT 1而非MAIT 17分化的关键作用

小鼠胸腺MAIT细胞的频率很低。我们用5-OP-RU负载的MR1-四聚体(MR1-Tet)与PE或APC或磁珠结合，结合排除其他细胞系，检测胸腺MAIT细胞，并进一步确定了基于CD 24和CD 44表达的MAIT细胞发育阶段。1A)。共刺激分子icos和IL-2/IL-15受体β链(IL-2/IL-15Rβ，CD 122)均在MAIT细胞中表达。26,29,30。然而，它们与MAIT细胞效应器系的关系和功能尚未明确。与.相比较ICOS−/−小鼠，我们发现在CD4中没有检测到icos。+CD8+双阳性胸腺细胞(Dp)，但在tcrβ中检测到低水平的胸腺细胞。+胸腺细胞(附图)1A)。ICOS在MAIT细胞的所有三个发育阶段均可检测到，分别在第1和第3期表达最低和最高(图1和图3)。1B)。有趣的是，CD 24−CD 44+第3期MAIT细胞含有CD 122+ICOS低层和CD 122−ICOS+胸腺中的亚群(图1.1C)和外周器官(附图)。1B)。如下文补充图所示。5E，f，CD 122仅在CD 122上表达。+ICOS低层子集但不在CD 122上−ICOS+MAIT细胞的子集或第1期和第2期MAIT细胞。转录因子T-bet和rorγt标记MAIT 1和MAIT 1729。第1期和第2期MAIT细胞不表达这两种分子，但第3期MAIT细胞中含有优势T-bet。−RORγt+n=6)和一个小的T-押注+RORγt−子集(7.142±1.381%)n=6)(图6。1C+ICOS低层和CD 122−ICOS+MAIT细胞主要为T-bet+RORγt−和T-打赌−RORγt+同时存在于胸腺和外周器官中(见图)。1D，e，补充图。1C)和主要产生干扰素-γ或IL-17A后，PMA和离子霉素刺激(图)。1F)，从而分别代表MAIT 1和MAIT 17细胞。采用多重酶联免疫吸附法，我们也检测了干扰素-γ，而不是白细胞介素-17a产生的肝分类CD 122。+ICOS低层经PMA和离体霉素刺激后的MAIT 1细胞。相反，CD 122−ICOS+MAIT 17细胞产生IL-17A(附图)。1D)。虽然在CD 122中检测到了干扰素-γ。−ICOS+细胞上清液，其浓度远低于CD 122。+ICOS−这可能是MAIT 1细胞污染的结果。有趣的是，这两个群体产生了相似水平的IL-2和TNF-α.Legoux等人胸腺MAIT细胞单细胞RNA测序(ScRNAseq)数据分析。30，其中包含了比其他报告更多的序列MAIT细胞。15,28，显示13个MAIT细胞簇(簇0-12，图1)。1g，补充图。2)。第7组和第10组表示Cd24a但低水平的CD 44, ICOS, RORC(编码RORγt)，以及Tbx 21(编码T-bet)，可能代表第1阶段MAIT细胞.组群4和(可能的话，3)两者都很低。Cd24a和CD 44可能代表第2期MAIT细胞。第5组和第8组表示Tbx 21, IL2Rb，和IFNG但低水平的RORC和ICOS可能代表MAIT 1细胞。其余的组群表达了不同但更高的级别。RORC和ICOS可能代表MAIT 17细胞(补充图)。2ICOS和RORC，以及(编码cmaf)，罗拉河，和FOS在0，1，2，6，9，11和12簇中可以观察到细胞的表达。1g，补充图。3)。有趣的，高高速公路俊B和俊德在一些但不是所有这些簇中都有发现，这表明MAIT 17细胞内存在异质性。28,30。其中一些集群表示IL17A, IL17f, ，和IL4mRNA相反，Txb 21和IL2Rb表达细胞主要限于ICOS–RORC–第5组和第8组也表示IFNGMRNA(图1.1g，补充图。3)。令人吃惊的是，Tgfb 1在MAIT 1和MAIT 17优势簇的MAIT细胞中，至少在mRNA水平上，细胞因子的表达最为频繁。细胞内染色进一步证实了cMAF、BATF和IRF 4蛋白在MAIT 17细胞中的表达增加。氢)。MAIT 1细胞表达的IRF 4和BATF蛋白水平与常规αβT细胞相似，但cMAF蛋白表达略有增加。然而，所有这些蛋白在MAIT 17细胞中都被上调(见图)。氢).

MAIT 17细胞在胸腺、周围淋巴结(PLNs)和肺组织中以MAIT 1细胞为主。然而，小鼠脾脏和肝脏中MAIT 1细胞百分比显著增加，分别占成年小鼠MAIT细胞总数的32%和45%。1I)。这些观察表明，CD 122和ICOS可以作为MAIT 1和MAIT 17的代孕标记。

重要的是CD 122+ICOS低层MAIT 1细胞依赖于T-bet，因为T细胞特异性T-bet缺乏时，胸腺、脾脏和肝脏中MAIT 1细胞明显减少。Tbx 21F/f-Cd4Cre，T-betKO)老鼠。相反，CD 122−ICOS+和RORγt+T-打赌−MAIT 17细胞百分率明显增加，1~3期胸腺MAIT细胞数无明显改变(图1)。1J，k，补充图。4)。这些观察进一步证实了CD 122作为MAIT 1细胞的标记物，并揭示了T-bet对MAIT 1细胞发育的重要但选择性的作用。MAIT 17细胞的显著增加提示MAIT 1和MAIT 17是MAIT细胞效应系分化过程中的竞争命运。

DAG是一个重要的第二信使，它将近端tcr信号传递到下游通路。59。我们最近发现，DGKα/ζ下调DAG介导的信号转导和对DAG的严格控制对MAIT细胞的成熟具有重要意义。WT DGKζ的过表达德克兹威汤哥)或功能增益突变体dgkζ(德克兹ΔNLS)在发育中，胸腺细胞对MAIT细胞的成熟有中度或严重的抑制作用。27,62ΔNLSMAIT 1细胞百分比增加，MAIT 17细胞百分比下降，ICOS表达无明显影响(附图)。1E-g)，提示MAIT 17细胞对DAG介导信号的下调比MAIT 1细胞更敏感。

IL-2和IL-15信号优先促进MAIT 1的分化

IL-15对人MAIT细胞IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B和CD 69的上调作用35,63。IL-2/IL-15Rβ在T-bet上的表达+MAIT 1细胞促使我们研究IL-15信号在小鼠MAIT细胞中的作用。体外用IL-15/IL-15RαFC复合物处理WT脾细胞诱导MAIT细胞增殖。)，主要原因是CD 122的增加。+MAIT细胞及CD 122增强后的弱抑制作用−MAIT细胞(图1.2B)。这与增殖增加有关(图一)。2C)和改善存活率(图1。二维空间)。此外，IL-15处理后，MAIT 1细胞的T-bet水平明显升高(如图1所示)。2E2F)。在MAIT细胞内CD 122+ICOS低层MAIT 1细胞百分比和数量均增加；CD 122−ICOS+IL-15处理后小鼠MAIT 17细胞百分率下降，但数量无明显改变(图1)。2G，h)。因此，IL-15R信号通过诱导MAIT 1细胞增殖和促进其存活，选择性地诱导MAIT 1细胞的体外和体内扩增。

由于IL-2/IL-15Rβ也参与了IL-2信号，而IL-2在MAIT细胞中的作用尚不清楚，因此我们进一步研究了IL-2信号在MAIT细胞中的作用。在体外，IL-2诱导MAIT 1而非MAIT 17细胞增殖(图1)。2I)通过提高它们的生存能力(如图所示。2J)和增殖(图1.2K)。在体内，IL-2/抗IL-2抗体复合物，触发强信号。64，也有选择性地诱导MAIT 1而不是MAIT 17的扩张，导致MAIT 1相对富集，但MAIT 17细胞表达不足(图1)。2m，n)。此外，IL-2刺激提高了MAIT 1细胞的T-bet水平(如图1所示)。2L在体内未明显影响MAIT 17细胞的ROR、γ、t或ICOS水平(图1)。氧)。因此，与IL-15类似，IL-2信号优先诱导MAIT 1细胞的增殖和T-bet在这些细胞中的表达上调。我们进一步研究了这两种细胞因子是否对MAIT 1细胞有协同作用。单从小鼠体内注射IL-15/IL-15 RαFC复合物后，小鼠MAIT细胞的增殖率略高于IL-2/抗IL-2抗体。然而，这两种细胞因子在诱导MAIT 1细胞增殖或T-bet上调方面表现出极小的协同作用(附图)。5A，b).

为了进一步确定MAIT细胞对IL-2/IL-15R信号的需求，我们对其进行了检测。IL2/15 rbF/f-Cd2ICre(IL-2/IL-15 RβKO)和控制IL2/15 rbF/f 或IL2/15 rb+/+Cd2iCre老鼠。Cd2iCre能诱导αβT、γδT和B细胞中LoxP位点的重组。IL-2/IL-15 RβKO小鼠脾、肺、肝中MAIT细胞百分率降低，胸腺无明显改变(图1)。3A，补充图。5C)；它们在包括胸腺在内的所有这些器官中的数量都减少了(如图所示)。3B)。在IL-2/IL-15 RβKO胸腺MAIT细胞中，仅3期MAIT细胞数量减少，第1期和第2期MAIT细胞数无明显变化(图2)。3C)。胸腺MAIT细胞总数的减少与胸腺细胞总数的减少有关，因为IL-2/IL-15Rβ缺乏症会导致调节性T细胞受损引起的严重自身免疫性疾病。65。在剩余的MAIT细胞中，T-bet的百分比+MAIT 1细胞严重下降，而ROR、γ、t的百分率则显著降低。+IL-2/IL-15RβKO小鼠除脾MAIT 17细胞减少外，MAIT 17细胞无明显改变(图1)。3D，e，补充图。5D)。然而，这两个T-打赌+MAIT 1和RORγt+MAIT 17细胞数量由于小鼠MAIT细胞总数的严重减少而减少(见图)。3F)。由于MAIT细胞是由dp胸腺细胞上表达的MR1阳性选择的，因此我们进一步生成和检测了用CD 45.1混合液重组的辐射嵌合小鼠。+WT和CD 45.2+ IL2/15 rbF/f-Cd2ICre骨髓细胞。在混合BM嵌合小鼠中，平均CD 45.2+IL-2/IL-15RβKO至CD45.1+CD4比值+CD8+DP胸腺细胞为0.76。MAIT细胞在胸腺、脾脏和肝脏中的比值分别为0.64、0.28和0.16。第三代)，提示IL-2/IL-15 RβKO衍生MAIT细胞在脾脏和肝脏中的表达减少，而在胸腺中则没有。此外，CD 45.2+IL-2/IL-15RβKO MAIT细胞T-BET含量显著降低+MAIT 1但增加的RORγt+ICOS+MAIT 17细胞与CD 45.1细胞的比较+WT-MAIT细胞在单个受体小鼠中的表达(图1)。3H表明IL-2/IL-15Rβ对MAIT 1细胞的分化有内在的促进作用。这些数据也表明MAIT 17细胞在IL2/15 rbF/f-Cd2ICre如图所示的老鼠。3E，f很可能是由外在因素引起的。

综上所述，这些观察揭示了IL-15和IL-2信号在MAIT 1发育和/或稳态中的关键和选择性作用。然而，IL-2R和IL-15R信号可能微弱地促进MAIT 17的分化/维持的可能性并没有被排除。

ICOS在MAIT 17分化中的内在作用

最近的一份报告发现，细菌诱导的肺mit细胞在icos缺乏的小鼠中表达受损。26。然而，ICOS在MAIT细胞发育中的作用未见报道。为了确定icos是否在mait细胞的发育中起作用，我们检查了ICOS−/−老鼠。ICOS缺乏症直接导致胸腺MAIT细胞的百分率和数量减少约70%(图1)。4A，b)或MR1-Tet浓缩后(如图所示)。4C，d4E)。事实上，第1和第2阶段的MAIT细胞相对富集在ICOS−/−MAIT细胞(附图)6a，b)。与MAIT细胞发育受损相关，脾脏、PLN、肺和肝脏MAIT细胞百分比和数量也减少了44%至65%(图1)。4F).

在……里面ICOS−/−胸腺，RORγt+MAIT 17细胞在百分比和数量上均下降(图1)。4G，h4I)。尽管T-打赌+MAIT细胞百分比相对增加，其数量无明显变化。因此，ICOS缺乏导致MAIT 17发育/维持的选择性损伤，而不明显影响MAIT细胞的早期发育或MAIT 1的分化。

由于ICOSKO小鼠的生殖细胞缺乏，我们通过注射CD 45.1混合液产生了辐射嵌合小鼠，并对其进行了分析。+CD45.2+WT和CD 45.1−CD45.2+ICOSKO BM细胞比例为1：1/CD45.1+CD45.2−TCRJα18−/−缺乏iNKT和MAIT细胞的小鼠66。重建8周后，我们检测到wt和icosko衍生CD4的比值接近50：50。+CD8+DP和CD4+CD8−或CD4−CD8+SP胸腺细胞(图1.4J)，表明WT和ICOSKO造血干细胞对受体小鼠的贡献相同。在胸腺MAIT细胞中，WT和ICOSKO细胞在第1和第2期均有表达，而ICOSKO MAIT细胞在第3期明显偏低，占这些细胞的四分之一(图1)。4J，补充图。6C)。在第3期MAIT细胞中，CD 122+人口比例接近1：1，但CD 122−人口(主要是ICOS)+在WT小鼠中)明显减少(如图所示)。4K)。此外，ICOSKO MAIT细胞在嵌合小鼠外周器官中也有不同程度的低表达(图一)。4L)。因此，ICOS缺乏症在本质上损害了MAIT 17，而不是早期MAIT或MAIT 1的发育。

这些数据表明，ICOS本质上促进MAIT 17细胞的分化/维持。

缺乏mTOR的严重MAIT细胞缺陷

IL-2/IL-15信号和ICOS共刺激信号对MAIT 1和MAIT 17细胞的不同作用促使我们进一步探索ICOS和IL-2R/IL-15R信号在MAIT细胞效应系分化中的下游途径。我们发现IL-2和IL-15/IL-15 RαFC均能诱导MAIT细胞S6和Akt S473磷酸化，mTORC 1和mTORC2激活指标，以及PI3K激活指标Akt T 308。此外，IL-15或IL-2处理的MAIT细胞中猛禽和Rictor的水平均有上调或弱上调的趋势(图二)。5A)。此外，雷帕霉素还能抑制IL-2或IL-15/IL-15RαFC诱导的MAIT细胞增殖。5B)，提示mTOR在MAIT细胞中发挥了IL-2R和IL-15R下游的作用。据报道，ICOS和TCR信号都能诱导T细胞中mTOR的激活。45,47。抗激动剂诱导CD 122细胞mTORC 1和mTORC 2激活对ICOS的刺激作用+MAIT 1和CD 122−主要是MAIT 17细胞。5C)。然而，在此体外环境下，PI3K的激活仅在CD 122中发生。−MAIT 17细胞细胞因子和共刺激信号共同能诱导MAIT细胞mTORC 1和mTORC 2的激活以及PI3K的激活。

为了确定mTOR在MAIT细胞中的作用，我们分析了MTORF/f-Cd4Cre(MTORKO)小鼠。MAIT细胞在胸腺(图5D-g)和其他外周器官(图5D-g)中明显减少。5H，补充图。7)。TCRVα19-Jα33重组MTORF/f-Cd4CreDP胸腺细胞没有减少。5I)，提示这种发育缺陷并非由MAIT特异性TCR的重组受损所致。在胸腺mTORKO MAIT细胞中，第1期和第2期MAIT细胞百分比增加，但数量与对照组相似，而第3期MAIT细胞几乎不存在。5J，k表明mTOR对MAIT细胞的早期发育是可有可无的，但对MAIT细胞第3阶段的功能成熟起着关键的作用。

PLZF在MAIT细胞功能成熟中的表达295LMTOR缺失的MAIT细胞功能成熟缺陷并不是PLZF表达降低所致。照射骨髓嵌合小鼠(CD 45.1)+CD45.2+)用CD45.1的混合物重组+WT和CD 45.2+MTORKO骨髓细胞mTORKO与WT细胞的平均比值在DN胸腺细胞中约为0.86：1，对DP胸腺细胞的平均比值为0.40：1(提示mTOR对DP胸腺细胞的发育/扩张起一定的作用)。第1期和第2期MAIT细胞的比值分别为0.30和0.45：1，接近DP胸腺细胞的比例。然而，未检测到第3期mTORKO MAIT细胞。五米).

这些观察表明，mTOR在MAIT细胞向第3阶段的发育过程中起着内在和关键的作用，以获得效应功能，但对于MAIT细胞的发育，mTOR的这种功能并不是通过控制PLZF的表达来实现的。据报道，mTORC 1能促进iNKT细胞的PLZF核定位。52MTOR缺陷小鼠中MAIT细胞数量极低，使我们无法明确判断mTOR缺陷MAIT细胞是否改变了PLZF的核定位。

MTORC 1对MAIT细胞尤其是MAIT 1细胞发育的关键作用

MTOR信号通过mTORC 1和mTORC 2。为了进一步阐明这些复合物在MAIT细胞中的作用，我们分析了T细胞特异性猛禽缺陷(MTORC1KO)，猛禽F/f-Cd4Cre)老鼠。MTORC1KO小鼠的表型与mTORKO小鼠相似，但略低于mTORKO小鼠。他们的MAIT细胞百分比和胸腺中的数量都有严重的下降(如图所示)。)和外周器官。6E，补充图。86f，g胸腺第1期和第2期正常数目，但第3期MAIT细胞急剧减少(图2)。6f，g)。因此，mTORC 1不是MAIT细胞早期发育所必需的，而是MAIT细胞功能成熟的关键。在其余3期mTORC1KO MAIT细胞中，CD 122+T-打赌+MAIT 1细胞几乎无法检测到，其百分比下降了93.8%，数量减少了99.7%(图1)。6h，我)。然而，ICOS+RORγt+MAIT 17细胞百分数虽有所减少，但未降低甚至增加。在剩余的MAIT 17细胞中，ROR、γ、t和IRF 4水平与WT对照组无明显差异(图1)。6J)。由于mTORC1KO小鼠中几乎没有MAIT 1细胞，我们观察了雷帕霉素对IL-2和IL-15诱导的WT MAIT 1细胞T-bet上调的影响，发现雷帕霉素对IL-2和IL-15处理后的T-bet上调有明显的抑制作用(图1)。6K)。因此，mTORC 1对MAIT 1细胞的发育起着比MAIT 17细胞更重要的作用，尽管它对MAIT 17细胞的积累起着重要的作用。PLZF在MTORC1KO胸腺的第1、3期MAIT细胞和第2期MAIT细胞中的水平基本相同(图2)。6L)，提示MAIT细胞效应分化受损并不是PLZF蛋白表达降低的原因。MTORC1KO第2期MAIT细胞PLZF水平的升高可能是由于发育阻滞至第3期，导致该蛋白在细胞内的积累所致。这些观察表明，mTORC 1对第3期MAIT细胞的增殖有很大的贡献，MAIT 1系比MAIT 17系更严格地依赖于mTORC 1。

MTORC 2信号在MAIT 17细胞发育中的关键作用

为了评估mTORC2在MAIT细胞发育中的作用，我们研究了里克特F/f-Cd4Cre(MTORC2KO)和对照小鼠。在mTORC2KO小鼠中，MAIT细胞在胸腺中的百分比和数量都显著减少(图1)。7a，b)和外周器官。7C，补充图。9a，b)，指示mTORC2在MAIT小区开发和/或维护中的关键作用。在CD 45.1中+CD45.2+用相同数量的CD 45.1重组受照小鼠+WT和CD 45.2+ 里克特F/f-Cd4Cre骨髓细胞里克特F/f-Cd4Cre衍生CD 24+MAIT细胞减少CD 24−与DP胸腺细胞相比，MAIT细胞明显减少。7D)，表明mTORC 2是MAIT细胞，尤其是晚期MAIT细胞发育所必需的。剩余的MAIT细胞里克特F/f-Cd4Cre胸腺1、2期相对增多，3期MAIT细胞减少。由于mTORC2KO胸腺中MAIT细胞总数的严重减少，其第1、2、3期MAIT细胞数分别减少了49.2%、57.6%和95.8%。7E，f)。这些数据与图中所示的数据是一致的。7DMTORC 2缺乏分别在MAIT细胞发育的早期和后期引起弱发育缺陷和强发育缺陷。因此，mTORC2在MAIT细胞的早期发育中起着微弱的作用，而对MAIT细胞的成熟/稳态则起着关键的作用。由于mTOR缺陷小鼠未表现出明显的早期MAIT细胞发育缺陷，mTORC 1活性或mTORC 1活性在mTORC 2缺失时的存在可能与mTORC2KO小鼠1、2期MAIT细胞的部分发育缺陷有关。

MTORC2KO胸腺第3期MAIT细胞CD 122含量增加+T-打赌+MAIT 1细胞但ICOS急剧下降+RORγt+MAIT 17细胞7g-i随着IFN-γ的增加，产生IL-17A的MAIT细胞减少(如图所示)。7J)。由于MAIT细胞总数严重减少，CD 122的总数+和T-打赌+MAIT 1细胞实际上分别下降了52.0%和87.6%。7H，i)。MAIT 1细胞的减少幅度与第1/2期MAIT细胞的减少一致或部分一致，远小于MAIT 17细胞99.8%的下降幅度。在mTORC2KOMAIT 1细胞中，T-bet和CD 122水平与WT对照组相似(图1)。7K，l)，提示mTORC2不直接控制T-bet或CD 122的表达。MTORC2KOMAIT 17细胞表达类似的RORγt和IRF 4，提示mTORC 2可能不直接促进这些转录因子的表达以促进MAIT 17的分化。而mTORC2KOMAIT 17细胞则明显降低cMAF水平。7K，l)。由于cMAF对Th17、γδT17和iNKT 17的谱系分化起着至关重要的作用。67,68,69，mTORC2可能促进cMAF的表达，指导MAIT 17的分化。MTORC 2共同参与MAIT细胞的早期发育和MAIT 1的发育/维持，但可能通过促进cMAF的表达而对MAIT 17细胞的分化/维持起关键作用。

在mTORC2KO MAIT细胞中，PLZF的表达在第1期没有改变，在第2期增加，在第3期下降。7米)。PLZF在第2期表达增加，提示PLZF表达不需要mTORC2。第3期mTORC2KO MAIT细胞PLZF表达的下降可能是由于MAIT 17细胞的严重减少所致，MAIT 17细胞是表达PLZF水平高于MAIT 1细胞的优势群体。剩余的几个mTORC2KO RORγt+第3期MAIT细胞，PLZF水平实际上高于WT对照组(图1)。7米)，提示mTORC2可能通过促进PLZF表达而促进MAIT 17的发育。有趣的是，ICOS在第2期和第3期MAIT细胞中的表达都降低了。7NMTORC2参与了MAIT细胞ICOS表达的上调，从而促进MAIT 17的分化。另据报道，icos诱导cmaf表达促进Th17的分化和IL-17的产生。69。MTORC2MAIT细胞ICOS表达降低也可能导致cMAF表达减少，并导致MAIT 17分化。

IL-1β和IL-23通过mTOR诱导MAIT细胞增殖

虽然ICOS和mTORC 2都能促进MAIT 17的分化，但mTORC 2缺乏导致的MAIT 17缺陷比ICOS缺陷小鼠严重得多，提示mTOR可能通过整合附加信号来促进MAIT 17的分化。据报道，IL-1β和IL-23通过mTOR促进Th17的分化。70。有趣的是，IL-1β和IL-23对WT脾细胞的刺激诱导了相当数量的MAIT细胞增殖。8a，b8C)和增殖(图1.8D)。这种处理还可诱导MAIT细胞的mTORC 1和mTORC 2激活(图6和Akt S 473磷酸化)。8E)。此外，IL-1β或IL-23单独能促进MAIT细胞的增殖和存活(图1)。8F-h)。IL-1β对MAIT细胞的增殖作用强于IL-23，这主要是由于其增殖能力较强所致。8g这两种细胞因子相互协同，促进MAIT细胞的增殖。重要的是，IL-1β和IL-23对MAIT细胞增殖的影响依赖于mTOR，雷帕霉素对此有严重的抑制作用。8F，g).

为了进一步确定IL-1β和IL-23是否在体内调节MAIT细胞，我们分别于第1天和第2天将IL-1β和IL-23分别或同时注射到WT小鼠体内，第4天观察IL-1β和IL-23对小鼠肺和肝脏MAIT细胞增殖的影响。8I，j)，与增殖增强相关(图1)。8K)。这种作用在同时注射IL-1β和IL-23的小鼠中要强得多.与体外观察相一致的是，与雷帕霉素共注射时，IL-1β和IL-23诱导的MAIT细胞增殖受到明显抑制。8L)。因此，IL-1β和IL-2 3对MAIT细胞增殖的促进作用弱于自身，但联合用药对MAIT细胞增殖的促进作用较强，且这种作用依赖于mTOR的活性。

IL-1β和IL-23在体内外对MAIT效应株的影响

在体外，IL-23、IL-1β或IL-23+IL-1β处理可使rorγt的相对比率降低。−T-打赌+MAIT 1细胞相反，RORγt+T-打赌−MAIT 17的比值仅在IL-23治疗后才升高，而IL-1β或IL-1β加IL-23治疗后无明显变化(见图)。9a，b)。IL-23本身对MAIT 1细胞数无明显影响，但能弱诱导MAIT 17细胞增殖。相反，IL-1β能诱导MAIT 1和MAIT 17细胞的增殖，这种作用对MAIT 17细胞的作用强于MAIT 1细胞(图1)。9C)。有趣的是，一个T-打赌+RORγt+IL-1β或IL-1β+IL-23可诱导MAIT细胞增殖，而IL-23单独诱导则无明显影响(图1)。9A-c)。IL-1β而不是IL-23也能提高MAIT 17细胞的RORγt水平。9d)。因此，在这些体外实验中，IL-1β促进MAIT 1，更强烈地促进MAIT 17细胞和T-bet。+RORγt+细胞扩张。IL-23有选择性地促进MAIT 17的增殖，并能在MAIT细胞增殖过程中与IL-1β协同作用.

在IL-1β、IL-23或IL-1β+IL-23注射的小鼠肝脏中，T-bet的相对百分率。+RORγt−MAIT 1细胞在IL-1β中轻度下降，在IL-1β+IL-23小鼠中最为严重。然而，他们的人数并没有明显改变(图)。9E，f)。T-bet百分比−RORγt+MAIT 17细胞没有增加，但其数量在IL-1β+IL-23处理的小鼠中呈上升趋势，但没有统计学意义(p=0.093)。有意思，Tbet+RORγt+在未治疗的小鼠中非常罕见的MAIT细胞在注射IL-1β、IL-23或更显着地同时注射IL-1β和IL-23的小鼠中所占的百分比和数量都显著增加(如图1所示)。9E，f)。IL-1β和IL-23共注射小鼠肺内MAIT细胞的数量也显著增加(图1)。9g)。这些T-打赌+RORγt+MAIT细胞表达与T-bet相似的低水平CD 122和同样高水平的ICOS。−RORγt+MAIT 17细胞与T-bet不同+RORγt−MAIT 1细胞9H)，建议这些T-打赌+RORγt+细胞最有可能来源于T-bet−RORγt+MAIT 17细胞此外，在体外刺激分类CD 24之后−CD 44+ICOS−CD 122+MAIT 1和CD 24−CD 44+ICOS+CD 122−具有IL-1β和IL-23的MAIT 17细胞+CD 122−MAIT 17细胞而非ICOS−CD 122+MAIT 1细胞增殖(图1)。9I(左面板)和ICOS的一部分+CD 122−MAIT 17细胞而非ICOS−CD 122+MAIT 1细胞转化为T-bet+RORγt+细胞(图1.9I右面板)。这些数据表明MAIT 17而非MAIT 1细胞在体外对IL-1β和IL-23进行了体外扩增反应，而T-bet则不起作用。+RORγt+MAIT细胞来源于ICOS+CD 122−RORγt+MAIT 17细胞

我们进一步发现，WT-MAIT细胞表达IL-1受体IL-1R1，第1期低水平，第3期中等水平。第2期MAIT细胞似乎含有表达IL-1R1中或高水平的群体(见图1)。，顶板)。此外，MAIT 1和MAIT 17细胞表达的IL-1R1水平相似(图1)。、底部面板)。因此，MAIT细胞在发育过程中具有感知促炎细胞因子以mTOR依赖的方式扩张的能力。IL-1β在体内诱导MAIT 1细胞增殖的能力，但在体外不具有诱导作用，提示MAIT 1细胞对该细胞因子的应答可能与其他因素有关。

我们的数据表明，ICOS和CD 122(IL-2/IL-15Rβ)在MAIT细胞中具有发育调节作用，可用于MAIT 1和MAIT 17细胞的鉴定。ICOS被认为在活化的T细胞中被诱导表达。以ICOS缺陷小鼠为对照，我们发现ICOS在DP胸腺细胞中不表达，而在胸腺和外周器官的cαβT细胞中呈低水平表达。ICOS在第1期MAIT细胞中也有较低水平的表达，但随着成熟细胞的成熟，ICOS的表达逐渐上调。与ICOS不同，CD 122仅在胸腺第3期MAIT细胞中表达。最重要的是，CD 122和icOS可以分别作为MAIT 1和MAIT 17细胞的谱系特异性标记。第三阶段MAIT细胞包含一个占主导地位的ICOS+CD 122−人口也是T-打赌−RORγt+低层CD 122+人口T-bet+RORγt−IFN-γ产生MAIT 1细胞。MAIT 1/17的相对丰度在不同器官间差异显著，其中MAIT 17细胞在胸腺、LNS和肺中占主导地位，MAIT 1细胞在肝脏和脾脏中相对丰富，说明局部环境可能控制了MAIT 1/17在不同器官中的丰度。值得注意的是，最近的两份报告也使用CD 122来鉴定MAIT 1细胞。22。我们的数据不仅与这些报道相一致，而且还揭示了MAIT细胞中这种分子的发育规律，并提供了一种通过包含ICOS表达来明确定义MAIT 1和MAIT 17细胞的方法。

ICOS和CD 122不仅可以作为MAIT 1/17细胞的表面标记，而且在这些效应系中起着不同的作用。ICOS缺乏对1、2期MAIT细胞无明显影响，但可导致3期MAIT细胞大量减少。在第3阶段MAIT细胞中，只有RORγt+产生IL-17的MAIT 17细胞但不产生CD 122+T-打赌+MAIT 1细胞数量严重减少。虽然MAIT 1细胞表达低水平的ICOS，但它们似乎不依赖ICOS来分化或止血。因此，ICOS促进MAIT 17，而不是MAIT 1的分化/维护。在cαβT细胞和iNKT细胞中，icos促进转录因子c maf的表达，诱导mtRC2活化促进Th17和iNKT 17的分化。47,51,54,69。ICOS是否控制cMAF的表达以调节MAIT 17的分化仍有待研究。然而，我们的数据和先前的观察表明，ICOS可能在不同αβT细胞间的IL-17效应系分化/动态平衡中发挥广泛的作用。在我们修改手稿的同时，另一组人也报道了icos在MAIT细胞中的高表达，它促进了体内最优的mait细胞激活。26。因此，ICOS对胸腺MAIT 17的分化和外周器官MAIT细胞的增殖都具有重要意义。

与ICOS缺乏类似，IL-2/IL-15 Rβ缺失不引起1、2期MAIT细胞减少，提示IL-2/IL-15 R信号在MAIT细胞早期发育中不起重要作用，这与该受体在这些MAIT细胞中的表达缺失是一致的。然而，与ICOS不同的是，IL-2和IL-15信号促进MAIT 1的分化/维持，但在MAIT 17细胞分化中所起的作用微乎其微。IL-2和IL-15处理均优先诱导CD 122的发生。+MAIT 1细胞的体内外扩增。IL-2/IL-15Rβ内源性T-BET缺乏症+MAIT 1细胞分化/动态平衡不明显影响RORγt+MAIT 17小区号。与IL-2/IL-15Rβ缺乏相一致，T-bet缺乏小鼠缺乏CD 122+MAIT 1细胞，但几乎有正常数目的MAIT 17细胞。据报道，IL-2/IL-15Rβ和T-bet相互促进，因为IL-15能诱导T-bet表达，而T-bet又能促进iNKT和c-αβT细胞中IL-2/IL-15β的表达。71,72,73。IL-2还能促进T-bet的表达，促进Th1的分化。74。IL-2/IL-15 Rβ或T-bet缺乏时MAIT 1细胞缺失，提示IL-2/IL-15信号与T-bet可能相互促进MAIT 1的分化/稳态。IL-2和IL-15以mTORC 1依赖的方式上调MAIT 1细胞的T-bet水平，进一步支持了这一观点。由于IL-2和IL-15是由不同的细胞产生的，我们的数据表明MAIT 1细胞可能受到传统T细胞和其他先天和/或基质细胞在不同环境下的调节。

不依赖TCR的细胞因子诱导的MAIT细胞活化对于MAIT细胞介导的抗病毒和细菌感染的免疫防御或疾病的发病机制具有重要意义。据报道，IL-18、IL-12和I型干扰素能够诱导MAIT细胞活化。15,75,76,77。IL-12和IL-7也控制MAIT细胞的细胞毒性。78。除了IL-15诱导MAIT 1的扩增外，我们还发现MAIT细胞对IL-1β和IL-23也有反应。IL-23选择性地作用于MAIT 17细胞，促进其存活，并在较小程度上促进其增殖。与IL-1β相比，IL-23是一种诱导MAIT细胞增殖的弱诱导剂，至少在体外条件下是如此。相反，IL-1β比IL-23选择性低，能够促进MAIT 1和MAIT 17的存活和旺盛的增殖。但IL-1β对MAIT 17细胞的影响比MAIT 1细胞强，其诱导的MAIT 17细胞比MAIT 1细胞更有活力。不管这些差异，这两种细胞因子协同促进MAIT细胞体外、尤其是体内的增殖。由于这些细胞因子在感染和炎症过程中被诱导，其受体信号可能在MAIT细胞分化为不同的效应系和这些细胞的稳态过程中发挥重要作用。在这方面，最近有报道说，MAIT细胞在流感病毒感染后迅速扩张，以参与宿主对这种病原体的防御。40军团菌或沙门氏菌多个tlr配体与5-op-Ru联合应用促进MAIT细胞在体内的增殖(依赖于IL-23和IL-23)对MAIT细胞在细菌感染后维持MAIT 17谱至关重要。23,26。此外，缺乏IL-23的小鼠皮肤MAIT细胞减少，而皮肤IL-1受体缺失的MAIT细胞在S上产生的IL-17A减少。。表皮刺激15。这些报告和我们的数据表明，IL-1β和IL-23对MAIT细胞，特别是MAIT 17细胞、稳态和扩张是重要的。我们很有兴趣了解IL-1β、IL-23、IL-15和其他细胞因子是如何被动态调控的，以控制MAIT细胞介导的免疫保护，以及病毒感染和其他炎症条件下的发病机制。

T-打赌+RORγt+在处于稳定状态的小鼠中，几乎无法检测到MAIT细胞。IL-1β和IL-23处理诱导T-bet显著积累+RORγt+体外和体内MAIT细胞。有趣的是，肺军团菌和沙门氏菌感染也导致rorγt的显著扩张。+T-打赌+MAIT细胞23,26。这些观察表明MAIT效应系在炎症环境下具有可塑性。因为这些细胞是ICOS+CD 122−与MAIT 17细胞相似，可从ICOS中诱导。+CD 122−MAIT 17细胞而非ICOS−CD 122+体外培养的MAIT 1细胞在IL-1β和IL-23刺激后，最有可能来源于T-bet。−RORγt+细胞。未来在体内的命运定位研究是需要清楚地说明这些细胞的起源和功能特征。

MTOR具有整合多种环境和细胞内信号的能力。在不存在mTOR的情况下，3期MAIT细胞几乎不存在，但胸腺期1和2期MAIT细胞的发育不受影响，或仅受轻微的影响。因此，mTOR是MAIT细胞功能成熟的关键，而不是早期MAIT细胞生成的关键。有趣的是，PLZF或miR-181 a/b-1缺陷也阻碍了MAIT细胞对效应细胞的功能成熟。29,31，虽然不像mTOR缺乏那么严重。尽管mTOR缺失的mit细胞中plzf蛋白水平没有明显下降，但有报道认为mtrc 1能促进mtf核定位，miR-181-b靶向pten促进mTOR信号转导。52,79。MTOR、PLZF或miR-181-a/b-1缺陷对MAIT细胞功能成熟和交叉调节的类似影响表明，mTOR-181 a/b-1-PTEN-mTOR-PLZF通路可能促进MAIT细胞效应系分化，这值得进一步研究。

我们进一步证明，mTORC 1或mTORC 2的缺乏会导致胸腺和周围器官MAIT细胞的严重减少。在数量上，mTORC 1缺乏症对MAIT细胞的影响似乎比mTORC 2缺乏症更为严重。此外，mTORC 1和mTORC 2在MAIT效应的谱系分化中发挥着不同的作用。MTORC 1缺失导致3期MAIT细胞严重减少，提示mTORC 1对3期MAIT细胞的增殖有重要作用。在mTORC 1缺失小鼠胸腺MAIT细胞中，MAIT 1细胞的相对百分率显著降低，MAIT 17细胞的相对百分率无明显变化，表明mTORC 1对MAIT 1的分化尤为重要。有趣的是，糖尿病患者MAIT细胞中mTORC 1活性降低，并导致其产生γ的功能受损。61。因此，mTORC 1在人和小鼠MAIT细胞中都发挥着重要作用。据报道，mTORC 1促进T-bet磷酸化，调节T细胞代谢，增强Th1反应。80,81。类似的机制也可能参与MAIT 1的分化。鉴于IL-2和IL-15以mTOR依赖的方式诱导MAIT细胞mTORC 1激活和T-bet上调的能力，我们提出了IL-2和IL-15诱导MAIT 1细胞增殖的要求，IL-2/IL-15Rβ，T-bet和mTORC 1对MAIT 1分化的必要性，以及mTORC 1对Th1分化和T-bet磷酸化的重要性，提出了IL-2/IL-15 R-mRC1-T轴在MAIT细胞中促进MAIT 1分化和/或维持的作用。

与mTORC 1缺乏症不同，mTORC 2缺乏症主要抑制MAIT 17的分化。在RictorKO小鼠中，MAIT 17细胞几乎不存在，但MAIT 1细胞的相对百分率却增加了。由于mTORC 2缺乏症也严重影响iNKT 17细胞的发育54，MAIT 17和iNKT 17细胞在开发/维护方面与mTORC2有着相似的要求。据报道，iNKT 17和MAIT 17细胞具有相似的转录程序。82。MTORC2磷酸化并增强一些分子的活性，如SGK 1和Akt。SGK 1和Akt都能磷酸化Foxo 1，使其从核中分离出来，起到抑制Th17反应的作用。83,84,85。我们最近还发现Foxo 1抑制iNKT 17的分化。86。MTORC2在MAIT细胞中可能具有类似的促进MAIT 17分化/稳态的作用。由于mTORC2缺乏症和ICOS缺乏症都优先阻碍MAIT 17的分化，ICOS促进mTORC 2的激活，我们认为MAIT细胞中可能存在ICOS-mTORC2轴，从而促进MAIT 17的分化。此外，mTORC2缺失的MAIT细胞ICOS水平降低，提示mTORC 2也通过对ICOS表达的正反馈控制促进MAIT 17的分化。有趣的是，cmaf在Th17、γδT17和iNKT 17的谱系分化中起着关键作用。67,68,6969。MTORC2缺失的MAIT 17细胞cMAF表达减少，而RORγt表达下降，提示ICOS-mTORC2轴可能促进cMAF表达，从而诱导MAIT 17分化。

值得注意的是，尽管mTORC2和ICOS缺乏导致MAIT细胞的表型相似，但mTORC2缺陷小鼠的MAIT细胞总数，特别是MAIT 17细胞的减少严重得多。ICOS−/−老鼠。鉴于IL-1β和IL-23诱导MAIT细胞中mTOR激活的能力、这些细胞因子对MAIT 17细胞的强效应，以及DAG介导的信号对MAIT 17高效分化的要求，我们认为mTORC2还可以整合IL-1β/IL-23信号和其他可能的信号，如TCR信号，从而发挥其在MAIT 17分化中的关键作用。

小鼠

ICOS−/−(股票编号：004859)猛禽F/f(股票编号：013188)MTORF/f(股票编号：011009)里克特F/f(股票编号：020649)IL2/15 rbF/f(存货编号：029657)，Tbx 21F/f(股票编号：022741)Cd2iCre(股票编号：008520)小鼠从杰克逊实验室购买并回交到C57BL/6J背景。Cd4Cre小鼠(型号：4196)最初是从TaconicInc.tcrjα18购买的。−/−小鼠87由Taniguchi博士、Kim Nichols博士和Luc Van Kaer博士提供。德克兹威汤哥-Cd4Cre和德克兹ΔNLS-Cd4CreT细胞特异性表达WT-dgkζ或功能增益的dgkζ小鼠ΔNLS突变体最近被报道27,62。小鼠基因分型的引物列于补充表中。1。所有动物都被安置在无特定病原体的环境中。实验动物和对照动物共同居住，用二氧化碳进行安乐死，然后摘除器官。在2~4月龄时，对雄性和雌性小鼠进行了研究。所描述的实验得到了杜克大学动物保护和使用委员会的批准。

单细胞悬浮液的制备及MAIT细胞的富集

如前所述，制备了胸腺、脾脏、lns、肺和肝单个核细胞(Mncs)的单细胞悬液。88,89。从胸腺细胞中提取mr1-teet和macs珠子富集MAIT细胞的情况在一篇发表的报告中得到了详细的描述。66。对MAIT细胞进行分析时，用抗TCRβ、CD 24、CD 44等抗体染色，未富集细胞用PE或APC结合MR1-Tet染色。用CD 19、PBS-57负载CD1d-Tet、TCRγδ、CD11b、CD11c、F4/80、B 220、Gr1和T 119共染，排除其他细胞株。活/死固定死细胞染色排除死亡细胞。MAIT细胞在单重态活LIN上的门控−TCRβ+MR1-Tet+胸腺和单线态活林中的细胞−CD 24−+MR1-Tet+10).

抗体与流式细胞术

2.

刺激和细胞内细胞因子检测

用佛波酯(PMA，50 ng/ml)和离子霉素(500 ng/ml)在GolgiPlug(1ng/ml)存在下刺激MR1-Tet或肝MNCs 4~5h，细胞表面染色后，用BD生物修复细胞/Cytoperm和PERM/Wash溶液进行细胞内IL-17A和IFN-γ染色。为刺激ICOS，用抗ICOS抗体(5μg/ml；克隆C398.4A；Invitrogen)37°C孵育30 min，观察细胞表面和细胞内染色情况。

IL-15/IL-15RαFC、IL-2、IL-23和IL-1β治疗

将IL-15/IL-15RαFC复合物与50μg/ml IL-15Rα/FC(R&D系统，目录号：5 51-MR)混合，在37°C下孵育30 min，制备IL-15/IL-15α复合物。用1μg小鼠白细胞介素2(peproTech，分类号：212-12)和5μg抗IL-2抗体(克隆S4B6-1，BioXcell，目次号：BE0 0 43-1)在2 0 0μl pbs中制备了IL-2/抗IL-2抗体复合物。64然后在37℃下孵育30 min。体内注射IL-2/抗IL-2复合物(6μg/d)200μl，第1、2、3天注射IL-15/IL-15αFC复合物(12μg/鼠)，第5天分别注射IL-15/IL-15αFc复合物(12μg/鼠)，第5天处死实验，IL-1β和IL-2 3治疗小鼠腹腔注射IL-1β和IL-23。注射IL-1β(1μg/d，peproTech，目录编号：211-11B)，IL-23(1μg/d，研发，目录编号：1887-ML-010)，或在第1和第2天共注射75μg/kg体重雷帕霉素，第4天进行安乐死试验。TM用含55μm~2-ME、1mm L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素(imdm-10)的10%fbs(含55μm~2-ME、1mm L-谷氨酰胺、100 mg/ml链霉素(imdm-10))重悬浮于96孔U底板(3×10)中。6细胞在200μl imdm-10中培养，在没有或存在IL-15/IL-15αfc复合物(0.0 5μg/ml IL-15/0.25μg/ml IL-15 Rαfc终浓度)、IL-2(10 0 0 ng/ml)、IL-1β(10 ng/ml)、IL-23(10 ng/ml)或10 ng/ml(IL-1β+10 ng/ml)的37°C下培养。2采前3天进行分析。在部分实验中，还加入了20 ng/ml的雷帕霉素。

MAIT细胞细胞因子的体外刺激和检测

CD 24−CD 44+CD 122+ICOS低层和CD 122−ICOS+从WT小鼠肝MNCs中分离MAIT细胞。用PMA(50 ng/ml)和离体霉素(500 ng/ml)在200μl 10%FBS-IMDM中，37℃下96孔板刺激3000个MAIT细胞4h，用™MU Th细胞因子板和VBP V 03试剂盒(Biolegend，Cat：741044)对培养上清液进行细胞因子测定。在BD LSRFortessa™流式细胞仪上采集标准和样品。数据用LEGENDPLE™数据分析软件进行分析。另外，用10 ng/ml的IL-1β+10 ng/ml的IL-23刺激了1500个MAIT 1和MAIT 17细胞。oC，5%CO23天后，进行细胞表面TCRβ、MR1-Tet染色、细胞内抗T-bet、抗RORγt染色及流式细胞仪分析。

TCRVα-Jα重组的评价

Tcrvα-jα重组是根据一项经修改的已发表的协议进行的。89。简单地说，1×107活CD4+CD8+胸腺细胞来自年龄和性别匹配的WT和MTORF/f-Cd4Cre用MoFlo细胞分离器(贝克曼库尔特)对小鼠进行分类，分类后纯度为98%。用苯酚/氯仿提取基因组DNA，70%乙醇沉淀，溶于TE缓冲液(10 mm Tris-0.5mm EDTA[pH 8])。对于半定量PCR，每个样本的DNA模板量(100，33，11 ng)减少。TCRVα19片段的前引物为5‘-GTAGTACCTCTTCTGAC-3’。不同α片段的反向引物为：TCRJα18，5‘-GTAGAAAGACCTACTCACA-3’和TCRJα33，5‘-TATCGAAGACTTACCTGCTT-3’。CD 14 PCR(负载对照)引物为5‘-GCTCAAATTCAATCATACCGAC-3’(正向)和5‘-AGTCAGTCGGGGAGGCCGGAAATC-3’(反向)。

ScRNAseq数据分析

Legoux等人报告的scRNAseq数据的原始计数30从欧洲生物信息学研究所(EMBL-EBI)下载，登录号E-MTAB-7704(单细胞RNA-seq)。使用R中的Seurat包(3.1.1版)对scRNAseq数据进行预处理(3.5.3版)90。在不到三个细胞中表达的基因和检测到的基因不超过50个的细胞被筛选出来。过滤后的数据集将每个细胞的基因表达测量标准化，总表达与默认的10,000的比例因子相乘，然后用全局标度归一化方法LogNormalize对结果进行日志转换。通过ScaleData函数减轻了技术噪音和(或)生物源的变化，以改善下游降维和聚类。利用FindVariableFeatureFunction函数筛选高变异基因进行下游分析。利用RunPCA函数对标度数据进行主成分分析(PCA)。重要的pc被确定为那些富集度较低的pc。p基于Jack秸秆算法的基因值。对于单元聚类，计算k近邻，利用FindNeighbors构造SNN图.前20位个人电脑被选中使用Find集群进行分析。上述基于图形的簇内细胞通过RunTSNE和TSNEPlot共同定位，在tsne图上显示。FindAllMarkers被应用于寻找通过差异表达来定义聚类的标记。用FeaturePlot法在tSNE图上观察个体基因的表达情况。用VINPlot来表示簇间的表达概率分布。

统计分析

小鼠MAIT细胞的缺乏导致了实验之间的差异。为了解决这个问题，我们对一对年龄和性别匹配的老鼠进行了单独的实验，并对大多数配对的小白鼠进行了实验，并将它们安置在同一个笼子里。在个体实验中，每对小鼠都以试验小鼠与对照小鼠之间的连接线作为标记。每个图形中的散点图是从多个实验中汇集而成的，图中显示的对数反映了实验的数量。用双尾配对学生的方法进行比较。t使用Prism 5/GraphPad软件进行测试。对于不属于成对类的实验，采用双尾未配对学生的方法进行比较。t测试一下。数据用平均±扫描电镜显示。只p小于0.05的数值被认为是重要的，如图所示。