Ⅰ型干扰素对CD8代谢适应度的影响+系统性红斑狼疮患者T细胞

大多数系统性红斑狼疮(SLE)患者均有Ⅰ型IFN刺激基因的高表达。线粒体异常也有报道，但I型IFN暴露在这些变化中的作用尚不清楚。在这里，我们通过对CD4的转录分析，展示了IFN-高水平患者线粒体衍生基因和线粒体相关代谢途径的下调。+和CD8+T细胞CD8+这些患者的T细胞线粒体增大，呼吸能力降低，与TCR刺激后细胞死亡增加有关。这些线粒体异常可以通过暴露CD8来表现。+T细胞从健康志愿者到I型干扰素和TCR刺激。机械地说，这些‘系统性红斑狼疮’的情况增加了CD8。+T细胞NAD+的消耗导致线粒体呼吸功能受损，细胞活力降低，两者均可通过补充NAD+来纠正。我们的数据表明，Ⅰ型IFN暴露通过促进CD8参与SLE的发病机制。+T细胞通过代谢重组而死亡。

系统性红斑狼疮(SLE)是一种复发缓解的自身免疫性疾病，缺乏监测和预测疾病爆发的生物学参数。大量研究表明，大多数系统性红斑狼疮患者的Ⅰ型干扰素刺激基因(Isgs)表达增加，被称为“干扰素信号”。1。Ⅰ型IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ和IFN-ω是一种具有多种免疫功能的多种细胞因子.在横断面研究中，据报道isgs的表达增加与系统性红斑狼疮(SLE)的疾病活动有关。2。然而，针对活动性和非活动性系统性红斑狼疮患者细胞中ISG表达的研究和纵向研究报告了相互矛盾的结果，ISG水平与儿科的耀斑率之间有很强的相关性。3，但不是在成年病人身上4。由isgs编码的几个基因产物与抗病毒防御机制和细胞功能调节有关。5,6。尽管如此，这些基因在SLE中的生物学作用仍然鲜为人知。SLE患者IFN信号的触发因素也不清楚.至少有三种可能的原因。首先，免疫复合物以及dna和rna可以通过TLR 7/TLR 8或TLR 9信号通路激活类浆细胞树突状细胞(PDC)作为内源性IFN诱导剂。7。第二，Ⅰ型干扰素信号通路中的基因变异能促进干扰素-α的产生。8。最后，调节pdc激活的缺陷可能导致这些细胞被内源性核酸持续激活。6.

一些研究表明，除了营养、氧气和生长因子的有效性外，细胞因子还能影响线粒体的代谢和动力学。9。I型IFNs已被证明影响许多细胞类型的线粒体功能。10。Ⅰ型干扰素通过增加线粒体活性氧(ROS)的积累激活造血细胞线粒体凋亡途径11。此外，干扰素α处理的单核细胞表现出有丝分裂缺陷和线粒体dna胞质积累，导致炎症表型增加。12。自相矛盾的是，一些研究表明，Ⅰ型IFNs下调了mtdna编码基因的表达，降低了电子传递链(等)的活性，并发挥了抗增殖作用。13。此外，I型IFNs通过上调脂肪酸氧化(FAO)和氧化磷酸化(OXPHOS)促进pDC的线粒体功能。14。同一项研究还表明，I型IFNs促进其他免疫细胞中的OXPHOS，包括小鼠记忆CD8。+T细胞，而不是效应细胞CD8+T细胞这些研究表明，I型干扰素对线粒体代谢的下游影响是不同的，而且是细胞特异性的。

一些研究已经描述了系统性红斑狼疮患者细胞线粒体和代谢的改变。Mtdna编码基因的常见变异据报道与系统性红斑狼疮有关。15而系统性红斑狼疮白细胞则增加了mtdna的损伤，降低了mtdna编码基因的表达。16。代谢变化主要发生在CD4。+T细胞包括线粒体超极化、ATP还原、活性氧生成增加、细胞内抗氧化谷胱甘肽耗竭等。17，以及强化的糖酵解18,19,20。这些代谢改变会导致T细胞异常活化和细胞死亡通路受损，从而导致免疫调节失调和自身抗体的产生。21。与此相一致，我们发现补体C1q是系统性红斑狼疮的一个关键易感基因，它通过作为CD8代谢调节因子来限制自身免疫应答。+T细胞22。尽管有越来越多的证据表明I型干扰素在免疫细胞代谢中起着重要作用，但到目前为止，大多数数据都来自于短期暴露或小鼠模型的体外实验。目前，慢性I型干扰素信号通路对人T细胞代谢的影响尚不清楚。

在本研究中，我们利用系统性红斑狼疮患者T细胞高通量的rna测序，揭示了Ⅰ型干扰素信号与CD8线粒体变化之间的联系。+T细胞我们证明CD8中的代谢异常+T细胞是I型干扰素长期暴露和TCR刺激的结果。这两种刺激共同增加了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的消耗，改变了CD8中线粒体的形态和功能。+T细胞，使它们在代谢上不适合，更容易死亡，特别是在应激条件下或对抗原再挑战的反应。

ISGS高表达患者OXPHOS基因表达下调

为了研究T细胞转录信号是否有助于确定SLE患者的疾病活动，我们对CD4中的mRNA进行了测序。+和CD8+从活跃和不活跃女性患者中分离T细胞(见“方法”部分和补充表)1)。T细胞标记与年龄匹配和性别匹配的健康对照组(HC，n=11)。差异基因表达分析显示，活动期和非活动期SLE患者之间的差异表达基因(Degs)最少或很少，而所有SLE患者与HC患者的CD8中差异表达基因(Degs)较多。+而不是CD4+T细胞(分别为358和237基因；补充表)2)。正如预期的那样，路径分析揭示了两种系统性红斑狼疮CD4高度富集的IFN信号通路。+和CD8+T细胞转录子。我们还发现了先前被描述为在系统性红斑狼疮转录体中过度表达的通路。23,24，如JAK-STAT信号，细胞周期，DNA修复和凋亡(补充图.1).

接下来，我们对所有的CD4进行分层聚类。+和CD8+T细胞在健康对照者和SLE患者之间存在差异，而不考虑患者的临床特征。该分析将SLE患者分为两组：SLE-1组和SLE-2组(图1).1一个,b)。在两种T细胞系中，SLE-2组患者表现出较强的Ⅰ型IFN信号.CD4+T细胞，伴随着参与JAK-stat信号和T细胞共刺激的基因，而在CD8中。+T细胞ISG表达增加与细胞周期、DNA损伤和凋亡反应相关。1一个,b)。基因集变异分析(GSVA)和加权基因共表达分析(WGCNA)25,26显示，在CD8中+T细胞，属于线粒体诱导的凋亡和dna损伤反应通路的基因与疾病活动相关，它们与独立于疾病活动或其他临床标准的IFN信号共同表达(补充图)。2A)。有趣的是，与疾病活动相关最显著的共表达模块包括mtdna编码基因，这些基因都涉及到cd4中的oxphos。+和CD8+T细胞(附图)2B, c)，表明I型IFN可能对线粒体基因有调节作用。

比较SLE-1组和SLE-2组的转录谱，发现除ISGS外，mtDNA编码的OXPHOS基因表达差异最大(图一)。1C，d)。在构成ETC的80种蛋白质中，13种由位于线粒体DNA上的基因编码，其余的由核DNA(NDNA)编码。所有OXPHOS基因的热图显示，SLE-2患者主要下调mtDNA编码的OXPHOS基因，而不是nDNA编码基因(补充图)。3A)。用定量实时定量(QPCR)(补充图)验证了这一观察结果.3B, c)。SLE-2组线粒体衍生基因的抑制作用在CD8期更为明显。+T细胞多于CD4细胞+T细胞(附图)3B)。代谢功能相关基因的通路分析显示，与SLE-1患者相比，参与三羧酸(TCA)循环等的通路和ATP合成明显降低(补充图)。三维空间).

综上所述，系统性红斑狼疮患者纯化T细胞的转录分析根据isg表达水平将其分为两组，表达高Ⅰ型IFN信号的患者线粒体编码基因和线粒体相关代谢途径的表达减少，CD8的表达更为明显。+T细胞这表明SLE患者线粒体功能失调，与I型IFN相关，这是我们下一步要验证的假设。

CD8异常线粒体+高表达ISGS患者T细胞

在研究I型IFN信号与线粒体异常之间的潜在联系之前，我们采用硅片和体外结合的方法，根据I型IFN信号的程度对SLE患者进行分层：高水平ISGS(IFN-High)、低水平ISGS(IFN-Low)和无ISGS(IFN-Neg)。通过应用Kennedy等人使用的方法。27三种Ⅰ型干扰素诱导基因(HERC 5, EPSTI 1，和CMP K 2我们建立了一个切割干扰素评分矩阵(IFN-高：ISM>1.5；IFN-低：ISM 0.5-1.5；IFN-Neg：ISM<0.5)，与我们的RNAseq衍生评分高度相关(补充图)。4).

其次，我们研究了IFN-高和IFN-neg SLE患者T细胞的线粒体表型，并将类风湿关节炎(RA)患者作为疾病对照(补充表)。3)。我们发现CD8+与其他组(HC、IFN-Neg SLE和RA患者)相比，IFN-高SLE患者的T细胞线粒体大小增加(图1)。2一个,b)和膜超极化。2C)。线粒体变化最明显的是效应记忆CD8。+T细胞，而中央记忆CD8+T细胞无异常(附图)。5A和6A–c)。CD8比例+IFN-高和IFN-Neg SLE患者T细胞亚群相似(附图).6d)。在IFN-高系统性红斑狼疮患者中，我们也观察到CD8的增加。+T细胞对细胞ROS(CellularRos，CROS)呈阳性反应，但仅呈线粒体ROS(MROS)染色细胞比例的趋势(图一)。二维空间和附图。5B、c和6E)。在IFN-Neg SLE患者中也检测到较高比例的CRO阳性细胞，表明这是一种疾病特异性效应(图一)。二维空间)。为了观察形态学变化，我们采用超分辨结构照明术(SR-SIM)，结合荧光标记的TOM 20(绿色)和CD8(红色)的线粒体蛋白亚基抗体和DAPI(蓝色)进行细胞核染色。显微图像补充了我们的流式细胞术数据，显示在CD8中。+IFN-高SLE患者T细胞线粒体形态与IFN-Neg SLE患者相比有显着性差异(图1)。2E)。此外，图像分析表明，IFN-高CD8组细胞平均线粒体体积较高。+T细胞(图1.2F)。通过对图像的盲目评分，我们发现IFN高的SLE患者有较高的CD8比例。+线粒体拉长的T细胞为(21.7±7.4)，而IFN-Neg SLE为(9±3.4)。值得注意的是，对CD4的分析+T细胞未能检测到任何线粒体参数的显著变化(补充图)。7)。尽管线粒体大小和CD8活性增加+我们发现T细胞在mtDNA拷贝数上没有差异(补充图)。8A)。同样，我们没有检测到mtDNA编码和nDNA编码的OXPHOS基因的蛋白质表达有任何差异(补充图)。8B, c)在两个T细胞中。

综上所述，这些数据表明，长期接触干扰素α可能引发CD8线粒体改变。+，但不是CD4+、T细胞，这可能导致代谢失调的细胞，对其功能有潜在的影响。

CD8+高IFN信号患者的T细胞降低了Scr

CD8检测到的线粒体变化+IFN-高SLE患者的T细胞促使我们评估其代谢功能.接下来，我们比较了线粒体呼吸和有氧糖酵解在体内外CD4中的作用。+和CD8+从SLE患者和HC患者外周血中分离T细胞。利用海马细胞外通量分析仪，我们发现CD8+IFN-Neg患者T细胞的基础氧耗率(Ocr)和最大耗氧率(Ocr)与hc相似，而CD8细胞则接近。+IFN-高水平患者的T细胞基础和最大OCR较少(如图所示)。3A)。重要的是，在IFN-高CD8中+T细胞备用呼吸能力(SRC)，反映细胞适应能量需求增加的能力显著降低(图一)。3A)。SRC的下降伴随着细胞内ATP水平的下降(补充图)。9A)。另一方面，在CD4中未发现OCR或src的明显异常。+T细胞同时从同样的病人中分离出来(如图所示)。3A)。此外，以细胞外酸化率(ECAR)来衡量的糖酵解在两组中都是相似的。+和CD8+T细胞(附图)9B).

接下来，我们将探讨在CD8体内是否观察到代谢异常。+IFN高者T细胞可导致T细胞缺陷.我们观察到CD8细胞自发死亡增加。+来自IFN-高SLE患者的T细胞与HC和IFN-Neg SLE患者的比较(图1)。3B)。然而，当IFN-高CD8+体外培养T细胞，很快失去IFN信号，第3天ISM相当于IFN-Neg细胞的ISM(补充图)。9C)，这一变化使我们无法对SLE患者的细胞进行进一步的体外功能检测。

总之，代谢分析显示CD8中线粒体较大且超极化。+IFN-高SLE患者的T细胞受到生物能量损伤.这些数据还表明，持续激活Ⅰ型干扰素通路可能会降低CD8的代谢适应度。+T细胞和它们的生存能力。

TCR和IFN联合诱导CD8+T细胞代谢重组

为探讨IFN-高CD8中线粒体和代谢变化的顺序性事件。+T细胞，我们接下来使用的细胞来自HC和长期干扰素治疗和TCR激活的结合，这两个必要的细胞信号存在于SLE患者。我们从不同浓度的干扰素α(10,100,1000 U/ml)中培养出不同浓度的人外周血单个核细胞(PBMC)。1000 U/ml剂量的干扰素α可显著增加IFN-高SLE患者的ISG表达(附图)。10A因此，这个剂量被用于后来的所有实验中。重要的是，同时暴露于CD8+T细胞对干扰素α2天没有引起任何明显的线粒体或代谢变化(补充图)。10b–f第7天，干扰素α暴露，特别是结合T细胞活化，导致mtDNA编码基因表达下调(如图所示)。4A)和线粒体的变化。4B)，类似于CD8中观察到的情况。+来自IFN-高SLE患者的T细胞(图)。2一个,b)。然后我们分析了CD8的氧化能力。+T细胞观察到，无论是否有CD3/CD 28激活，第7天干扰素α刺激均能显著增强基础α，而不是最大OCR，当各样本恢复到基础水平时，SRC明显降低，尤其是当IFN-α与T细胞激活联合作用时(如图1所示)。4C)。与体内外病人数据一致(补充图)。9B我们发现干扰素α启动并不改变基础的ECAR(补充图)。11A).

CD8中SRC容量的降低+长期用干扰素α和抗CD3/CD 28微球刺激T细胞后，提示生物能量适应能力受损。为了证实这一点，我们分析了在细胞外通量测定过程中，用抗CD3/CD 28微球进行再刺激时的糖酵解和氧化反应。在这些实验条件下，干扰素α刺激CD8。+与CD8相比，T细胞在初始爆发后氧化和糖酵解能力下降更快。+T细胞只受CD3/CD 28刺激。同样的结果也观察到用PMA/离子霉素作为非特异性刺激物进行再刺激(如图所示)。4D和补充图11B).

总之，利用CD8的体外研究+来自hc的T细胞证明，单用长期的干扰素α治疗可以触发可检测到的代谢重新连接，但只有联合暴露干扰素α和T细胞激活才能使CD8中观察到的线粒体和代谢异常出现。+IFN-高SLE患者T细胞。

干扰素α暴露诱导慢性活化CD8细胞死亡+T细胞

建立了实验条件，重现了SLE CD8中的代谢变化。+T细胞，我们接下来研究下游效应。与系统性红斑狼疮患者的体内外数据一致，我们发现长时间的干扰素α暴露加上T细胞活化促进了CD8的自发死亡。+T细胞(图1.5A)。与自发细胞死亡数据一致，我们发现，在再次挑战时，CD8的增殖率。+IFN-α作用后T细胞表达AnnexinV显著增加(图一)。5B)。此外，我们检测到较少脱颗粒(CD107a阳性)和活化(CD 69和CD 25阳性)CD8。+干扰素刺激细胞中的T细胞。5C)。这些变化仅在再刺激后4h检测到(补充图)。12A肿瘤坏死因子α的分泌减少，颗粒酶B和干扰素γ的分泌呈下降趋势(附图)。12b).

这些数据表明，Ⅰ型干扰素信号改变了CD8的代谢。+SLE患者T细胞在TCR再挑战后细胞存活率降低。

干扰素α暴露增加CD8中NAD+的消耗+T细胞

了解慢性Ⅰ型干扰素与下游线粒体和CD8中代谢变化之间的机制联系。+T细胞，我们首先从CD8的转录数据中探索哪些途径与Ⅰ型IFN信号相关。+SLE患者T细胞。我们发现烟酸/烟酰胺代谢途径的相关性最高。r2=0.6562；P≤0.0001，皮尔森相关系数)(图1.6A)和NAD消耗酶，如聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP 9，PARP 10，和PARP 12)和CD 3828，在CD8中明显升高。+来自IFN-高SLE患者的T细胞(图)。6B)。此外，TCR刺激的CD8+健康对照组T细胞表面CD 38表达增加(图1)。6C)和诱导的基因表达。PARP 9和PARP 1干扰素α治疗后0。13A)，提示干扰素α对烟酸/烟酰胺代谢途径有直接影响。基于这些数据，我们推测活化的CD8细胞中，Ⅰ型IFN信号所引起的NAD消耗酶的表达上调。+T细胞可导致NAD+耗竭及线粒体功能障碍。与这一假设一致，我们观察到CD8中NAD+/NADH比值显著降低。+延长IFN、α和TCR刺激后的T细胞(见图)。6d)、模拟CD8细胞线粒体和代谢异常的实验条件。+IFN-高SLE患者T细胞。

为了检测补充NAD+是否能纠正干扰素α刺激的下游效应，我们培养了CD8。+T细胞用1mmβ-烟酰胺单核苷酸(NMN)恢复NAD+/NADH比值。6E)。然后用抗CD3/CD 28微球对再刺激后的氧化反应和细胞活力进行评估。添加NMN的NAD+增加了OCR(如图所示)。6f)，但不是ECAR(附图)。13C)，表明线粒体容量增加。同样的结果也被观察到在PMA/离子霉素作为阳性对照时再刺激(补充图)。13D)。重要的是，恢复NAD+可用性与NMN治疗后，提高细胞活力延长干扰素α和TCR刺激(图一)。6g)在重新挑战时，表明NAD通路对这些活化的人CD8的线粒体适应度和细胞存活有调节作用。+T细胞据报道，NAD+补充剂可通过降低CD8中的MRO水平来维持线粒体的健康。+T细胞29，我们在体外模型中对此进行了探讨。我们发现，干扰素α暴露增加了活化的CD8的百分比。+T细胞在再刺激后表达MRO，NMN处理能够减弱这种效应(补充图)。13E).

总之，我们的数据表明，长时间的干扰素α暴露增加了人tcr刺激的CD8中NAD+的消耗，降低了NAD+/NADH的比值。+T细胞这导致线粒体呼吸缺陷的再刺激和降低细胞活力。NAD+前体NMN纠正了这些代谢改变，改善了CD8。+T细胞活力。

人们认识到大多数SLE患者的ISG表达增加，但其生物学和临床意义尚不清楚。我们的T细胞转录和代谢研究在一组经活检证实为肾炎的系统性红斑狼疮患者中表明，高干扰素信号可以驱动CD8线粒体代谢途径的改变。+T细胞使它们在生物能量上不健康，更容易死亡。在这里，我们使用了In硅法和体外法相结合的方法，证明了在CD8中观察到的代谢重新连接。+系统性红斑狼疮患者的T细胞是干扰素α暴露时间延长和TCR刺激的结果。在这两种刺激持续结合的情况下，可能是系统性红斑狼疮患者特有的一种情况，即CD8。+T细胞增加PARP基因表达与增加NAD+消耗，降低线粒体氧化能力和降低存活率有关。7)。综上所述，我们的发现证明了高ISG信号与SLE CD8代谢适应度之间的联系。+T细胞，以及它们在应激或抗原再挑战下生存的能力。

在过去的十年里，已经在系统性红斑狼疮患者中进行了几项转录研究。30。然而，大多数研究都是针对临床表现不同的全血和系统性红斑狼疮患者进行的，这是推断干扰素应答信号之外的生物学途径的障碍。最近对40项独立研究进行了整合和多队列分析，确定了一种独特的系统性红斑狼疮易感基因，包括血液中的93个基因，其中85%与干扰素有关。31。值得注意的是，在本研究中，非IFN SLE元信号与SLE疾病活动有更高的相关性。与本报告和其他报告一致4,27,32我们对肾损害的SLE患者的T细胞进行了转录分析，发现ISG水平与疾病活动无关。相反，我们发现高I型干扰素信号与CD8中的线粒体异常有关(例如线粒体编码的oxphos基因和大而超极化的线粒体的表达减少)。+T细胞这些异常产生了功能较差的线粒体，导致细胞死亡增加，这本身就与SLE的发病机制有关。已有研究报道SLE患者T细胞凋亡程度较高，且与疾病活动相关，但未发现与IFN信号有关的机制。33.

从我们对纯化CD4的比较转录分析中最有趣的观察之一+和CD8+T细胞在CD8中的基因表达特征与临床参数的相关性较强。+T细胞，提示这些细胞可能在疾病的发病机制中起着不可或缺的作用。与此相一致的是，先前的一项利用微阵列进行的转录研究假设CD8的基因信号。+但不是CD4+T细胞，可预测包括系统性红斑狼疮在内的多种自身免疫性疾病的长期预后。34。然而，CD8的保护和有害作用+T细胞已被报道35,36，这可能反映了这些细胞在SLE不同阶段的不同作用。体外刺激抗原体验抗病毒CD8+SLE患者T细胞脱颗粒较少，细胞因子生成减少，提示CD8功能失调。+T细胞反应37。相反，其他研究报告显示循环细胞溶解CD8的频率增加。+活动期SLE患者与健康对照者的效应T细胞35。CD8对系统性红斑狼疮组织损伤的影响+T细胞38颗粒酶B，细胞毒性CD8释放的丝氨酸蛋白酶+T细胞，能产生独特的自身抗原片段，导致自身抗原负荷增加。35。此外，我们还演示了CD8+IFN-高水平患者T细胞自发凋亡率增加，再刺激后细胞死亡更多，这可能通过增加自身抗原暴露而加剧自身免疫(图一)。7)。除了自身抗原负荷，CD8+T细胞也可能通过调节自身抗体的产生作为pd 1的一个独特的子集来促进自身免疫的延续。+CXCR 5+CD8+T细胞最近在B细胞滤泡和生发中心被发现。39。这些细胞的功能与CD4相似。+T滤泡辅助细胞支持自身抗体的产生。所有这些研究表明，CD8在自身免疫方面具有前所未有的作用。+T细胞，值得进一步研究CD8的免疫调节功能。+T细胞在SLE发病机制中的作用

有越来越多的证据表明，虽然急性Ⅰ型干扰素信号可以改善免疫反应，但长时间的刺激会导致调节途径，从而限制免疫力和促进慢性疾病。40。在慢性病毒感染期间，旁观者CD8+受干扰素α作用的T细胞在刺激后增殖能力较弱。41阻断Ⅰ型干扰素信号增强病毒清除。42。然而，这些调控途径没有明确的定义，是细胞类型和上下文依赖的.我们比较IFN-Neg和IFN-高SLE T细胞对慢性I型IFN信号在SLE中的影响提供了独特的见解。与以前对SLE CD4的转录研究一致+T细胞，我们发现这些细胞中的isg信号与JAK-stat，T细胞共刺激通路和组织归巢信号有关。24(无花果)1和补充图。1)，提示慢性I型IFN信号可能促进CD4的表达。+T细胞反应。然而，慢性Ⅰ型干扰素信号似乎对CD8有害。+我们发现T细胞DNA损伤、凋亡信号和NAD通路与ISG相关。与此一致的是，代谢分析显示CD8+IFN-高系统性红斑狼疮患者的T细胞在体外长期暴露于干扰素α后代谢受损，存活能力较弱。总的来说，我们的数据提示新陈代谢的调节是CD8的调节机制之一。+T细胞抑制其对持续性I型IFN信号的免疫应答。

代谢适应是CD4的一个重要特征。+和CD8+T细胞函数43。在抗原识别之后，线粒体氧化和有氧糖酵解共同促进T细胞的克隆扩张、效应功能和存活。这两种代谢途径之间的不平衡导致T细胞反应异常和存活率降低。线粒体代谢异常在系统性红斑狼疮中主要表现为CD4。+T细胞这些缺陷包括线粒体超极化、线粒体尺寸增大、ATP耗竭和ros生成增加。44。CD4中也有增加OXPHOS和糖酵解的报道。+系统性红斑狼疮患者和易发狼疮小鼠的T细胞20。在我们的研究中，我们无法复制这些观察，这可能与不同的临床队列有关。此外，在功能研究中，我们选择了临床稳定且不需要改变治疗的患者。值得注意的是，在以前的所有研究中，线粒体缺陷与ISG之间的联系没有被探索。事实上，很少有研究研究I型干扰素对T细胞代谢的影响，特别是在慢性干扰素α暴露的情况下。一项在小鼠身上进行的研究表明，在记忆样的OT-1 CD8。+T细胞、干扰素α诱导脂肪酸氧化驱动的OCR增加14。其他研究表明，干扰素α治疗人B和T细胞可导致线粒体衍生基因的基因表达下降。13,45。然而，这些体外研究调查了相对较短的时间暴露于干扰素α，我们发现，Ⅰ型干扰素暴露48小时对人的原始T细胞没有明显的代谢效应。相反，较长时间(最多7天)暴露可降低src的CD8值。+T细胞，但不是CD4+T细胞因此，我们的数据强化了免疫代谢在SLE发病机制中的重要作用，并强调免疫细胞对急性或慢性变化使用不同的代谢途径。需要进一步的研究来探索调节这些不同代谢程序的机制。

SLE患者细胞有丝分裂缺陷与IFN信号有关。12,46。此外，系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中线粒体巨噬细胞的形成与线粒体分裂启动子drp 1蛋白缺陷增加线粒体融合有关。47。事实上，我们在CD8中观察到线粒体增大。+来自IFN-高SLE患者的T细胞(图)。2E)这可能暗示线粒体融合增强或通过有丝分裂清除缺陷。然而，我们的转录分析并没有揭示与有丝分裂相关的基因特征(例如PINK 1, PRKN, BNIP3L, BNIP 3, FUNDC 1, ATG 7(基因)在IFN-高SLE患者中的差异表达。相反，我们发现，在tcr刺激的CD8中，Ⅰ型干扰素信号受损，线粒体代谢受损。+T细胞通过调节NAD代谢途径。Nad+是一种代谢辅助因子，在维持线粒体健康方面起着关键作用。48。NAD+通过调节线粒体未折叠蛋白反应或通过向呼吸链复合物I提供电子来影响线粒体功能。NAD+通过NADPH的产生维持细胞的氧化还原稳态。

我们的研究表明CD 38和PARP基因是众所周知的NAD消耗酶，与系统性红斑狼疮患者的Ⅰ型干扰素信号有关(如图所示).6A并可在体外被干扰素α诱导(如图所示)。6B)。事实上，最近的一项研究将CD8中CD 38的表达增加联系在一起。+T细胞对SLE感染患者效应功能的影响49。但与Ⅰ型IFN信号的相关性未见报道。在癌症中，CD 38-NAD+轴在T细胞中的作用也被认为是至关重要的，因为CD 38表达的降低与细胞NAD+水平的升高、氧化磷酸化和谷氨酰胺解的增强以及T细胞效应功能的改善有关。50。已知PARP蛋白的激活是由DNA损伤引起的。51。确实，dna损伤反应不足已经在系统性红斑狼疮和其他自身免疫性疾病中被描述.与健康对照组相比，系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞在紫外线照射下PARP活性下降。52。我们观察到IFN处理后MROS的积累，这可能导致DNA损伤，并触发PARP表达的增加。值得注意的是，ISG本身与疾病活动无关，属于线粒体诱导的凋亡和DNA损伤反应通路的基因与疾病活动显著相关(附图)。2A)表明这些途径对疾病发病机制的潜在贡献。最近的一项研究报道，在DNA损伤后，细胞对OXPHOS的依赖程度比糖酵解对OXPHOS的抑制作用更强，而不是糖酵解，从而导致ATP的剥夺和细胞的死亡。53。因此，与dna损伤引起的NAD+消耗增加相关的PARP表达增加可能触发了CD8的代谢改变。+来自IFN-高SLE患者的T细胞，这对他们的生存至关重要。此外，据报道，补充NAD+可以恢复线粒体功能，减少mros在CD8中的积累。+T细胞29。与此一致的是，我们在人活化的CD8中的数据+T细胞显示，NMN补充NAD+能恢复NAD+/NADH比值，增加线粒体呼吸，降低MRO，更重要的是在抗原再挑战的作用下提高细胞存活率。因此，我们的研究揭示了干扰素α暴露与NAD代谢途径之间的联系，以及NAD+通路在tcr刺激的CD8代谢适应度中的关键作用。+T细胞提高NAD+水平是否对IFN高SLE患者有好处，还有待进一步研究。

我们的发现将Ⅰ型干扰素信号与CD8中线粒体代谢失调联系起来。+T细胞超越了现有的关于I型IFNs在SLE中的作用的知识。我们发现NAD通路的调节是I型IFNs影响SLE线粒体功能的机制之一。然而，其他机制也可能导致CD8的代谢损害。+来自IFN-高系统性红斑狼疮的T细胞和进一步的研究是必要的，以探索这些额外的潜在途径。

虽然IFN标记不能作为SLE的疾病生物标志物4，在我们的系统性红斑狼疮队列中，以及在其他横断面研究中，IFN-高水平的患者往往有一个更严重的疾病病程。54提示ISGS在该病的发病机制中起一定作用。此外，最近的一项III期临床试验(郁金香2号，NCT 02446899)用人单克隆抗体(Anfrolumab)专门阻断。IFNAR 1(Ⅰ型干扰素受体亚基1)符合主要终点，因此这种新的治疗方法有望改变系统性红斑狼疮患者的治疗标准。55。试验数据也表明IFN-高SLE患者有更好的疗效.与此相一致的是，我们的研究将Ⅰ型干扰素与CD8联系在一起。+T代谢适应度和生存率主张IFN-高和IFN-Neg SLE患者之间的潜在疾病机制可能不同，因此在治疗SLE患者时应考虑基于IFN信号的患者分层。此外，我们的数据支持探索代谢途径作为治疗目标的概念。

病人

研究中的所有系统性红斑狼疮患者均符合美国风湿病学会修订的标准。56和SLICC57标准和有活检证实的肾炎。狼疮性肾炎(LN)按国际肾病学会/肾病理学会分类。6个月内接受环磷酰胺和/或B细胞耗竭的患者被排除在外。在转录研究中，29例系统性红斑狼疮患者来自帝国狼疮中心，详情见补充表。1。以系统性红斑狼疮疾病活动指数(SLEDAI评分)和不列颠群岛狼疮评估组(BILAG)指数进行临床分型，活动性疾病定义为SLEDAI>6，SLEDAI<4。活动肾脏疾病定义为尿蛋白：肌酐比值>50 mg/mmol，并在3个月内经活检证实为Ⅲ级或Ⅳ级或Ⅴ级LN。不活动的肾脏疾病被定义为有被活检证实的LN病史的患者，在强的松龙剂量下。⩽每日10 mg与肾BILAG结构域分级D级，蛋白质：肌酐比值<50 mg/mmol，治疗前12个月内SLE相关药物无变化。11名健康女性志愿者(没有自身免疫性疾病家族史)作为年龄匹配和种族匹配的对照。参与代谢和功能研究的系统性红斑狼疮患者和健康志愿者的详细情况见补充表。3。以7例女性RA患者作为疾病对照进行代谢研究。所有患者均给予知情同意，并将样本作为子收集，在帝国学院保健组织银行登记(许可证：12275；国家研究伦理服务批准17/WA/0161)。帝国学院医疗组织银行的组织管理委员会批准了这项研究(参考文献：R13010a)。

PBMC分离与T细胞分离

采用Lymphoprepp密度梯度离心法获得PBMC(干细胞技术，加拿大)。总之，大约50毫升的血液稀释1×用磷酸盐缓冲液(PBS)，加入2%的FBS，并在15 ml的Lymphoprep溶液之上分层。然后，样品以800×分离心。g室温下持续20分钟，无间断。收集界面上的PBMCs，用PBS/2%FBS清洗两次。最大限度地提高CD4的纯度+和CD8+T细胞，T细胞首先用负磁选择盘T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)按制造商的指示进行富集。在代谢研究中，如所示，选择的T细胞用抗CD4和抗CD8抗体标记，然后用Aria II FACS(Becton-Dickson)进行分类。在RNA测序实验中，CD4+和CD8+T细胞采用DynabeadsFlowComp、人CD4或CD8试剂盒(Invitrogen)进行阳性分离。流式细胞仪检测平均纯度大于95%。

一些体外培养实验用CD8+从健康供体中分离得到的T细胞来源于布菲外套球果(NHSBT)。CD8+用人CD8纯化T细胞+T细胞分离试剂盒(Myltenyi Biotec)根据制造商的协议。细胞离心后再悬浮于含有rpmi 1640，10%热灭活fbs，1%rpmi 1640的完全培养基中。L-谷氨酰胺与青霉素链霉素，0.1%的50 mmβ-巯基乙醇，2%的1 M HEPES缓冲液，1%的MEM非必需氨基酸溶液和2%的100 mm丙酮酸钠溶液。用台盼蓝染色法计数细胞总数。流式细胞仪检测平均纯度大于85%。

RNA的提取及文库的制备

总RNA提取从RNeaseMini试剂盒(Chiagen)根据制造商的指示，并通过一个额外的纯化步骤，柱上DNase处理使用RNase-无DNase试剂盒(Chiagen)，以确保消除任何基因组DNA。总RNA质量和浓度用NanoDrop1000分光光度计(热Fisher科学)进行分析，用Qubit计(Invitrogen)进行验证。用Agilent 2100生物分析仪对所有总RNA样品进行降解水平测定(Agilent Tech Inc.)所有样品的RIN值均为≥9.0。从CD8中提取500毫微克总RNA+或CD4+T细胞使用TruSeq链mRNA HT试剂盒(Illumina，UK)根据制造商的指令生成RNA-seq库。简单地说，用聚-T寡聚磁性珠纯化RNA并将其分段，再用两轮纯化，然后进行第一和第二条cDNA链的合成。然后，将cDNA 3‘端腺化，连接适配器，再进行11次文库扩增。利用AMPure XP微球(贝克曼库尔特)进行筛选，用Agilent 2100生物分析仪检测其质量。为了避免批处理效应，样本被随机化，并在HiSeq 2500平台(Illumina，BRC，帝国学院)的12.5车道上运行多路库，生成100 bp的配对尾读。

RNA-seq分析

每个样品平均深度为48 M。测序适配器用Trimmonatic(v.0.36)去除，修整前后用FastQC(v.0.11.2)检查读片质量。读取与人类基因组(GRCh38.primaryAssly.genome.fa；注释：gencode.v25注释.gtf)使用tophat2包(v.2.1.0：-b2-敏感，-库型fr-First链)对齐。平均定位率为92.5%，平均配对阅读数为42.5M(约89%)。利用Picard(v.2.6.0)软件对图谱质量、阅读分布、基因体覆盖率、GC含量和rRNA污染进行了检测。基因水平的读取计数使用HT-Seq-count计算(v.0.6.1，注释：gencode.v25注释.gtf)58严格的“-m交叉-严格”模式。在所有样本中，只有不到10条序列的基因被筛选出为低表达基因，在58,037个总基因中，有16,874个基因被排除在外。使用Rsubread(v.1.30.5)计算了每千伏每百万个外显子读取映射(FPKM)计数的片段矩阵(v.1.30.5)。59和Edger(v.3.22.3)60包裹。用DESeq 2(v.1.14.1)进行组间差异基因表达分析，在1%benamini-Hochberg(BH)调节下1.5倍变化时报告差异表达基因。P-价值。为了可视化样本之间的相似性，使用pcaExplorer进行了层次聚类和主成分分析(v.2.6.0，Https://github.com/federicomarini/pcaExplorer)和phatmap(v1.0.10，Https://CRAN.R-project.org/package=pheatmap)分别包装。用ggplot 2生成差异表达基因的火山图(v.3.0.0，Https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/index.html)包裹。所有原始的rna-seq数据处理步骤都是在伦敦帝国学院Cx1高性能集群计算环境中执行的。进一步分析了R/生物导体环境v.3.4.4(Http://www.R-project.org/).

路径分析

差异表达基因分析采用细胞角杂合Go v.2.3.3。(Http://apps.cytoscape.org/apps/cluego)基于基因本体论(生物过程、分子功能、免疫系统过程)、Interpro、KEGG、Reactome和Wiki通路。术语被称为基于最大限度丰富的术语。P-数值为0.05，重叠率最低为3%。进行Go期融合和分组。根据该集团的进一步排名，邦费罗尼的下岗调整后，对富裕群体进行了进一步的排名。P-价值。在每一组中，小组领导术语被定义为调整后最低的术语。P-浓缩价值。数据集内路径的可视化是使用Cytosscape(v3.6.0)软件进行的。应用CytoscapeReactome功能相互作用应用程序进行靶向代谢途径富集分析。最大错误发现率为0.05的路径被保留为显著丰富。

GSVA和WGCN分析

为确定与疾病活动相关的途径，应用GSVA和WGCNA。T细胞标志与84项临床指标(ACR、BILAG、内科综合评估、SLEDAI、SLICC)、血液参数(抗核、抗dsDNA、抗心磷脂抗体、白细胞减少症)、临床表现(狼疮肾炎分级、其他器官损害等)、治疗(硫唑嘌呤、羟基氯喹、霉酚酸酯等)相关。

GSVA v1.30.0用于了解活动期和非活动期SLE患者之间是否存在特定的生物通路或信号。一个先验定义的基因集是从MSIG数据库(Http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)。简单地说，生成了一个标准化的、日志转换的表达数据矩阵，并根据表达水平对所有基因进行排序。其次，采用Kolmogorov Smirnoff(KS)类随机游走统计方法，对特定样本中的每个基因集进行非参数化的富集评分(GSVA评分)计算。临床类别间的显着性差异用x-平方检验计算。P-低于0.05的数值被认为是显著丰富的。Ⅰ型IFN信号相关基因集的GSVA富集评分(Http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/cards/REACTOME_INTERFERON_ALPHA_BETA_SIGNALING)对基于qPCR的ISM评分进行验证，显示出较高的相关性(r2=0.9132皮尔逊相关系数)。从BioCarta、KEGG和REACTOME数据库中研究I型IFN信号可能影响的代谢途径、GSVA对代谢相关基因集的富集程度。Http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)I型IFN信号相关基因集的GSVA富集评分与Pearson‘s相关。r.

WGCNA版本1.68用于鉴定每个免疫细胞亚群中高度相关的基因。生成一个归一化、对数变换的表达式数据矩阵，作为WGCNA分析的输入.在近似无标度拓扑准则的基础上，选择了一种软阈值功率。P=15表示CD4+T单元数据集和P=16(CD8)+T单元数据集)。构建了基因网络，并从由此产生的拓扑重叠矩阵中识别出模块，其不同的相关阈值为0.01，用于合并模块边界和指定的最小模块大小为n=30。模块被概括为一个模块的网络，然后将其与临床变量的矩阵相关联，并将结果的相关矩阵可视化为热图。采用线性回归和Bonferroni调整法对某一临床性状与一种模块化的艾根烯之间的相关性进行评估，并对其进行多项检验。利用String v.11数据库进一步研究了共表达分析鉴定的基因群组成模块的生物学相关性。Https://string-db.org/)询问蛋白质与蛋白质的相互作用，并对KEGG途径和GO术语进行富集(生物过程)。

QPCR与ISM评分

RNA样品转换为cDNA使用iScript cDNA合成工具包(Bio-Rad，美国)作为制造商的指示.然后在EB缓冲液中稀释cdna，最终浓度为2.5ng/μ1。用POWERSYBR绿色主混合物(应用生物系统，美国)进行实时qPCR反应，探针特异性引物列于补充表中。4。对每个PCR反应，采用5 ng cDNA和0.4M引物，再用8对主混合引物进行PCR扩增。每个样本一式三份。在所有的运行中，每个主混合都包括一个非模板的水控制。用VIIa 7系统机(LifeTechnologies)检测基因表达。PCR方法包括在95°C、10 min和40周(95°C，25 s)和60°C(60 S)下进行热启动，并对每个基因进行单峰熔融曲线检测。用2计算相对基因表达水平。−∆∆CT方法并通过对家养基因的归一化获得。18S核糖体RNA(RRNA)), ACTB(β-actin)，或HPRT 1(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1)。改编自Kennedy等人。的表达式值计算ISM分数。CMP K 2, EPSTI 1，和HERC 5基因和正常使用管家基因HPRT27。ISM评分是从CMP K 2, EPSTI 1，和HERC 5循环阈值(CT)-HPRTCT(ΔCT)值与−1相乘，得到相对log2标度表达式的正确方向性。计算HC和SLE患者ISM值的相对频率分布，确定IFN-Neg SLE患者ISM<0.5，IFN-高SLE患者ISM>1.5。

体外Ⅰ型干扰素治疗与T细胞刺激

PBMCs或CD8+从HC中分离到T细胞(NHSBT)。PBMCs(5.0×10)5)或CD8+T细胞(2.0×10)5在含有10U/ml重组人IL-2(PeproTech)的CM中，将每孔细胞镀入U底96孔板中。细胞用人Ⅰ型干扰素(人干扰素αA/D[BglII]；研发系统，美国；1000 U/ml或其他剂量)或未予处理。提示人T-激活因子CD3/CD 28(珠细胞比为1：4)或未处理的细胞可被吉布科、Dynabeads、人T-激活因子CD3/CD 28处理。细胞在37℃下，在含5%CO的加湿气氛中培养。2培养结束后，用流式细胞术或细胞分类分析方法，对细胞进行细胞外代谢通量分析(见下文)。第7天取CD3/CD 28微球进行再刺激实验，留置细胞过夜。之后，分类纯化CD8+T细胞在2.0×10下再镀5人T-激活因子CD3/CD 28(珠/细胞比)对人T-激活因子CD3/CD 28(珠/细胞比)进行再刺激。4、24h后，用流式细胞仪对细胞进行活化标记染色和分析。用ELISA试剂盒测定上清液中干扰素γ、TNFα和颗粒酶B细胞因子的含量。4根据制造商的协议。

流式细胞术分析

用于流式细胞术的抗体清单见补充表。4。为了将死细胞排除在染色之外，按照制造商的指示，使用了活/死可固定的Aqua染色试剂盒(分子探针，生命技术)。用人TrustainFCX™(Biolegend)在饱和浓度的FC受体阻断液中进行染色。细胞内蛋白染色采用1×BD Fix/Perm™缓冲液(BD生物科学)在4℃培养20 min，用1×BD PERM/Wash™缓冲液(BD生物科学)洗涤细胞，用抗体孵育30 min。用BD Perm/Wash™缓冲液洗涤后，细胞再悬浮于FACS缓冲液(添加0.1%BSA、2mM EDTA和0.09%叠氮化钠)中。

线粒体特异性荧光探针检测线粒体表型(补充表)4). 5 × 105细胞悬浮在200μl的CM中，在一定浓度下用线粒体探针处理。细胞在37℃、含5%CO的加湿气氛中孵育30 min。2在收获前进行流式细胞术分析。所有样本均在LSRFortessa流式细胞仪(BD生物科学，美国)上采集，数据用Flowjo软件Version 10(TreeStar Inc.Ashland，OR，USA)进行分析。

细胞外代谢通量分析

CD4+和CD8+用FACS ARIAⅡ(BD生物科学)对体外培养或第7天培养的T细胞进行分类。用XF细胞Mito应激试剂盒(Agilent Technologies，美国)分析了分离细胞的代谢谱(>95%纯度)。简略，3.0×105细胞悬于XF培养基(SeahorXF RPMI培养基，2mm)。L-谷氨酰胺、1毫米丙酮酸和25毫米葡萄糖)。细胞接种在XF 96平板(美国Agilent Technologies)上，预先涂有22.4 g/ml的细胞-TAK细胞和组织粘合剂(美国康宁)。在37°C下平衡培养1h，用XFe 96细胞外通量分析仪测定OCR(pMole/min)和ECAR(MPH/min)，并对1μM寡霉素、2μM氟羰基氰化物苯肼、1μM鱼藤酮和1μM抗霉素A进行检测。所有测量至少重复三次，每次3-0-3分钟混合等待-测量周期.所有样本分为三次或四次。计算Gubster等人的代谢参数。出版61。第7天对PBMC进行再刺激实验，第7天取CD3/CD 28微球，隔夜不刺激细胞。后来，CD8+T细胞分类，2.0×105细胞悬浮于低糖XF培养基(SeahorxF rpmi培养基，2mm)中。L-谷氨酰胺，1毫米丙酮酸，10毫米葡萄糖)，在XF 96板上预涂22.4克/毫升的细胞-TAK细胞和组织粘合剂。30 min后，将CD3/CD 28微球(4：1)或12-肉豆蔻酸酯(PMA)/离子霉素(终浓度分别为100 ng/ml、500 ng/ml离子霉素)直接注入镀膜细胞。实验持续时间(120 Min)记录eCar和OCR。

ATP定量

分类CD4的ATP含量+和CD8+用生物发光ATP分析试剂盒(ABCAM)评价T细胞。细胞在1×10处重新悬浮6无酚RPMI 1640和50μ1细胞悬液(5.0×10)45 0μ1反应混合物中加入ATP监测酶和核苷酸释放缓冲液。在10×稀释(1000μM~1×10)范围内制备标准−6μM)。用荧光星欧米茄平板阅读器(BMG LabTech，美国)测量了发光。所有样本均为三重样本，ATP水平由标准曲线内插。

线粒体编码dna拷贝数

从细胞分类的CD4中提取总dna。+和CD8+T细胞使用DNAzol试剂遵循制造商的指示(Invitrogen)。MtDNA拷贝数定义为总mtDNA编码的tRNA(mtDNA-tRNA-F：CACCCAAGAACAGGGTTTGT；mtDNA-tDNA-R：TGGCCATGGGTATGTTTTA)拷贝按nDNA编码的B2M(nDNA B2M-F：TGCTGTCTCCATTTTGATGTATCT；nDNA B2M-CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT在10-μ1反应缓冲液中，每引物1μ1(5μM)和动力SYBR绿色PCR主混合液(Invitrogen)5μ1，每反应3 ng/μ1。如上文所述，qPCR是在VIIa 7系统机器(生命技术)上运行的。同时，PCR分级为3μ12O分别作为阴性对照。结果表示为mtdna拷贝数。62.

细胞死亡试验

将SLE患者和HC患者外周血单个核细胞(PBMC)在CM中培养48h。细胞用PBS洗涤两次，然后用FITC-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒(BD生物科学，德国海德堡)进行Annexin V和碘化丙啶(PI)染色。总之，PBMCs被重新悬浮在AnnexinV结合缓冲液中，在含2.5×10的细胞悬液中加入FITC-Annexin(5μ1)。5细胞。细胞悬液经轻轻涡旋混合后，在室温下在黑暗中孵育15 min。随后，加入2 5 0μ1的结合缓冲液和PI(1μ1)，用BDLSRFortessa(BD生物科学，Heidelberg，德国)进行流式细胞术分析。在再刺激实验中，用1μM的CFSE标记前一夜休息PBMC。然后在2.0×10的条件下对细胞进行再镀。5人T-激活因子CD3/CD 28(1：4、1：8或1：16珠/细胞比)；3d后进行PB-AnnexinV(1：100稀释)染色，流式细胞仪分析。

结构照明显微成像

分离CD8+IFN-Neg T细胞(n=3)和IFN-高(n(3)系统性红斑狼疮患者接种多聚体-L赖氨酸涂层高精度覆盖玻璃(1.5h，Marienfeld GmbH&Co.)在室温下，用4%甲醛(w/v)和4%蔗糖(w/v)在50%PBS(GIBCO)中固定20 min。然后用0.1%TritonX-100在PBS(5 Min)中渗透。鱼皮明胶(Sigma，0.2%w/v)用于减少非特异性抗体结合。固定淋巴细胞在4°C暴露于一次抗Tom20(FL-145，sc-11415，Santa Cruz BioTechnology，Inc.)和CD8α(ab199016，Abcamm)的抗体中。洗涤后，用山羊抗兔Alexa 488(Invitrogen)和山羊抗小鼠Alex 568(Invitrogen)标记淋巴细胞，室温下标记1h。细胞核用DAPI染色。幻灯片被安装在反Fade介质Vectashield H-1000(矢量实验室)。用Zeiss Elyra S.1(Carl Zeiss显微成像)对淋巴细胞进行SR-SIM成像，用PLAN-Apochromat 63×/1.4油透镜和浸油(Zeiss Immersol，518°F/30°C)对淋巴细胞进行观察。图像采用五相移和三次网格旋转，z步长为0.1μm，用SCMOS摄像机(pco.Edge 4.2)拍摄。采用以下激光和滤波装置：用561 nm激光激发Alexa 568，用BP 420-480+BP 570-640+LP 740滤波器采集发射光，用488 nm激光激发Alexa 488，用BP 420-480+BP 495-550+LP 650滤光片激发DAPI，用BP 420-480 BP 495-550+LP 650滤波器发射光。图像重建使用ZEN 2012 SP4(黑色)软件，版本13.0.2.518(卡尔蔡司显微成像)。通道对准是通过在相同的图像采集设置下对多色珠子幻灯片进行成像来实现的。用Imaris 9.5.1软件(BitplanAG 9.5.1版)进行三维重建.用Imaris“细胞”工具鉴定CD8。+细胞通过TOM 20荧光通道的阈值产生线粒体的三维表面。表面渲染小于0.025μm3在规模上被认为是背景和排除。线粒体图像也由两名盲目的研究人员进行评分(每个样本14-43张线粒体图像；3份IFN-Neg和3份IFN-高SLE患者)。CD8%+计算线粒体融合后的T细胞总数，将融合后的细胞总数除以每个样本中的细胞总数。

NAD+/NADH测定及体外NMN处理

CD8+用CD8法从HC中分离出水牛皮球(NHSBT)中的T细胞。+T细胞分离试剂盒(Myltenyi Biotec)根据制造商的协议。CD8+T细胞(2.0×10)5每孔细胞被镀入含有10U/ml重组人IL-2(PeproTech)和吉布科Dynabeads人T-激活因子CD3/CD 28(珠细胞比1：4)的CM底部96孔板中，与或不含Ⅰ型干扰素(人干扰素αA/D；美国R&D系统；1000 U/ml)。细胞在37℃下，在含5%CO的加湿气氛中培养。27天。第3天，细胞补充或不添加1mm NMN(Sigma-Aldrich)。培养第7天取CD3/CD 28微球，留置细胞过夜。CD8+采用DynabeadsFlowComp人CD8试剂盒(Invitrogen)对T细胞进行筛选，获得99%以上的纯度，并利用细胞外代谢通量分析仪对TCR(珠细胞比4：1)和PMA/Ionomycin(最后浓度分别为100 ng/ml PMA和500 ng/ml离子霉素)刺激线粒体呼吸反应。(二)NAD+/NADH比值：2.0×106CD8+T细胞被溶解，NAD+/NADH比值按照制造商的指示使用特定的试剂盒(ABCAM，ab65348)量化。所有OD 450 nm值(微版阅读器FluoStar Omega，BMG LabTech，美国)均校正为空白对照组。用OD 450 nm值计算NAD+/NADH比值为：(NAD+/NADH)-NADH/NADH。(三)细胞活力：CD8+T细胞(2.0×10)5人T-激活因子CD3/CD 28(珠/细胞比1：2)再刺激人T-激活因子CD3/CD 28(滴/细胞比1：2)。24h后用MitoSOX红染色，3天后用AnnexinV/PI染色。