恢复期IFN-γELISpot反应的强和广泛性 我们首先用γelispot法检测了新分离的外周血单个核细胞对sars-cov-2的T细胞反应，该方法来自168个经聚合酶链反应证实的sars-cov-2感染的志愿者和112个没有sars-cov-2感染证据的阴性对照者(补充表)。 1 )。免疫酶联免疫吸附试验(ELISA)检测的IgG抗体反应如图所示。 1A 中和抗体的检测结果显示在补充图中。 1A 。首先，我们评估了T细胞对SARS-CoV-2的反应程度，以评估PBMCs刺激后的效应T细胞反应，除非结构的ORF 1外，还有覆盖所有SARS-CoV-2蛋白的重叠肽池(图1)。 1B 和补充表 2 )。我们发现了对包含SARS-CoV-2尖峰蛋白的总结池的反应(12个15-MERS的微型池被称为P1-P12的10个肽重叠)(图1)。 1 b， c )，以及结构和副蛋白(7个18-MERS的池被涵盖E、M、NP、ORF 3、ORF 6、ORF 7和ORF 8的11个肽所重叠)(见图)。 1B，d )。我们还筛选了PBMC，其中含有针对SARS-CoV-2尖峰蛋白(CD4s)和其他病毒蛋白(CD4All)上MHCⅡ类表位的预测的最佳肽，并预测了Ⅰ类结合肽分裂为CD8A和CD8B。 13 (无花果) 1B 和补充图。 1C ).
图1：SARS-CoV-2特异性免疫应答的程度和广度. a 间接ELISA法检测抗SARS-CoV-2血清总IgG抗体滴度 29 在22名血清阴性对照者中，24名无症状和82名轻度症状的医护人员(HCWs)经PCR证实为SARS-CoV-2感染，7名重症或危重PCR患者确认为SARS-CoV-2感染，9名PCR阴性患者为住院对照者，11名为大流行前对照。 b 体外干扰素-γELISpot显示在硅预测池中对sars-cov-2肽池的效应T细胞反应，这些肽池跨越棘蛋白、副蛋白和结构蛋白(E、M、NP、ORF 3、ORF 6、ORF 7和ORF 8)。 10 以及队列中的CEF T细胞控制面板，如 a . c 体内外干扰素-γELISpot显示54名个体志愿者对12个sars-CoV-2尖峰肽池(编号为P1至P12)的效应T细胞反应的大小和宽度。d 73例危重病恢复期伴轻度SARS-CoV-2感染患者M、NP及辅助蛋白ORF 3、ORF 6、ORF 7和ORF 8。 X AXIS显示从症状开始起的天数(不包括刻度)，空白列代表当时被测试个体的零响应。证监会/106 PBMC=每百万外周血单个核细胞形成斑点细胞，背景减去。图显示中位，误差条表示±IQR。对Kruskal-Wallis进行了单因素方差分析，并与Dunn的多重比较检验进行了比较.双尾 P -数值<0.05显示在附表的地块上 3 显示完全的Kruskal-Wallis单向方差，用Dunn的多重比较检验 b 。源数据在源数据文件中可用。
34/75例(45%)健康志愿者的外周血单个核细胞可见IFN-γ对S波池的反应(图)。 1C )对包括P2在内的一些小型游泳池的高频率响应(最高可达313/106 和P8(最高达353个证监会/10 6 (PBMC)我们在65/103(63%)恢复期志愿者中发现了对结构蛋白和辅助蛋白的干扰素-γ反应，尤其是对膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(NP)的反应特别强烈。 1D )。综合起来，SARS-CoV-2特异性反应的广度和幅度都有变化(补充图1). 1B )，并且正在进行的纵向跟踪研究将定义T细胞随时间变化的动态反应。24/29(83%)的疗养志愿者在刺激后也出现干扰素-γ反应，并有4个预测表位。有趣的是，我们发现了对cd8a池的特别高频响应，该池由预测的表位组成，这些表位主要来自大的ocf 1。 13 强调需要进一步探索这一区域的免疫反应(补充图)。 1C )。ELISpot检测的人干扰素-γ反应与ELISA检测的抗尖峰抗体呈显著正相关(Spearman‘s)。 R =0.4587； P < 0.0001) (Fig. 2A ).
图2：抗体与体内外总ELISpot反应的相关性。 a IgG酶联免疫吸附试验(ELISA)和体内外干扰素(IFN-γ)ELISpot检测结果的相关性(英文) n =110)，体内外干扰素-γELISpot反应的相关性 b M蛋白和 c NP和对SPAR，E，M，N，ORF 3，ORF 6，ORF 7和ORF 8的总反应 n =50)，证监会/10 6 PBMC=每百万外周血单个核细胞形成斑点细胞，背景减去。用Spearman秩相关系数进行相关分析，并用双尾Mann-Whitney法对两组进行比较。 U 测试一下。
干扰素-γ对M或NP的应答与T细胞反应相关 对尖峰结构蛋白的加和反应与非尖峰结构蛋白之间存在相关性(Spearman)。 R =0.579， P < 0.0001, Supplementary Fig. 1D )，以及结构和辅助蛋白以及预测的池，表明当一个人对蛋白质组的某一部分产生T细胞反应时，他们很可能会对另一部分产生反应，并且随着时间的推移，反应也会从症状中减弱(补充图1)。1E，1f )。IFN-γ对M或NP的应答与对穗状蛋白、结构蛋白和辅助蛋白的整体反应相关(图1)。 2B，c )，表明一种检测M或NP反应的方法可以反映整体效应T细胞的反应。
我们没有发现干扰素-γELISpot反应与年龄或性别有显着性差异(补充图)。 1g，h )，但还需要包括老年人在内的更大范围的研究来进一步探索。
敏感增殖试验显示记忆反应 由于我们的ELISpot测试是在总PBMCs上进行的，因此不可能区分不同的T细胞系引起反应。此外，ELISpot的敏感性不允许检测所有新冠肺炎患者的反应。因此，我们使用了一种灵敏的、功能强大的流式细胞仪，能够区分CD4。 + 和CD8 + T细胞反应。为此，我们使用T细胞增殖试验进一步了解CD4的贡献和相对熟练程度。 + 或CD8 + T细胞室驱动我们的恢复期HCW队列中的增殖性抗SARS-CoV-2免疫反应。我们首先在一小群健康对照志愿者身上验证了我们的测试，这些志愿者被招募来进行丙型肝炎病毒(HCV)疫苗的临床试验。 22 。我们发现，HCV阴性对照志愿者对涵盖流感、EBV、CMV和破伤风(FEC-T)的最佳肽库(FEC-T)有较强的增殖反应，但对HCV NS3或核心蛋白的多肽无明显影响(附图)。 2A-E )。然后我们评估了CD4的能力。 + 和CD8 + 新冠肺炎恢复期HCW队列中的T细胞会增殖，以响应跨越SARS-CoV-2关键蛋白的肽池。活淋巴细胞被分离成CD4 + 或CD8 + T细胞根据门控策略和增殖细胞的频率分析后，7天的刺激(补充图)。 2A )。我们发现sars-cov-2特异性CD4具有高频率的增殖细胞和广泛的靶向性。 + 和CD8 + T细胞(图1. 3A，b ，补充表 4 和 5 )提示建立一个具有活力的中央记忆群体，它可能影响SARS-CoV-2的回忆反应。大多数人针对M的T细胞反应(69/107，64%的CD4)。 + 50/107，CD8为47% + )，NP(CD4) + 63/107，59%；CD8 + 56/107，52%)和ORF 3(CD4) + 26/107，24%；CD8 + 24/107(22%)，较少发生到ORF 6(CD4) + 4/107，4%；CD8 + 2/107，2%)，ORF 7(CD4) + 11/107，10%；CD8 + 6/107，6%)和ORF 8(CD4) + 13/91，14%；CD8 + 6/91，7%)(如图所示)。 3C，d )。这对检测抗原特异性T细胞反应的敏感性高于体外ELISpot法。虽然我们观察到了CD4细胞增殖的总体趋势 + T细胞对sars-cov-2肽库的反应高于CD8 + T细胞驱动的反应，对除M外的肽池没有显着性意义(P=0.0012)。 U 测试)(附图。 3A )。同样值得注意的是，我们没有发现在应答的CD4的大小上有任何不同。 + 或CD8 + 患有无症状疾病的人的T细胞(在HCW筛查中检测到)与那些有轻微症状的人进行比较(附图)。3B，c )。最后，增殖试验的结果与第二次测定仅4天刺激后上清液中可溶性乳酸的测定结果一致，SARS-CoV-2恢复期志愿者表现出强烈的M、NP和ORF 3定向反应(图3)。 3E )。总之，在我们的恢复期HCWs队列中，我们显示了广泛的T细胞对SARS-CoV-2蛋白的反应，包括尖峰的两个亚基(S1和S2)，以及结构和辅助蛋白。
图3：CD4的增殖反应 + 和CD8 + T细胞对关键的SARS-CoV-2蛋白。 113名志愿者在肽池刺激下增殖细胞的原始频率(无背景减法)图 a CD4 + 和 b CD8 + T细胞至DMSO(培养基)，重叠肽池跨越S1、S2、M、NP、ORF 3、ORF 6、ORF 7和ORF 8。 c 热图显示sars-cov-2蛋白组在CD4中对重叠肽池的增殖反应程度。 + T细胞和 d CD8 + T细胞跟随背景减法。热图上的鳞片代表增殖细胞的大小。只有数据点>1%，对应于DMSO中的平均+2×SD值，这两种CD4值都很好。 + 和CD8 + T细胞显示。灰色框表示由于样品或肽的可得性而没有进行测试的数据。 e 恢复期轻度和无症状性HCWs细胞乳酸增殖反应(英文) n 在第4天出现对M、NP、ORF 3、6、7和8的可变反应。热图显示背景消减反应。每个数据点代表一个志愿者，图显示中间值，误差条表示±IQR。用Kruskal-Wallis单向方差分析，*=<0.001，**=<0.001，*=<0.0001，与邓恩的多重比较检验显示在补充表中。 4 和 5 。志愿人员人数 a –d ：无症状=23，轻度=84，重度=4，临界=2。
特异性CD4 + 和CD8 + 反应分泌多种细胞因子 为了确定T细胞反应的质量，我们在新鲜分离的外周血单个核细胞上使用了由活化标记CD 154、脱颗粒标记CD107a和效应细胞因子IFN-γ、肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-2(IL-2)组成的细胞内染色板。这样就可以同时评估CD4的贡献。 + 和CD8 + T细胞反应以及细胞因子对SARS-CoV-2的反应模式。作为活体ELISpot和ICS检测效应记忆细胞的两种方法，我们首先重点分析了M和NP池的ELISpot响应者(>均值+2SD)。 n 分别为31和41。有代表性的情节如附图所示。 4 。这些人的干扰素-γ、IL-2和肿瘤坏死因子水平如图所示.4A，c 。对于M池，有一个较大的CD4 + T细胞对CD8的反应 + 回应均为IL-2( P < 0.0001 by Wilcoxon’s two-tailed test) and TNF (P =0.031。 4A )。对于np池，CD4表达的IFN-γ、IL-2或肿瘤坏死因子水平无显着性差异(P>0.0 5)。 + 和CD8 + T细胞(图1. 4D )。M和NP反应之间的这种差异并不是由于ELISpot反应的大小不同，因为它们在统计上是相似的(中位数85比95证监会/10) 6 PBMC， P =0.37(由Wilcoxon‘s双尾检验)。这种差异也不是由于无症状性疾病的患者造成的，因为有相似数量的ELISpot阳性的M。 n =8)和N( n =7)。
图4：CD4的ICS反应 + 和CD8 + ELISpot阳性个体M和NP池的T细胞。对轻度恢复期患者和所示肽的ELISpot阳性个体进行ICS检查。用2μg/ml肽刺激外周血单个核细胞6 h。CD4中IFN-γ、IL-2和TNF的表达水平+ 和CD8 + 使用M池的T单元如 a , n =31。条形图代表中位±IQR。用双尾wilcoxon配对配对法对CD4中每种细胞因子进行统计分析。 + VS CD8 + T细胞然后设置布尔门，检测细胞因子在CD4中的表达。 + T细胞( n =9)使用香料( b )。误差条代表细胞因子表达图形的扫描电镜。使用np池的细胞因子的表达水平显示在 c (n =41)对CD4进行多功能分析 + T细胞( d ) (n =4)如上。
然后我们检查了这些细胞共同表达的功能标记的数量。排除那些由于反应水平低而没有足够细胞进行多种细胞因子分析的个体(因为ELISpot中位数水平<100/10)6 两种肽池的PBMC和/或细胞数(特别是CD8) + (T细胞)，我们没有足够数量的个人拥有足够的CD8细胞。+ T分析但做了CD4分析 + T细胞( n =9对M和 n =4(NP)。CD4 + 这两个肽池的T细胞表达多种细胞因子，其中大多数细胞表达一个或两个功能标记物，在CD4中表达最多4个标记物。 + T细胞(图1. 4B，d ).
然后，我们在另外26个SARS-CoV-2PCR阳性个体上使用M，NP，S1和S2池进行ICS实验，比较这些肽池之间的免疫反应(补充图)。5 )。M、s1和s2池均倾向于CD4较高水平的IL-2表达。 + T细胞与CD8细胞比较 + T细胞(附图) 5A，e G， P =0.051， P =0.055， P 分别=0.016。所有这些都是由Wilcoxon的双尾测试完成的。M池刺激还可使CD4显著升高IFN-γ的表达。 + T细胞(附图) 5A , P =0.044(wilcoxon‘s双尾检验)，而np池在CD8中趋向于较高的IFN-γ表达。 + T细胞(附图) 5D , P =0.066)我们再次检测了细胞因子在这些患者中的表达。由于这些人没有使用ELISpot进行筛查，反应水平很低，使我们无法有效地检测CD8。+ T细胞因子表达。然而，有足够的个体有足够的应答细胞来检查CD4。+ T细胞因子在M( n =10)，NP( n =4，S1( n =6)和S2( n =3)。绝大多数细胞表达1~2个功能标记(具有相似的模式)，小群体的细胞表达3或4(补充图)。 5 )。这些结果与上述ELISpot阳性个体相似。
未感染的人对穗有很强的增殖反应。 我们研究了SARS-CoV-2血清阴性对照(图一)。 1A )我们还用IFN-γELISpot、ICS和增殖试验来评价T细胞对SARS-CoV-2肽的反应。与恢复期HCWs相比，SARS-CoV-2特异性干扰素-γ反应在23名阴性健康志愿者的非体内ELISpot测定的任何一种SARS-CoV-2肽池中几乎未见(图一)。 1B )。在这些对照志愿者中，对共同抗原(CEF-T)的反应表明，这些供者的PBMC在启动抗原驱动的免疫应答方面没有固有的缺陷。这一发现，在血清阴性对照志愿者中对SARS-CoV-2肽缺乏反应的发现，由英国谢菲尔德的一个独立实验室在13名志愿者中证实(见图)。 5A )。我们还评估了流感大流行前健康控制档案中冷冻保存的PBMC，并在牛津的19名志愿者中发现了对尖峰蛋白、结构蛋白和辅助蛋白的最小反应(图一)。 5B )以及在预测的表位池中 10 在英国利物浦的48人中(如图所示)。 5C ).
图5：血清阴性对照组的体外ELISpot反应。 体内外干扰素-γELISpot反应的总结SARS-CoV-2肽池跨越棘，副和结构蛋白(E，M，NP，ORF 3，ORF 6，ORF 7和ORF 8)和CEF T细胞控制板。 a 英国谢菲尔德(Sheffield)血清阴性对照组新鲜分离的外周血单个核细胞(PBMC) n =13)，以及 b 英国牛津大学大流行前健康对照者的PBMC冷冻保存( n =19)。 c 硅预测表位池中的体外IFN-γELISpot反应 10 英国利物浦大流行前健康对照者的PBMC冷冻保存( n =48)。响应用背景减法显示，一条线表示响应对背景的平均+2站偏差。
然而，通过对20名血清阴性志愿者进行细胞增殖试验，我们发现CD4的增殖频率很高。 + 和CD8 + T细胞对穗蛋白S1和S2亚基的反应 + T细胞反应17/20(85%)和CD8 + T细胞反应10/20(50%)。 6a，b )。相反，我们观察到弱或无CD4。 + 和CD8 + T细胞对结构蛋白和辅助蛋白(M，NP，ORF 3，ORF 6，ORF 7和ORF 8)的增殖反应(图8)。 6a，b )。由于20名血清阴性参与者于2020年初取样，我们还分析了2008至2019年(英国前COVID 19大流行)15个冷冻保存样本，以排除无症状和未被发现的先前感染的可能性。类似于大流行的血清阴性对照，我们发现ELISpot分析没有或低效应T细胞对任何一种尖峰蛋白、结构蛋白或辅助蛋白的反应(如图所示)。 5B )，但对于大流行的血清阴性对照者，我们通过增殖试验检测到对s1和s2蛋白的强有力的T细胞反应，这两种蛋白在CD4中的宽度更大。 + T细胞与CD8细胞的比较 + T细胞对应物(图1. 6 C， d )。反应显示CD4 + 15/15显示CD4 + T细胞反应，只有8/15显示CD8 + T细胞响应高于本底水平。最重要的是，通过增殖实验检测到的结构蛋白和辅助蛋白的交叉反应非常有限。与恢复期HCW队列一样，我们还用刺激4天后获得的上清液对其中8人进行了细胞乳酸测定。我们证实了对S_1和S_2亚基的交叉反应，以及从M，NP和辅助蛋白刺激的PBMC获得的上清液中不存在或极小的反应(如图1所示)。 6E )。我们比较了不同的sars-cov-2肽池对2020年血清阴性对照、症状性和无症状sars-cov-2 PCR的增殖反应的大小。 + 志愿者(图1. 6f，g )。我们发现对M和NP的S_(S1)和S_2-反应没有差别，但两者对M和NP的增殖反应较高。 + 和CD8 + T细胞和CD8中的ORF 3和ORF 8 + T细胞只存在于检测SARS-COV-2阳性的人群中(如图所示)。 6f，g )。为了证实，我们还比较了非典-COV-2血清阴性对照的增殖T细胞反应的大小，并发现这两个血清阴性组的增殖细胞数量相似(补充图)。 6a，b )。这些结果，除了我们先前的研究结果，谁没有产生效应T细胞反应的尖峰肽在干扰素-γELISpot分析(图一)。 1B 和 5A，c )，证明增殖性T细胞记忆在SARS-CoV-2早期存在的T细胞库中形成尖峰蛋白的一致证据。
图6：2020年血清阴性对照和前COVID 19大流行的交叉反应性T细胞反应。 a 显示CD4的热图 + 和 b CD8 + 健康血清阴性对照组新鲜PBMC T细胞增殖反应(英文) n =20)。 c 显示CD4交叉反应反应程度的热图 + 和 d CD8 + T细胞在低温保存样本中的反应-COVID 19大流行( n =15)。只有数据点>1%，对应于DMSO中的平均+2×SD值，这两种CD4值都很好。 + 和CD8 + T细胞在热图中显示。 e 热图测量了两名健康的血清阴性对照在第4天的乳酸增殖反应，显示了对尖峰的强烈反应(为便于观察，所有S1和S2值除以2)，以及对SARS-CoV-2肽池的小而可变的反应。f CD4肽池对SARS-CoV-2蛋白特异性增殖反应的比较分析 + 和 g CD8 + 传染性非典型肺炎-CoV-2型血清阴性对照人群中的T细胞及聚合酶链反应 + 志愿者。绘制的所有数据都是背景减去的(志愿者人数：2020年血清阴性控制=20，大流行前血清阴性=15)。为了进行统计比较，包括了所有组的所有数据点。每个数据点代表一个志愿者，图显示中间值，误差条表示±IQR。两组比较采用双尾曼恩-惠特尼法。 U 测试一下。
在我们的数据中，对照组对尖峰蛋白的健壮的T细胞记忆反应是明确的，这与最近的一项研究一致，该研究使用不同的检测系统评估了交叉反应性。 21 解决的问题，这是否反映了先前暴露在HCoV。为了进一步探索这一点，我们首先用血清学方法测试了我们的队列，并发现了四种循环hcov的普遍高暴露，这在其他研究中也可以看到。 9 ,10 ,11 ,18 ,19 ,20 ,21 (补充图。 7 )。接下来，我们在9-聚肽水平上讨论了S和HCoVS的同源性，并将其与M和NP(补充图)进行了比较。 8A )每个穗、NP和M蛋白的中位排列评分分别为8.5、7.5和6.5，这表明SARS-CoV-2尖峰蛋白肽相对于HCoVS而言比M和NP蛋白更保守(Mann-Whitney)。 U 试验 P -价值观：S与S N < 2.2 × 10−16 ，S对 M < 2.2 × 10−16 )。另外，针对3种蛋白质中大多数同源肽的前5%(排列评分>18.5)，我们观察到61%、20%和19%的肽分别存在于S、NP和M蛋白中。最后，由于直接交叉反应已经显示在61个sars-cov-2衍生肽的关键水平。 21 我们评估了这个数据集在多大程度上支持了对这些来自S抗原和非S抗原的肽的增强反应。我们观察到了向S的强烈倾斜。 P < 0.0001 by two-tailed Welch’s ANOVA), with such peptides distributed in both S1 and S2, as seen in this study (Supplementary Fig. 8B，c )。总之，这些数据表明，S包含一个具有明显保守性和交叉反应性的T细胞表位，在对类似HCoV暴露的人群的独立分析中，与T细胞对S的共同反应性有关。
血清阴性接触医护人员T细胞反应的研究 最后，为了探讨如何使用这些T细胞分析来识别可能接触sars-cov-2的人，我们招募了10名在急性药物领域工作的高度暴露的医护人员，他们的症状与新冠肺炎相符，但在出现症状时没有接受过PCR检测，或检测为阴性，随后呈阴性(补充表)。 6 )。其中3/10的医护人员对S1、S2、M或NP有效应T细胞反应(图1、S2、M或NP)。 7A 8/8的人在增殖试验中显示M和/或NP特异性T细胞反应与先前感染相一致(图1)。 7b，c )。应答CD4靶向SARS-CoV-2抗原的宽度分析 + 和CD8 + T细胞显示，在高度暴露的医生中，CD4 + 和CD8 + T细胞的反应是针对更多的结构(M和NP)和附件(ORF 3，6，7和8)SARS-CoV-2肽池。 7D，e )。这对两者都有统计学意义。 + 和CD8 + T细胞与血清阴性对照组比较(图1)。 7D，e )。最后，我们比较了三组患者T细胞对SARS-CoV-2结构蛋白和辅助性蛋白的反应程度--高暴露HCW、2020年血清阴性对照和大流行前血清阴性对照(合并为一组)。我们发现CD4值更高 + 但在高度暴露的医生中，CD8+T细胞对M、N、ORF 3、6、7和8没有反应(见图)。 7F，g ).
图7：高暴露阴性对照组的T细胞反应。 a 非体内干扰素-γELISpot反应总结SARS-CoV-2肽池(E，M，NP，ORF 3，ORF 6，ORF 7和ORF 8)。反应用背景减去显示， n =10。 b 显示CD4的热图 + 和 c CD8 + 高暴露HCW人群T细胞增殖反应。所有绘制的数据都是背景减去的， n =8(两个单元格不可用)。 d CD4对sars-cov-2结构蛋白和辅助蛋白的反应范围 + 和 e CD8 + 增殖T细胞。 f 应答CD4的大小 + 和 g CD8 + T细胞为SARS-CoV-2(M，NP，ORF 3，6，7，8)的结构蛋白和辅助蛋白。每个数据点代表一个志愿者，图显示中间值，误差条表示±IQR。两组比较采用双尾曼恩-惠特尼法。 U 测试一下。用†对冻存标本进行ID测定。对第7和第10个体不进行增殖试验。N =35用于联合控制。
