膜淋巴毒素-α2β是一种新型的肿瘤坏死因子受体2(TNFR 2)激动剂

20世纪90年代初，人们认为ltα和ltβ形成ltα。2β和LTαβ2异三聚体分别与TNFR 1和LTβR结合。之后，ltαβ2LTβR系统在LTα中得到了广泛的研究。2到目前为止，β-tnfr 1的相互作用被忽略了，这大概是因为在识别ltα的时候2β-TNFR 1相互作用-一种已知的TNFR 1配体，即TNF和LTα。这里，我们展示了ltα2β不仅与TNFR 1相互作用，而且与TNFR 2相互作用。我们进一步证明了膜结合的ltα。2β(memltα)2(β)，尽管它的不对称结构，刺激TNFR 1和TNFR 2信号。考虑到它与TNFR 2，ltα交互的能力，这并不令人惊讶。2β受Etanercept的抑制，可用于治疗类风湿关节炎，也可抑制肿瘤坏死因子(TNF)和肿瘤坏死因子(LTα)。

肿瘤坏死因子(TNF)超家族(TNFSF)的配体具有C端TNF同源结构域(Thd)的特征，它促进(I)组装成同质三聚体，在少数情况下还具有异三聚体、分子和(Ii)与肿瘤坏死因子受体超家族(Tnfrsf)受体的结合。1,2。TNFSF配体(TNFLS)是一个结构相对均一的蛋白质家族。1,2。除淋巴毒素-α(LTα)外，所有TNFL最初以II型跨膜蛋白的形式表达，其中胞外THD通过“茎”区连接到跨膜结构域和胞内结构域。一些TNFL也以可溶变异体的形式出现，这些变异是由膜结合分子在“茎”区域加工而产生的。由于可溶性的TNFL，包括LTα，含有THD，这些分子也以三聚体的形式出现。虽然ltα原生质体不具有跨膜结构域，但它们可以通过形成具有淋巴毒素β(ltβ)的异三聚体分子而被膜结合。3,4,5,6。事实上，除了对tnff的所有配体都描述了ltβ外，研究得很好的同质三聚体分子变体，也有几种已知的情况，其中两个不同的配体聚集在一起形成稳定的异三聚体分子。除了已经提到的ltα-ltβ异质三聚体之外，还描述了baff-4月和baff-tw异质三聚体。7,8。由于其内在的不对称性，TNFSF的异三聚体配体不可避免地有三个不同的受体相互作用表面(图1)。1)。这三个相互作用区中的一个对应于在两个对应的同型三聚体TNFL中可以找到的同型相互作用区域之一(如图所示)。1)。另外两个异型受体相互作用表面(即由不同的原生质体形成)与两种可能的异三聚体配体构型是不同的和共同的。1).

在关于ltα-ltβ异质三聚体的初步研究文献中，对ltα进行了描述。2β和LTαβ2LTα与可溶性ltβ异位共表达后形成异源三聚体。4,6。用一组不同的ltα抗体进行的系统fcs分析也证明了膜结合的两种不同形式的存在，从而证明了ltβ结合ltα的存在。3。早期的研究表明，重组产生的ltα-ltβ异质三聚体仅与ltα结合。2β到tnfr 1，但没有发现与ltβR的绑定，后者与ltαβ相互作用。2但与LTα同型三聚体或肿瘤坏死因子无关。LTα2因此，β物种LTα-LTβ异质三聚体至今尚未受到任何进一步的关注.目前还没有对ltα进行研究。2β激活tnfr 1信号，也不清楚ltα是否激活tfr 1信号。2β绑定并激活TNFR 2。

这里，我们展示了ltα2β能够触发TNFR 1信号，尽管与LT、α和TNF同型三聚体相比，该受体的价态降低。我们还证明了可溶性和跨膜的ltα。2β与TNFR 2交互。更有趣的是，我们发现跨膜ltα2β强烈激活TNFR 2信号。因此，我们鉴定了跨膜ltα。2β作为一种新型的TNFR 2激动剂。

TNFR 1和TNFR 2与LTα相互作用2β异质体

初步确认已报告的ltα的结合2β异源三聚体与TNFR 1共表达可溶性ltα与含N端的可溶性ltβ(sltβ)白花草荧光素酶报告域，并分析了产生的细胞培养上清液与TNFR 1和LTβR结合的结合情况。2A-C)。我们在这个分析中还包括了tfr 2，其中包括了与ltα的交互。2到目前为止，还没有对β异质体进行评估。为确定含GPL-SLTβ的配体与TNFR 1、TNFR 2和LTβR的结合情况，将TNFR 1(TNFR 1)、TNFR 2(TNFR 1)和LTβR(LTβRed-GPI)或空载体(EV)的内源性表达缺失的HEK 293 T细胞瞬时转染TNFR 2-GFP融合蛋白、糖磷脂酰肌醇(GPI)-锚定变异体TNFR 1(TNFR1ed-GPI)和LTβR(LTβRed-GPI)或空载体(EV)。与eV转染的细胞相比，转染编码各种β变异体的HEK293T细胞均表现出与含GPL-SLT的配体物种有很强的结合(如图1所示)。2C)。可溶性肿瘤坏死因子能有效阻断含GPL-SLTβ的细胞与TNFR1ed-GPI表达细胞的结合，而阻断配体的抗TNFR 2抗体和阻断配体的βR-特异性Fab对GPL-SLT的表达无明显影响(图1)。2C)。同样，可溶性肿瘤坏死因子和配体阻断抗TNFR 2抗体几乎完全阻断了含β的GPL-SLT配体与TNFR 2-GFP表达细胞的结合，而阻断TNFR 1-和LTβR-特异性法氏囊则无抑制作用(图1)。2C)。最后但并非最不重要的是，肿瘤坏死因子或TNFR 1特异性Fab和阻断的TNFR 2特异性抗体均不干扰含GPL-SLTβ的配体与LTβ红-GPI表达载体的结合，而阻断配体LTβR-特异性Fab则显著降低了这种结合(如图1所示)。2C)。因为ltαβ是公认的2不与其他TNFR交互，并且LTβ同型三聚体不稳定/功能(另见图)。2B)，这些数据证实了sltα的形成。2LTα-和LTβ共表达细胞中的TNFR 1与TNFR 1相互作用。此外，这些数据同样认为sltα2β异质体与TNFR 2相互作用。为了进一步证实TNFR 2与含GPL-SLTβ配体相互作用的证据，我们分析了与稳定表达TNFR 2的细胞的结合。为此，我们使用稳定的HeLa-TNFR 2转染基因，表达APP。2000年TNFR 1分子和5万TNFR 2分子9表达APP的Kym-1细胞。1000-3000 TNFR 1分子和30,000 TNFR 2分子10。同样，含β的GPL-SLT配体与这些细胞有很强的结合.根据TNFR 1和TNFR 2的不同表达水平，抗TNFR 2抗体(而不是抗TNFR 1-Fab)减少了含GPL-SLTβ-Fab配体的结合(图1)。二维空间)。用抗LTβR-Fab阻断HeLa-TNFR 2细胞内源性LTβR-Fab也使其结合减少，三种阻断剂的混合物均显著抑制含GPL-SLTβ配体的结合(如图1所示)。二维空间).

接下来，我们想知道LTα和膜LTβ是否也形成了TNFR 1和TNFR 2相互作用的杂多体。为了阐明这一问题，我们在HEK293T细胞中瞬时共表达了LTα和memLTβ，并分析了由TNFR 1、TNFR 2、LTβR和C端β报告域(TNFR1ed-GPL、TNFR2ed-GPL、LTβRed-GPL)组成的可溶性β融合蛋白的结合情况。3A)。结果表明，三种TNFRed-GPL融合蛋白均与共表达LTα和memLTβ的细胞特异性结合。3B)。过量的可溶性肿瘤坏死因子可抑制可溶性TNFR1edGPL和TNFR2edGPL分子与LTα/memLTβ共转染细胞的结合，但对LTβ红GPL结合无明显影响。3B)。这不仅与已建立的ltβR相互作用膜结合ltαβ的形成相一致。2异质三聚体(memLTαβ)2)，同时也表明了膜结合ltα的相互作用。2β分子(memLTα)2(β)与TNFR 1和TNFR 2。

单链编码memltα2β异质体激活TNFR 1和TNFR 2

更具体地研究memltα的相互作用2β与两种肿瘤坏死因子受体融合后，通过基因工程方法融合mmltβ原生质体和2条ltα原生质体，获得膜结合单链编码的ltα。2β(mem(Sc)ltα)2β)。为了进行比较，我们在我们的调查中酌情包括了单链编码的memltαβ。2(MEM(Sc)LTαβ)2)和MemTNF(图1.4A)。FLP-在HEK 293细胞中不表达内源性LTβR或TNFR 2，只表达低水平的TNFR 1(补充图)。1)，稳定转染mem(Sc)ltα。2β和MEM(Sc)ltαβ2编码表达质粒，使克隆具有大致相似的配体表达(如图所示)。4B，补充图。2)。流式细胞术显示MFI的变化约为10倍和50倍(如图所示)。4B)，在参考文献中所观察到的范围内。3用于内源性表达总LTα-LTβ异质体。即使抗体的染色效果存在一定程度的差异，这也表明稳定转染细胞的表达水平并不高。我们认为表达TNFR 1和TNFR 2的TNFR 1和TNFR 2结合阳性对照是膜TNF(MemTNF)表达的阳性对照。为此，我们使用了以前描述过的Cho-Δ(1-12)肿瘤坏死因子。11稳定的CHO转染物表达一个非切割的膜TNF缺失突变体(图)。4B)。可溶性ltβ红gpl、tnfr 1ed gpl和tnfr 2ed gpl的细胞结合研究揭示了mem(Sc)ltαβ的唯一相互作用。2与ltβ红-gpl(图1.4C)。相反，mem(Sc)ltα2β-和表达肿瘤坏死因子的细胞结合TNFR1ed-GPL和TNFR2edGPL。4C)。值得注意的是，mem(Sc)ltα2β的表达也显示了一些LTβ红GPL的结合。4C)。接着，我们分析了mem(Sc)ltα的能力。2β和MEM(Sc)ltαβ2异三聚体触发TNFR 1和/或TNFR 2激活。为此，我们在HEK 293 mem(Sc)ltα中共同培育了flp-。2β和flp-in HEK 293 mem(Sc)ltαβ2转染细胞和相应的对照细胞与(I)HeLa细胞，只表达TNFR 1，(Ii)HeLa-TNFR 2转染细胞。9，表达TNFR 1和TNFR 2，(Iii)HeLa-TNFR 2-TNFR 1高HeLa-TNFR 2细胞的衍生物，只表达TNFR 2(补充图)。3A，B)。单独刺激TNFR 1和TNFR 2可导致HeLa细胞产生IL8，ELISA可以直接定量。3C)。结果表明，mem(Sc)ltαβ2-在所有三种HeLa变体中都有表达细胞，这是非常轻微的IL8反应(图一)。4D)。这与LTβR在HeLa细胞中难以检测到的表达是一致的。相比之下，mem(Sc)ltα2表达β的转染子在所有三种HeLa变异体中都能诱导出较强的IL8生成，表明该变异体能够刺激TNFR 1和TNFR 2信号(图1)。4D)。IL 8表达上调反映了经典NFκB通路的激活，TNFR 1和TNFR 2可激活该通路。我们还测试了mem(Sc)ltα的能力。2β可引起坏死和凋亡。我们最近发现，fdd缺陷的hla-ripk 3基因转染者对tnfr 1引起的坏死高度敏感。12。这些细胞与mem(Sc)ltα的协同激活2表达β的转染可诱导细胞死亡，RIPK 1抑制剂NEC-1可阻止细胞死亡，从而阻止RIPK 1的坏死激活(如图1所示)。5A)。相反，如预期的那样，PAN-caspase抑制剂zVAD没有显示出保护作用。5A)。我们还检测到hela-ripk 3与mem(Sc)ltα的共培养物中RIPK 1 s 166磷酸化，这是一种坏死信号的标志。2β在Hek 293对照细胞中表达，但不与FLP-共培养。5B)。同样，mem(Sc)ltα2β表达细胞诱导Kym-1细胞死亡和caspase活化(图一)。5C，D)，这是一个成熟的细胞系统，在这个系统中，两个肿瘤坏死因子受体协同诱导细胞凋亡。13,14。因此，尽管TNFR 1/2结合具有不对称性质和价态降低，但mem(Sc)ltα2β能够触发TNFR 1和TNFR 2信号。毫不奇怪，鉴于这些结果，mem(Sc)ltα2β诱导的TNFR 1和TNFR 2的激活被Etanercept所抑制。4)，一种人TNFR 2外显子区的二聚体Fc融合蛋白，广泛应用于临床治疗类风湿关节炎。

异三聚体TNFLs的内在不对称性导致三种不同的受体相互作用表面(图1)。1)。TNFR 1和TNFR 2不具有或仅弱结合LTαβ2。后者与ltα没有相同的受体相互作用区域。3同三聚体但与ltα共享2β异源三聚体LTα和LTβ之间形成的两个不同的异型受体相互作用面。1)。由此可以得出ltα的结论。2β仅/优先结合TNFR 2与其在两个LTα原生子之间形成的单个同型受体相互作用面。我们还观察到gpl-s(Sc)ltα的残余结合。2βto ltβR.，从所知的关于ltαβ之间的交互的角度来看，这是有意义的。2和ltβR.单链编码ltαβ之间的结构数据。2异三聚体和ltβR表明，后者的两个分子与scltαβ相互作用。2分子：当一个结合在两个ltβ原生子之间形成的单个同型受体相互作用表面时，第二个结合到两个不同的异型受体相互作用面中的一个。15。因此，可以预期ltα2β与它的一个异型受体相互作用表面与LTβR结合，这与我们的结合数据是一致的。

TNFR 1和TNFR 2在调节获得性免疫和适应性免疫中起着至关重要的作用，在类风湿关节炎、多发性硬化症、克罗恩病和银屑病等自身免疫性疾病的发生发展中起着至关重要的作用。在此背景下，了解tf、ltα和ltα的相对贡献将是非常有趣和重要的。2β在体内对两种肿瘤坏死因子受体的生物学和病理生物学进行了研究。然而，用现有的工具和实验方法很难对这方面进行研究。因此，没有抗体可以区分ltα。2β来自ltαβ2和LTα3。LTα的体内鉴定研究2β介导的效应更具有挑战性，因为ltα或ltβ的敲除(也包括异位表达)也不可避免地影响ltαβ。2生物学。α的间接研究2β介导的TNFR 2激活是可以想象的，使用敲除模型。考虑到ltα不激活tffr 2这一事实，通过对tfn基因敲除小鼠和tff 2双缺陷小鼠的比较，可以为mmltα的研究提供理论依据。2β诱导的TNFR 2活性，例如，在调节性T细胞的生物学背景下，TNFR 2似乎起着重要的作用。16。然而，对于这样的研究，首先必须澄清小鼠的ltα。2β具有类似于人ltα的受体结合特性。2β在我们的研究中进行了检查。

细胞系和试剂

HEK293T，HeLa，HeLa-TNFR 2，HeLa-TNFR 2-TNFR 1高，HeLa-RIP3-FADD高、Kym-1和CHO细胞，以及稳定的CHO转染体，表达一种不可切割的突变型膜肿瘤坏死因子(Cho-Δ(1-12)tf)。11细胞在含10%胎牛血清(GIBCO)的RPMI 1640培养基(Sigma-Aldrich，德国)中培养。在DMEM培养基(德国Sigma-Aldrich，德国)中培养Hek-FLP及所有转染细胞。对于细胞中的HEK FLP，而不是转染的细胞，培养基中添加100 g/ml的Zeocin。TM(Thermo Fisher Science，MA，美国)。本研究使用的抗体是从以下供应商购买的：BD生物科学，美国NJ(抗PARP，551025；抗RIPK 1,610459)，细胞信号传导，MA，美国(抗P-RIPK 1,65746 S；抗Caspase-9,9502 S，Enzo生命科学，德国(抗Caspase-8，ADI-AAM-118-E)，圣克鲁斯生物技术，美国圣克鲁斯，CA，美国(抗肿瘤坏死因子β(β=ltα)(E-6)，sc-28345)，德国西格玛-奥尔德里奇(抗小鼠IgG(全分子)，R-PE-标记，P 9670；抗β-Aktin，A 1978年)和美国热费希尔科学，MA(抗-TNFα，PE-标记，#12-7349-82)。在pCR 3表达载体(Invitrogen，德国)或pcDNA5/FRT(Thermo Fisher Science，MA，USA)中克隆相应的DNA片段和PCR扩增或组合，获得编码抗体、抗体片段、TNFRSF受体和各种TNFSF配体变异的表达质粒。得到的蛋白质的氨基酸序列在补充表中显示。I.

产生稳定的细胞系

稳定表达mem(Sc)ltα的HEK 293基因2β和MEM(Sc)ltαβ2建立FLP/FRT系统。为此，在DMEM+10%FCS的10 cm组织细胞培养板上进行FLP-in-HEK 293细胞培养，至60~70%汇合。然后，每盘加入1ml无血清DMEM培养基，加入3g重组酶编码质粒pOG 44和3g pOG 44(阴性对照)或空载体质粒pcDNA5/fRT或mem(Sc)ltα。2β和MEM(Sc)ltαβ2编码pcDNA5/FRT的衍生物。在滴加18升1 mg/ml聚乙烯亚胺(PEI，PolyScience Inc.，Warrington，USA)溶液后，将混合物在室温下漩涡培养10~15 min。用DNA/PEI混合液和7ml无血清DMEM培养基代替HEK 393平板上的培养基。第二天加入75 g/ml潮霉素(德国默克，400051)和10%的FCS，筛选稳定的转染细胞。当所有细胞在阴性对照中死亡时，pcna/frt，pcdna/frt-memltα的存活细胞。2β和pcDNA/frt-memLTαβ2输血用于有限稀释。最后，用流式细胞术对克隆进行分析，检测膜结合LTαβ异质体的表达.

抗体、抗体片段、TNFRSF受体和TNFSF配体的表达、产生和纯化

用聚乙烯亚胺(PEI，PolyScience Inc.，Warrington，USA)将感兴趣的表达质粒瞬时转染HEK 293 T细胞。17,18,19。转染TNFRSF受体或膜结合TNFSF配体的细胞在转染后1、2天进行结合研究和流式细胞术检测。对于分泌蛋白的产生，所有这些都带有一个标志表位，转染1d后，将含有PEI/DNA的转染培养基替换为添加2%FCS的RPMI 1640培养基。5-7天后，离心(10 min，4630×)清除细胞碎片上清液。g)。蛋白质浓度的测定采用Westernblotting方法，并与已知浓度的标记蛋白标准稀释系列进行比较。构造包含白花草荧光素酶报告域用于结合研究，无需进一步纯化。其他蛋白质经抗国旗亲和层析纯化后，如其他文献所述。17。纯化蛋白的纯度和浓度由SDS-PAGE控制，用皮尔斯银染色试剂盒(ThermoFisher Science，MA，美国，24612)和已知浓度和分子量的蛋白质标准蛋白(SDS-PAGE电泳、GE Healthcare)对凝胶进行银染(12.5%)。

结合研究

GPL标记的可溶性配体与细胞表达的TNFRs的结合

将TNFR表达质粒(HeLa-TNFR 2或Kym-1)瞬时转染HEK293T细胞，在1.5ml安全闭锁管(0.5~1.5×10)中进行诱导。6细胞/管)。用阻断TNFR 1-、TNFR 2-或LTβR-特异性抗体或抗体片段在37℃时预处理30 min。用LTα和GPL-SLTβ或GPL-SLTβ瞬时共转染HEK 293 T细胞上清孵育1h，离心4次(1 min，13,000 rpm)，再悬浮于冰冷pBS中，再悬浮于50升RPMI 1640+0.5%FCS培养基中，测定GPL活性。为此，将细胞转移到黑色96孔板上，并在pBS中加入25μl的GPL分析液(1.5M Coelenterazin(德国卡尔·罗斯，4094.3))。用PHOMO光度计立即测量荧光素酶活性(每井1s)(安托斯·米克罗兹，德国)。

GPL标记的可溶性受体变异体与膜结合TNF配体的结合

瞬时转染编码ltα和memltβ或空载体(Ev)或flp-in-HEK 293-mem(Sc)ltα的表达质粒的HEK 293 T细胞。2β，flp-in-HEK 293-mem(Sc)ltαβ2，取FLP-in-HEK 293-EV或CHO和CHO-Δ(1-12)肿瘤坏死因子细胞，在1.5ml安全闭锁管(0.5~1.5×10)中进行诱导培养。6细胞/管)。用20 g/ml肿瘤坏死因子在37℃下预处理30 min，细胞与含TNFR 1ed-、TNFR 2ed-和LTβRed-GPL的上清液共同孵育1h(37°C)。去除未结合分子后，离心4次(1 min，13,000 rpm)，测定细胞GPL活性。通过减去来自空载体控制细胞的非特异性结合值，从表达配体的细胞获得相应的总结合值，获得特异性结合。用GraphPad Prism 5软件进行数据分析。

流式细胞术

为控制肿瘤坏死因子受体(TNF受体)和膜结合型TNF配体的瞬时表达和内源性表达，取细胞用PBS洗涤。细胞(0.3~2×10)6细胞在PBS中再悬浮，用PE标记的感兴趣抗体或合适的PE标记的同工型对照抗体在冰上孵育1h，并按供方推荐的稀释/浓度进行处理。用PBS洗涤去除未结合抗体后，用Attune NXT流式细胞仪(Invitrogen，CA，USA)对细胞进行分析。

IL8 ELISA

将感兴趣的细胞接种在96孔板中。第二天，该培养基被含有感兴趣的试剂或刺激细胞的新鲜培养基所取代。一天后，用BD OptEIA分析上清液中IL8的表达情况。TM人IL8-ELISA试剂盒(BD生物科学，NJ，美国)。

死亡和凋亡的测定

贴壁反应细胞在96孔板中播种。第二天，应答细胞(HeLa-RIPK3-FADD)高，kim-1)被刺激细胞(例如mem(Sc)ltα)所激发。2β和MEM(Sc)ltαβ2用2.5g/mlCHX预处理细胞，诱导细胞凋亡。为证明细胞存活率下降是由于细胞坏死或凋亡所致，加入90 M NEC-1抑制坏死，或加入20 M-zVAD以防止细胞凋亡，可使细胞存活。用结晶紫染色法定量活细胞，Western blot分析RIPK 1 S 166磷酸化，caspase-8和caspase-9以及PARP和β-Aktin的裂解，进一步证实了细胞死亡的发生。在最后分析之前，mem(Sc)ltα2β和MEM(Sc)ltαβ2细胞培养塑料或贴壁反应细胞粘附性差的转染细胞，用PBS一次清洗即可去除。