免疫聚焦体液免疫增强AnAPN 1疟疾传播阻断疫苗抗原的功能效果

疟疾传播阻断疫苗(TBVS)阻止蚊子媒介内疟原虫发育周期的完成，有效地阻断随后的感染。蚊中肠蛋白按蚊丙氨酸氨基肽酶N(AnAPN 1)是主要的以蚊子为基础的TBV抗原。结构功能研究确定了两个II类表位，可以诱导强传递阻断(T-B)抗体，为下一代AnAPN 1的设计提供信息。在这里，我们从功能上筛选了新的免疫原，并筛选出具有两个甘氨酸连接的T-B表位拷贝的UF6b结构。然后，我们建立了UF6b的制备工艺，并在近交系雌性CD1小鼠中，以人安全佐剂Gluopyranosyl Lipid佐剂(GLA-LSq)作为脂质体制剂，对临床前产物的免疫原性进行了评价。UF6b：GLA-LSq有效地使体液对一个关键的T-B表位产生了强烈的T-B活性，强调UF6b是帮助消灭疟疾和消灭疟疾的首选TBV候选基因。

2019年疟疾造成约405 000人死亡，主要是撒哈拉以南非洲五岁以下儿童死亡。1。为了消除和根除疟疾，我们必须利用协调一致的办法减少临床疾病和预防新病例。疫苗被认为是消除和根除战略的一个主要组成部分。然而，rts，S(Mosquirix™)是在某些非洲国家推出的最先进的疟疾疫苗，它减少了临床疾病，但没有预防新病例。虽然这种疫苗是对抗疟疾的重要一步，但单靠它本身并不能最终支持消灭疟疾，因为它不能完全防止疟疾的传播。2,3,4.

这个疟原虫导致疟疾的寄生虫在雌性体内有一个强制性的发育周期。按蚊蚊媒，从蚊子感染雄性和雌性开始。疟原虫被感染的人类血液中的配子体细胞。在蚊子血粉团内，配子细胞转化为雌雄配子，它们结合在一起形成运动的合子(软体动物)，这种合子必须先附着在中肠上皮上，然后穿过肠细胞，在中肠板下形成卵囊。在两周内，成熟的卵囊破裂，释放数以千计的子孢子，被被动地输送到唾液腺。疟疾寄生虫的传播一旦感染蚊子注射含子孢子的唾液液，同时从一个天真的人类宿主那里采血，疟疾寄生虫的传播就完成了。

阻断传播疫苗(TBVS)的作用是阻止疟原虫孢子体在蚊子体内的发育，从而破坏传播周期(图1)。1A)2,3,4,5。因此，它们还具有防止已产生耐药性的寄生虫传播的额外好处。2,6。作为对RTS，S，TBVS的补充干预，可以通过减少接种人群中寄生虫的突破传播来扩大RTS，S疫苗的效用。2,3,4,5,6,7。几辆TBV的目标疟原虫蛋白质已经在临床上测试过了，以寄生虫为中心的疫苗本质上是特定物种的，需要生产和验证几种疟疾疫苗模式。2,3。相比之下，针对一种在蚊子中肠中起寄生虫受体作用的保守蚊子蛋白的泛疟疾tbv，可能解决以寄生虫为中心的疫苗固有的局限性。

蚊子中肠表面蛋白按蚊氨肽酶N(AnAPN 1)是一种先进的、以疟原虫为基础的tbv候选蛋白。7。抗此蛋白N端结构域的抗体可防止恶性疟原虫通过中肠壁进入卵囊，阻止寄生虫的进一步发育和传播。7,8,9,10。我们先前的研究表明，抗anapn 1抗体可以完全(100%)阻断自然循环的传播。恶性疟原虫在喀麦隆7,8,9,10。通过对AnAPN 1晶体结构的求解，我们确定了两个构象和保护性的T-B表位，第7和第9肽，以及一个非保护性表位肽1。7,8。肽1包括一个免疫显性的小鼠CD4+T细胞表位，使它成为一个“免疫诱饵”，并以强大但不具有保护性的抗体效价引起显著的体液反应。8。单抗7肽的单克隆抗体8，而仅针对肽9的多克隆抗体都能产生很强的T-B活性。7。因此，开发一种疫苗制剂，在消除非保护性肽1的同时，促进对目标肽7或肽9的高度集中和功能性体液反应，具有很大的潜力成为一种有效的TBV。

为了获得最优的疫苗配方，我们假设从AnAPN 1 TBV(135个氨基酸重组AnAPN 1)最初的135个氨基酸亚结构域设计的特异性改变免疫原设计。7,8将体液免疫反应集中于关键肽表位(肽7和9)，增强T-B活性，从而使较低的抗体效价达到强的T-B活性。在这里，我们报告了第二代AnAPN 1构建物的免疫和功能筛选结果，该结构不包含小鼠免疫显性肽1表位，并且能够使脊椎动物体液对关键T-B表位产生免疫反应。在本研究中，我们不仅证明了所选的第二代anapn 1结构(Uf6)具有显著的免疫原性和T-B功能，而且还鉴定了一种有效的临床前产物配方，并建立了一种以人安全的葡萄糖酰氨基葡萄糖脂佐剂作为脂质体制剂的无标记免疫原(Uf6b)的纯化工艺，并以皂甙qs 21(gla-lsq)佐剂作为脂质体制剂。9,11。总之，我们的结果突出了UF6b：GLA-LSq作为一个强有力的TBV候选病毒，这可能是消灭疟疾的斗争中的一个关键组成部分。

UF6免疫原结构的选择

以往关于抗AnAPN 1 IgG的T-B活性的研究以及蛋白质结构的数据表明，AnAPN 1蛋白上存在多个表位；这些研究还表明，只有一些表位对T-B活性有贡献，而其他一些表位，如免疫显性诱饵肽1，则不起作用。7,8。因此，我们利用这些数据来指导新的免疫原变异体的设计，使其只在相关的T-B结构域上特异地呈现给免疫系统，从而有效地避免了不想要的免疫显性表位。利用小麦胚芽无细胞蛋白表达系统，我们制备了原AnAPN 1抗原结构(此处称为UF 1)作为参考标准，并为筛选研究提供了五个新的抗原候选(图一)。1B，补充图。1A，b)。以UF1无肽1、小鼠T辅助表位(RTEIHRNERTFT)和侧翼区(图1)为基础构建了UF2抗原。1B然而，UF2在小麦胚芽系统中产生的产量不足，阻碍了进一步的研究。其他四个结构为：UF3删除了诱饵肽(肽1)，由肽2-9组成；uf 4由13个氨基酸组成，非天然的，非天然的，人T辅助表位[padre：akfvaawTLKaa]和UF3序列；uf 5抗原是uf 3+padre+uf 3的二聚体结构；最后，UF6抗原是一个二聚体结构，类似uf 5，但与甘氨酸连接体(Ggs)相连接。2G)(如图所示。1B，补充表1).

生产后，我们用ALH凝胶™或GLA-LSq佐剂配制抗原，并在免疫研究中使用改良的CD1小鼠，采用一级和双促方案(第28天和第42天)进行免疫试验。为了确定哪些疫苗制剂是进一步发展的候选制剂，我们对疫苗制剂进行了排序，从1到3，其中1种制剂“能够诱导对肽7和9的抗体反应”，2种制剂“能够诱导对肽7或9的抗体反应”，3种制剂“能够诱导功能性T-B活性”。我们最初的免疫学筛选表明，小麦胚芽表达的AnAPN 1结构，UF5和UF6比原始的AnAPN 1结构(UF 1)(补充图)具有更强的免疫原性。2, 3)。单用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清终点效价时，UF5的免疫原性优于其他载体。用UF5：GLA-LSq或UF6：GLA-LSq产生的抗体也集中在T-B表位、肽9上，结合特异性比UF 1(补充图1)更强。3).

然后用免疫小鼠的血清样本进一步测定标准膜喂养试验(SMFA)中不同抗原的T-B活性。疟原虫(NF54)12直接膜喂养法(DMFA)7,8,9,10,13,14喀麦隆使用循环寄生虫株(附图)。4)。包括野生型疟原虫菌株进一步显示了两个“向下选择的”抗原候选体(UF5和UF6)的高T-B潜能，这两个抗原候选物在免疫研究中也显示出最高的终点滴度(补充图)。2，补充图。3)。然而，我们的结果表明，抗体滴度与T-B活性之间没有明显的相关性。虽然我们最初并没有观察到在免疫原性方面使用GLA-LSq配制UF5的优势，但它优于Alhygel™(明矾)(补充图)。3随后的功能研究表明，UF6：GLA-LSq配方能产生最有效的T-B抗体(补充图1)。4)。此外，尽管UF5：GLA-LSq抗体滴度较高，但UF6：GLA-LSq抗体在DMFA中阻止卵囊发育的能力更强。4).

建立大规模生产uf6b的cgmp工艺

在发现UF6产生最强大的T-B抗体的基础上，我们开发了一种生产大规模cGMP量的UF6免疫原的方法，为人类首次临床试验做准备。在此过程中，我们对抗原进行了两次改变，从而产生了“uf6b”免疫原：(I)去除用于初步纯化的C端his-标记；(Ii)在C-端添加一个惰性的、非免疫的肽序列cggsg，以防止预期的高发酵规模下的羧基末端蛋白酶剪裁(补充表)。1)。此构造被插入到大肠杆菌表达载体pD 1841，表达载体pD 1841。2)。已生成一个主单元库并用于生产六氟化铀(补充表)2)。在120 L发酵罐规模下，该工艺在相对较低的生物量45.8g/L下收获时产生了52.3g总六氟化铀(111.3 L体积为469.94 mg/mL)。计算出的比生产率为1%(每克0.010克六氟化铀)大肠杆菌)。临床前级散装原料药符合所有既定的质量属性验收标准，包括内毒素水平为6.7 EU/mg(补充表)3，补充图。5).

Uf6b具有免疫原性，可诱发小鼠抗肽9抗体。

为了测试所选新的临床前UF6b产品的免疫原性，以20μg/剂量/鼠的方式肌肉注射CD1小鼠，并在第28天和第70天进行增强，以反映临床试验中预期的剂量间隔(图1)。3A，补充表4)。UF6b单独(在无佐剂的情况下)在小鼠中具有免疫原性，达到10的交互血清终点滴度。6在研究的第98天(如图所示)。3B)，建立其基线免疫原性。小鼠也被免疫的UF6b与任何一个GLA-LSq配方(图)。3C)或AddaVax™(图1.三维空间)。AddaVax™是仅用于研究使用版本的更有效的MF-59佐剂，已被批准用于人类，并被用作阳性对照，以代表比明矾更强的比较剂佐剂。UF6b：GLA-LSq的配方比六氟化铀单独或六氟化铀：AddaVax™引起了更高、更快速和更稳定的反应。3E).

考虑到免疫方案可以影响免疫原抗体反应的强度和持久性，我们还用第28天和第56天的增强方案测试了第0天(质数)，以确定与98天长的研究相比，70天的研究是否会影响小鼠的总体体液免疫反应。我们发现感染70天的免疫方案(图1)。3A)在98天的研究中产生了类似的抗体反应，其血清终点滴度为1：10。8(无花果)3F).

我们假设删除N-末端“诱饵”表位(肽1)将集中于免疫小鼠对两个关键的T-B表位肽7和肽9的体液反应。以从70天的研究中收集的血清作为两种不同剂量方案的典型体液反应，我们观察到小鼠对肽9有抗体应答，但当UF6b与任何一种佐剂一起配制时，小鼠对肽7的反应失败(见图)。第三代)。为了进一步证实这些发现，在新的小鼠群中重复了较长的和收缩的剂量治疗方案，与UF6b产生的混合抗体反应保持相似(补充图1)。6)。重要的是，从70天的研究中对小鼠个体抗体滴度的仔细检查表明，疫苗接种方案在每只小鼠体内都引起了强烈的抗体反应(补充图)。7).

UF6b诱导小鼠产生强效T-B抗体

以前，我们已经证明用N端135-aa重组AnAPN 1蛋白免疫小鼠会产生功能性T-B抗体。7,8,9,10。在目前的研究中，我们评估了用新构建的UF6b免疫小鼠纯化的总IgG是否类似地阻断了SMFA和DMFA的寄生虫传播。纯化抗原特异性IgG的抗体滴度测定表明，50 g/mL的总IgG含有3.3g/mL的UF6b抗原特异性IgG。用50μg/mL的总IgG有效阻断恶性疟原虫在……里面冈比亚按蚊蚊子(图1.4A-E)，导致中肠卵囊强度显著降低(即每个中肠的卵囊数量)。用uf6b：gla-lsq免疫小鼠后，免疫组小鼠的平均卵囊强度降低了90%以上。P < 0.001, GLMM, Kruskal–Wallis, α < 0.05) (Fig. 4A，c)。此外，当总IgG浓度高于50μg/mL时，较高浓度的IgG不能提高T-B的活性(见图)。4B)。这一现象以前曾被描述过，其中较高的抗体浓度，要么导致T-B活性的稳定，要么导致中肠寄生虫感染的增强，这两者都是在已知的本征误差范围内的影响。13,15,16,17,18.

我们还测试了用uf6b：gla-lsq免疫小鼠的纯化后的总IgG阻断自然循环的能力。恶性疟原虫寄生虫感染一个。冈比亚科蚊虫在喀麦隆的DMFA。P. [医]恶性疟原虫从喀麦隆受感染的儿童中分离出配子体阳性的血液，并将UF6b特异性IgG添加到每个膜喂食器的血液中，并用于喂养蚊子。在3.3g/mL范围内，UF6b特异性IgG可使平均卵囊强度降低80~90%。P < 0.001, GLMM, α < 0.05) (Fig. 4D，e).

为了确定UF6b：GLA-LSq和UF6b：AddaVax™免疫血清表观T-B活性的差异是否可以用抗体质量和/或数量上的差异来解释，我们在98天和70天的剂量研究中对所有组的抗原特异性免疫球蛋白亚型进行了比较。在没有佐剂的情况下，UF6b主要引发IgG1IgG水平较低时的反应2A和IgG2B(无花果)4F)。当与GLA-LSq或AddaVax™联合使用时，免疫球蛋白谱在这三种亚型之间的分布更为均匀。此外，这三个免疫组之间的IgG没有差异。3IgA、IgM均较低，且各组Kappa与LAMBDA轻链的比例均较高(图1)。4F)。在D70时点之后的98天研究中，免疫球蛋白谱的变化非常小，尽管我们在重复的98天研究中确实注意到了λ轻链的增加(图一)。4G)。我们注意到，对UF6b：GLA-LSq的70天研究产生了类似的免疫球蛋白亚类谱(图1)。4H与98天的长时间研究相比(见图)。4G)，表明在不影响产生抗体的情况下，在未来的临床研究中可以使用剂量方案的灵活性。IgG的含量有一些变化2A和兰达轻链之间的两个复制70天的研究，这是可以预期的与老老鼠。

在这里，我们成功地优化了以蚊子为基础的AnAPN 1疫苗候选疫苗，以进一步开发和评估作为一种有效的疟疾TBV抗原。此外，我们的研究进一步证明了将结构信息用于抗原优化作为开发任何候选疫苗的关键步骤的好处。更高质量的结构是基于对全长apn 1的免疫原性和蚊子特异性结构域的结构功能的理解。一个。冈比亚科10。我们发现，在二聚体结构中提出两次关键的T-B表位，如UF5和UF6的设计，与原UF 1相比，提高了整体免疫原性和T-B活性。这两个结构也成功地集中了体液对关键表位肽9的反应，尽管UF6最终在功能研究中被证明是最有效的，并被选择进一步开发。临床前产物UF6b即使在没有佐剂的情况下单独接种，在小鼠体内仍具有可靠的免疫原性。Uf6b产生了一种肽9特异性反应，我们已经证明了这一点。8赋予强烈的T-B活性。我们最初的目标是针对第7肽和第9肽，这两个肽被预测会强烈结合由东非人群共有的HLA-DRB 1等位基因编码的MHCⅡ。7,11我们无法诱导肽7特异性的肽反应，但缺乏肽7特异性反应似乎不影响抗体的T-B整体活性。总之，这里设计和评估的UF6b TBV候选物实现了两个优先目标：诱导对肽7或肽9的抗体，以及在较低的抗体浓度下证明具有功能的T-B活性。

在以前的研究中，需要从兔和小鼠中提取0.8至1.6mg/mL的纯化总IgG，以阻断SMFAs和DMFAs的卵囊发育。7。在如此高的总IgG浓度下，估计只有5-10g/mL的抗原特异性IgG。然而，这些研究使用了一种含有免疫显性“诱饵”表位肽1的免疫原，导致更大比例的小鼠IgG谱针对这个与疟疾无关的表位。7,8。我们观察到用UF6b：GLA-LSq免疫小鼠的抗血清中含有相当数量的UF6b特异性IgG(3.3mg/mL)。这些数据表明，UF6b：GLA-LSq制剂确实能够聚焦或扭曲脊椎动物对第9肽表位的免疫反应，使获得标记T-B活性所需的总IgG浓度(50微克/mL，比1.6毫克/毫升)低32倍。是否能在非人类灵长类动物(NHPs)或人类中诱导出类似的抗体，还有待观察。Uf6b：gla-lsq免疫后总IgG的最大T-B活性与单抗单抗(MAb)4H5B7的活性相当，后者仅针对肽7。8。阻断活动的程度似乎与蚊子感染SMFAs和DMFAs的强度有关，T-B活性的变化可能与感染志愿者血液中配子体细胞的遗传复杂性有关。19。这并不是完全出乎意料的，因为膜馈线器(实地测量T-B活性的金标准)是人工的，感染的红细胞和抗体目前不可能在小饲料中循环。因此，抗体在血液中的分布可能不均匀。尽管在膜喂养试验中确保抗体持续传递存在固有的困难15,16,17当对照组蚊虫卵囊强度小于50个卵囊/中肠时，用含免疫小鼠抗血清的血液喂养蚊子，观察到100%的抑制作用。这些发现是有希望的，因为这种程度的感染通常是对自然感染的期望。20.

UF6b：GLA-LSq和UF6b：AddaVax™疫苗制剂在T-B活性上的差异不能仅用总抗体效价来解释。先前的研究表明，在用水凝胶™配制的AnAPN 1(U1)免疫小鼠后，会产生主要的Th2反应。10，其特点是IgG较低。2相对IgG滴度1免疫血清中的效价。然而，较高的IgG2A和IgG2B用UF6b：GLA-LSq和UF6b：AddaVax™对六氟化铀的反应效价与六氟化铀单独进行比较，表明这些早育的CD1小鼠存在Th1偏向的体液反应。Uf6b：gla-lsq激发出略高的IgG。2A滴度与UF6b相比：AddaVax™和更高的对数IgG2A比六氟化铀滴度更高。皂素类佐剂(gla-lsq)和乳剂，如addavax™或mf-59，被设计用于诱导稳健和平衡的Th1/Th2反应，这一点在我们对uf6b：gla-lsq和uf6b：adavax™的研究中得到了明确的观察。21。对于UF6b：GLA-LSq抗原特异性IgG(所有Ig亚类)中较高比例的Kappa轻链的观察，以前还没有在使用uf 1：Alhygel™的研究中观察到。在人类中，可变轻链除了影响其他理化性质外，还会影响抗体结合特异性、血清半衰期和构象灵活性。22。IgG3在我们以前关于AnAPN 1靶向免疫的工作中还没有注意到反应，虽然它与Th1有关，但是总体的IgG。3本研究滴度低。考虑到有效的mAb 4H5B7是IgG2B，kappa同工型，可能是高滴度的IgG。2A和IgG2B轻链同工型的比例不仅能产生更多的抗体，而且在质量上也会有更好的抗体储备。这一假设值得进一步研究，并可在第一阶段的临床试验中得到适当的解决。应该指出的是，小鼠是预测疟疾疫苗在人类中成功与否的一个不完美的模型有机体，因为与nmps和人类相比，小鼠产生了不同的免疫应答，具有不同的抗体特性。23。因此，我们的UF6b：GLA-LSq配方的耐受性、免疫原性和寿命的进一步测试目前正在NHPs中完成，以便更快地过渡到人类第一临床试验。

流程开发工作流程(如图所示)。2)在本研究中建立的计划很好地推动了UF6b的cGMP生产。根据理论剂量0.1 mg/mL/受试者作为第一阶段研究的最高剂量，保守估计内毒素水平为0.35 EU/mL。这已远远低于每剂重组蛋白疫苗的<20 EU/mL推荐值，比风疹疫苗的内毒素上限低15倍。24。事实上，目前的程序将AnAPN 1(UF6b)内毒素水平设定在几种推荐的儿童疫苗的报告范围内。24.

疟疾TBV是消灭和根除疟疾斗争中的一个关键组成部分。我们的结果符合并超过了成功的tbv的功能基准标准，即针对tbv候选的抗体应该阻止80%的≥。疟原虫卵囊的发育和达到这一水平的活性使用较低浓度的目标特异性抗体在膜喂养试验中，如前面所描述的。5。考虑到疟疾流行国家人类对疫苗反应的固有差异，部分原因是急性疟疾、伴随感染和/或营养不良。25重要的是，必须尽可能降低功能性疟疾T-B活性所需的抗体浓度。这样做将增加实施这种疫苗在社区一级产生明显效果的可能性。据预测，使用gla-lsq佐剂将有助于克服诱导的T滤泡辅助器(Tfh)细胞应答的局限性，因为在急性疟疾发作期间，B细胞帮助发现循环的tfh细胞受损。25，在pfs 25 tbv的临床前研究中，这种佐剂已被证明是改善tfh反应的关键。26。总的来说，我们的结果是有希望的，并强调了AnAPN 1分子(以UF6b：GLA-LSq为例)作为疟疾TBV最佳配方的候选资格。再加上目前临床前药物产品的高产率和低内毒素水平，AnAPN 1 TBV很好地定位于推进cGMP制造、批量释放测试和毒性研究，作为第一阶段临床试验的前奏。