SARS-CoV-2感染患儿急性期和恢复期的先天细胞特征

儿童有轻度严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)确诊疾病(新冠肺炎)，与成人相比，这种差异的免疫学机制尚不清楚。在这里，我们报告48名儿童和70名成人感染或接触SARS-CoV-2的急性和恢复期天然免疫反应。我们发现临床上轻度的SARS-CoV-2感染在急性期表现为单核细胞(经典细胞、中间细胞、非经典细胞)、树突状细胞和自然杀伤细胞的循环亚群减少。相比之下，SARS-CoV-2感染成人只显示非经典单核细胞的比例降低.我们还观察到感染儿童急性期CD 63+激活的中性粒细胞占SARS-CoV-2的比例增加。接触SARS-CoV-2但PCR检测阴性的儿童和成人暴露后低密度中性粒细胞的比例增加，我们在接触后7周观察到。本研究的特点是在SARS-CoV-2感染和家庭暴露期间儿童的先天免疫反应.

与成人相比，儿童患有轻度严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(sars-cov-2)确诊疾病(新冠肺炎)，高达三分之一的儿童无症状。1,2,3。最近的研究表明，儿童感染sars-cov-2的可能性也较小，这与大多数其他呼吸道病毒在儿童身上观察到的更高的流行率和严重程度明显不同。4。年轻人群的免疫保护机制尚不清楚。

对严重小儿新冠肺炎和儿童多系统炎症综合征(MIS-C)的免疫分析研究表明，广泛的炎症和T细胞免疫的动态变化可能在疾病的发病机制中起关键作用。5,6。然而，关于非住院轻度感染儿童(新冠肺炎儿童最常见的临床过程)细胞免疫反应的数据是有限的。先前对有症状的sars-cov-2感染的父母及其3名sars-cov-2 pcr阴性儿童的研究表明，所有暴露的儿童都有细胞免疫应答，其特征是随着时间的推移，天然免疫细胞的频率发生了显著变化。7表明家庭接触SARS-CoV-2会导致免疫反应的改变，即使在没有病毒学确认感染的情况下也是如此。

在这里，我们比较了SARS-CoV-2的儿童和成人的天然免疫细胞特征，发现儿童感染的特点是中性粒细胞的激活增加，循环髓样细胞的比例降低，家庭暴露于SARS-CoV-2会导致低密度中性粒细胞的产生，在儿童和成人暴露后7周内可以观察到。

参与者是2020年4月至8月在澳大利亚墨尔本皇家儿童医院进行SARS-CoV-2测试的家庭。从首次阳性的sars-cov-2 PCR检测结果中，尽早采集急性标本，并于4-7周后采集恢复期样本(见表)。1)。我们采用多参数流式细胞术和非监督分析方法，研究了SARS-CoV-2感染或暴露于急性期或恢复期的儿童和成人血液中的天然免疫反应。SARS-CoV-2-阳性者为非住院病人，在鼻咽拭子上进行sars-cov-2的PCR检测呈阳性，症状轻微(见表)。1)，包括鼻炎、头痛、恶心、发烧、咳嗽、喉咙痛、不适、头痛和肌肉疼痛(请参阅个别症状数据的补充数据)。SARS-CoV-2暴露的个体被定义为在家庭密切接触SARS-CoV-2的家庭中接触SARS-CoV-2的人，但在反复的鼻咽拭子上SARS-CoV-2 PCR阴性。接触组的所有参与者每隔5至7天进行5次重复SARS-CoV-2 PCR检测，共4周。所有重复测试均为阴性。接触者的抽样时间与其家庭密切接触者的PCR阳性检测有关的时间列于表中。1。在皇家儿童医院微生物学实验室进行SARS-CoV-2 PCR检测，方法采用LightMix模块化SARS和武汉CoV E-基因试剂盒(德国柏林TIB Molbiol)和AusDiagnosis呼吸致病菌16井检测(澳大利亚Mascot)。

非经典单核细胞循环数低是成人sars-cov-2感染的一个新特征。8,9。在此，我们观察到SARS-CoV-2感染患儿恢复期单核细胞总数比例较低(中位数0.67%比3.0%PBMCs)。p=0.0031，图1。1A)。这一点在感染儿童的三种循环单核细胞亚群中都很明显，其中中间型(CD 14)的变化最为明显。+CD 16+)和非经典(CD 14)低层CD 16+)急性期和恢复期之间的亚群：中间单核细胞(中位数0.07%比0.14%，p=0.005)和非经典单核细胞(中位数0.04%比0.33%，p=0.0003，图1。1A)。SARS-CoV-2感染的成人在基线和恢复期对非经典单核细胞也有这种影响(中位数为0.19%vs 1.1%，p=0.01，补充图。1A)然而，其他两个单核细胞亚群在成人中没有观察到差异。在SARS-CoV-2感染急性期，儿童树突状细胞减少，恢复期恢复(中位数0.26%vs 0.50%)，p=0.0004，图1。1A)。成人树突状细胞数量无差异(附图)。1A).

自然杀伤(NK)细胞，已知在连接针对病毒感染的先天和适应性免疫反应方面发挥关键作用。10，在儿童新冠肺炎中几乎没有被调查过。在此，我们发现SARS-CoV-2阳性儿童在急性期NK细胞的比例比SARS-CoV-2暴露的儿童减少(中位数4.8%比8.3%PBMC)。p=0.06，图1。1A)。感染SARS-CoV-2或接触SARS-CoV-2的成年人中位分别为9.1%和8.8%，差异无显着性(P>0.05)。p=0.99，附图。1A).

为了证实手动门控观察到的结果，我们对sars-cov-2感染的儿童的急性和恢复期样本进行了非监督聚类分析。11。为了可视化这些数据的二维，非线性降维技术12应用的单元格颜色由它们各自的FlowSOM集群突出显示(如图所示)。1B)。根据表面标记物的表达，将其分为CD4 T细胞、CD8 T细胞、B细胞、NK细胞、经典单核细胞、非经典单核细胞、树突状细胞和低密度中性粒细胞。在急性和恢复期，每个簇的频率显示NK细胞、单核细胞和树突状细胞的减少与手工门控观察到的SARS-CoV-2感染儿童相同(图1)。1B).

观察到在儿科感染期间，几个先天细胞群在循环中明显减少，这表明这些细胞可能被招募到感染部位。在一项针对中、重度新冠肺炎成人的研究中，轻度患者支气管肺泡灌洗中树突状细胞和NK细胞增多，而严重疾病的特征是单核巨噬细胞增多。13。另一项研究比较了严重新冠肺炎患者的血液和肺部特征，发现非经典单核细胞在疾病期间优先从血液迁移到肺部。14.

我们观察到髓系室在我们的全血分析，特别是在SARS-CoV-2感染的儿童进一步不同。在这项工作中，我们重点研究了循环粒细胞的表型和频率。而中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的总比例在儿童和成人组之间没有显着性差异(图1)。1C-d，补充图。1B)，CD 63所占比例增加+SARS-CoV-2感染儿童急性期中性粒细胞与SARS-CoV-2暴露儿童相比较(中位数为22%vs 1.7%)。p=0.0002，图1。1C)。CD 63的比例+SARS-CoV-2感染儿童中性粒细胞从急性期的22%下降到恢复期的8.1%(p=0.03，图1。1C)。CD 63在活化后在中性粒细胞表面被上调，并作为抗病毒免疫反应的一部分参与了促炎症介质的释放。15。这种反应在SARS-CoV-2感染的成年人中没有观察到(附图)。1B)，需要进一步研究这种激活的中性粒细胞亚型在介导儿童急性期免疫反应中的作用。HLADR、CD11b、CD11c等天然细胞活化指标在各组间无明显差异。

Sars-cov-2暴露于成人和儿童的恢复期与低密度未成熟中性粒细胞(Ssc)的出现有关。嗨CD 16+)在PBMC组分中，用手动门控法确定(如图所示)。1A)并在无监督的分析中复制(如图所示)。1B)。近来有严重新冠肺炎的成人PBMC组分中的前中性粒细胞和未成熟中性粒细胞。16。其他研究表明，轻度和重度疾病中低密度或未成熟中性粒细胞增多，与全身炎症细胞因子水平呈正相关。17,18。在我们的研究中，只有在SARS-CoV-2阴性患者暴露几周后才观察到低密度未成熟中性粒细胞的产生，这表明它们也可能在保护性免疫反应中发挥作用。

这项工作提供了一个全面的特征，先天细胞反应在急性和恢复期的轻度儿童新冠肺炎。进一步的调查比较这些反应，使用纵向收集的样本，从同一儿科病人在整个感染和长期恢复，以及在体外功能反应这些细胞对非典-CoV-2，将提供更多的洞察力。我们比较了轻度SARS-CoV-2感染的儿童和成人的天然免疫反应，发现儿童感染的特点是中性粒细胞的激活增加，所有单核细胞亚群、树突状细胞和自然杀伤细胞的循环比例较低，而感染SARS-CoV-2的成人仅表现出非经典单核细胞比例的减少。我们还显示，在缺乏病毒学确认感染的情况下，暴露于sars-cov-2会引起免疫反应的变化，这主要是因为暴露后7周儿童和成人出现了低密度的未成熟中性粒细胞。这些发现提供了对新冠肺炎中与年龄相关的差异可能导致免疫机制的洞察。

SARS-CoV-2感染的患者及诊断

本研究患者的临床特征及人口学特征见表。1。在2020年4月至8月期间，通过皇家儿童医院呼吸道感染诊所招募了患者。在第一次试验结果后2周内采集急性样本，在试验结果后4~7周采集恢复期样本。SARS-CoV-2阳性者为鼻咽拭子SARS-CoV-2PCR阳性者，症状轻微.SARS-CoV-2暴露者为反复鼻咽拭子SARS-CoV-2PCR阴性者，与其家庭确诊SARS-CoV-2阳性患者密切接触。根据国家指导方针，亲密接触被定义为面对面接触超过15分钟，并与新冠肺炎确诊病例共用一个封闭空间。所有临床资料均以RedcapV10.1.2记录。

口咽和鼻咽(或深鼻)联合拭子是根据使用干FLOQSwabs的国家指南收集的(Copan，Brescia，意大利)。在500μL磷酸盐缓冲液中洗脱FLOQSwabs。核酸提取采用200μL洗脱液，用罗氏MAGNAPURE 96萃取系统(瑞士巴塞尔罗氏)提取。大多数SARS-CoV-2样本首先使用LightMix模块化SARS和武汉CoV E-基因试剂盒(德国柏林，TiB Molbiol)使用10μL核酸提取液进行测试。在LightCycler 480 II型实时PCR系统(ROCHE)上进行RT-PCR.一些患者样本最初被测试为SARS-CoV-2，使用Ausnosis呼吸致病菌16井检测(澳大利亚，吉斯科)，在Ausnosis High-Plex 24系统上，使用10μL核酸提取液。在可能的情况下，在带有单一基因靶的筛选试验中呈阳性的样本通过第二次检测得到确认。

TIB Molbiol(靶向e-基因)和Ausnosis呼吸多重串联PCR(针对ORF-1基因)都是商业上可用的检测方法。一项已发表的评估估计，tib Molbiol e-基因检测的敏感性为96.5%，特异性为98.5%。19。该诊断方法与维多利亚传染病参考实验室的结果进行了独立比较，诊断试验与参考试验的阳性符合率为98.4%。20.

在可用的情况下，SARS-CoV-2阳性患者诊断时的CT评分将在补充数据中提供.补充图中不包括弱阳性的SARS-CoV-2PCR结果(CT>30)。2。由于SARS-CoV-2与其他呼吸道病毒的共感染已被报道，我们还进行了其他常见呼吸道病毒的检测。在我们的急性期和恢复期SARS-CoV-2阳性队列中，在SARS-CoV-2测试时，每组只有一名儿童(0名成人)其他呼吸道病毒(肠病毒、腺病毒)检测呈阳性(见补充数据)。

PBMC和全血流式细胞术

用EDTA管采集每名受试者的血。采集后即刻取全血100μl进行流式细胞仪分析。其余的edta血样被加工成PBMC。21。对全血标本进行流式细胞仪分析，用1mL红细胞裂解缓冲液在室温下溶解10 min。细胞用1mL PBS洗涤，350×离心。g持续5分钟。再洗两次后，根据制造商的指示，细胞被重新悬浮在pbs中，用近红外线的活性染料进行活性染色。应用流式细胞仪对新鲜分离的PBMC进行流式细胞术分析，细胞经1mL PBS洗涤后，再用BV 510活性染料染色。对于全血和PBMC样品，加入fcs缓冲液(2%热灭活fcs，加入2mmedta)后，细胞被离心至350×。g持续5分钟。根据制造商的指示，细胞在室温下再悬浮5分钟。全血或PBMC抗体鸡尾酒(补充表)1在2X浓度下，加入1：1的细胞，在冰上孵育30 min。染色后，用2 mL FACS缓冲液洗涤细胞，350×离心。g持续5分钟。细胞再悬浮在2%的PFA中，在冰上固定20分钟，洗涤后再悬浮在150 l FACS缓冲液中，用BD LSR X-20 Fortessa和BD FACS diva V 9.0软件获取。对所有的流式细胞术实验，在样品采集时用补偿珠进行补偿。补充数字3描述了PBMC和全血样本的手动门控策略。

数据分析

用FLOJO 10.7.1软件分析结果(手动门控、Flow SOM、UMAP)。Flow SOM和UMAP分析是使用连接文件进行的，每个样本包含10,000个随机选择的活单细胞。Flow SOM和UMAP分析PBMC是在一个连载的文件上进行的，其中包括在急性期或恢复期采集的SARS-CoV-2阳性儿童样本中的27万起事件。Flow SOM和UMAP全血分析是在一个串联文件上进行的，其中包含SARS-CoV-2阳性和暴露于急性期或恢复期的216,000个事件(每个样本随机选择了8000个活单细胞)。手动门控结果显示为活细胞比例(用于PBMC)或CD 45所占比例。+白细胞(全血)。数据在Prism版本8.0.0中绘制。采用Kruskal-Wallis秩和检验和邓恩多重比较检验，对各类群进行差异丰度分析。所有统计分析均在棱镜8.0.0版进行。方格图显示中等值，第一和第三四分位数，以及最小和最大的值作为胡须。显示单个数据点。