您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!
本企业通过iso9001质量体系认证

几种分子生物学技术在肠道微生物组研究的应用

 二维码
发表时间:2019-08-07 12:21作者:武汉新启迪Xinqidi来源:http://www.qidibio.com

几种分子生物学技术在肠道微生物组研究的应用


分子生物技术的发展, 对于肠道菌群的研究,通常会以环境中各种微生物的基因组核酸(DNA或RNA)为研究对象,使用核糖体小亚基RNA 基因(细菌中的16SrRNA基因)的全部或部分序列作为分子标签来代表物种,以基因序列的多样性代表物种的多样性。主要的分子检测技术包括荧光原位杂交(FISH)、基于聚合酶链反应的变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)、实时荧光定量PCR技术,基因芯片技术,新一代测序技术和宏基因组研究等技术。


荧光原位杂交(FISH)


用于分析菌群的多样性。在放射性原位杂交基础上,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种杂交方法。将带有荧光标记的寡核苷酸探针直接与经过处理的细胞杂交,使探针渗透到细胞内的核酸,用荧光显微镜即可观察到带有杂交荧光标记探针的细胞,通过计算杂交率来定量检测和鉴定细菌。


不需要通过纯化或扩增步骤即可在自然或人工的微生物环境中监测和鉴定不同的微生物个体,同时对群落组成进行分析.在临床工作中,荧光原位杂交技术一般用于对已知菌群的检测,不能检测未知菌群。而且,由于部分微生物自身也会发出免疫荧光,所以会产生一定的假阳性和假阴性;另外,若细菌中rRNA含量较低, 则检出率也会下降, 这些会造成一定的实验误差。


PCR-DGGE(基于PCR的变性梯度凝胶电泳)


PCR-DGGE和FISH一样用于菌群多样性检测。主要是扩增微生物的核糖体小亚基基因的可变区,如细菌的16SrDNA的V3区,通过变性梯度凝胶电泳可以将不同序列的DNA片段分离开来,不同位置的条带代表不同的微生物,条带切胶回收测序还可以知道是什么微生物。


变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术是由Fischer于1979年提出的一种用于检测DNA突变的电泳技术,起初主要用于医学上,Muyzer等在1993年首次将这项技术应用到微生物群落结构研究方面并发现其在研究微生物种群方面具有很大的优势.既可以对比分析不同的微生物群落之间的差异,还可以研究同一微生物群落的变化情况.原理是使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶,双链DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳时的迁移行为主要取决于其分子的大小和带电荷的多少,可使同样长度但序列不同的DNA片段区分开来.DGGE分辨率高, 适用于检测100-500 bp的片段,不需同位素掺入, 避免了同位素污染。而且具有技术可靠、可重复、快速和容易操作的特点,可直接显示微生物群落中优势组成成分,并可同时对多个样品进行分析。


实时荧光定量PCR技术


实时荧光定量PCR技术是在普通PCR基础上发展起来的新型核酸定量技术,是一种实时监控DNA扩增反应的技术。实验室常用的方法有SYBR Green和TaqMan探针法。通过在PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累进行实时监测整个PCR过程, 并将DNA的累积速率绘制成动态变化图。能检测出样品菌体的具体数量,具有操作简便,快速高效,特异性强,高通量等优点,广泛应用于肠微多样性和饮食干预在微生物菌群基因组成方面的研究。


基因芯片技术


基因芯片又称为DNA微阵列,是在分子杂交技术基础上发展起来的一种新型分子生物技术. 基本原理是将大量探针固定于支持物上, 然后与标记的样品进行杂交, 通过荧光扫描及计算机分析样品中的基因序列及表达信息,具有高通量、高信息量、快速、样品用量少、造价低、用途广泛等优点. 可以同时对上千个基因进行快速分析, 因此对于肠道菌群这样成分复杂的样品, 基因芯片展现出很大的优势极大提高了检测效率,目前已成功制备了大肠埃希菌、伤寒沙门菌等20多种细菌的基因芯片且成功的检测到临床常见的感染性细菌.除此之外,还应用于分析酒精性肝硬化、乙型肝炎肝硬化等粪便微生物的功能结构。


不过基因芯片技术也存在一定的缺陷,由于它的提取纯化过程需要手动操作,因此会不可避免造成人为误差,而且探针的杂交有一定的错配率, 如何区分由此所造成的假阳性是临床微生物芯片面临的主要挑战。 另外,基因芯片的技术成本昂贵、复杂、无法鉴定亚群以及灵敏度等问题也可能限制基因芯片的发展。


高通量测序技术


高通量测序技术,可满足1次对几十万至几百万DNA分子测序的需求, 且因其数字化信号、高数据通量、高测序深度、高准确性等特点, 被广泛应用于肠道微生物的研究中, 尤其是16S rRNA测序可以从菌株的水平鉴定微生物, 能检测出新的菌株,目前的生物信息学分析也可以基于16s rDNA的测序对微生物群落的基因构成和代谢途径进行预测分析,大大拓展了我们对于环境微生物的微生态认知。包括有Roche公司建立454测序技术、Illumina测序等。


宏基因组学测序


宏基因组学是近年发展起来的新学科,不经过分离培养微生物,以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,直接提取环境样品中的宏基因组进行高通量测序和生物信息学分析, 寻找和发现新的功能基因及活性代谢产物的一种方法。


宏基因组技术路线分为4步:环境中微生物群体总DNA的提取,宏基因组文库的构建,序列测定及分析,功能基因筛选鉴定。宏基因组可提供大量的、无法估计的基因信息,用于研究系统发生的多样性,提供了肠道微生物潜在功能的库存,从而成为菌群多样性和功能相结合研究的工具。


相较于传统检测方法,现代分子生物学技术的发展无疑对肠道微生态的研究起到了巨大的推动作用,灵活运用不同技术的优劣势才能进一步的加快肠道微生物的多样性、功能结构等与各种代谢性疾病联系的研究进程。


不仅仅是微生物领域,如今分子生物学技术的应用已经渗透到传染病的诊断、流行病的调查、食品卫生检查、肿瘤和遗传病的早期诊断及法医鉴定等各个领域的研究,深化和扩展了检验医学的内涵和外延,而且随着国家精准医疗计划的启动和个体化医学的发展要求,必将持续推动我国分子诊断技术的进步。


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297