MutaSeq提供高覆盖率的基因组和线粒体突变
为了建立在单细胞转录数据中对人类细胞进行克隆跟踪的可靠的实验装置，我们评估了对Smart-seq 2协议的各种修改，目的是增加对感兴趣的多态基因组位点的覆盖(补充图)。1A)。我们发现，在反转录过程中加入靶向引物常常会导致不想要的副产物的形成，特别是针对更多的位点时(附图)。1A-d)。相反，在cdna扩增过程中，当感兴趣的位点被靶向时，我们获得了高质量的转录组数据，同时与非靶向方法相比，我们增加了每个细胞捕获的目标位点的平均数量的2-4倍(图1)。1B，c和补充图。1A，b)。一种用于引物设计的自动管道，最大限度地减少了非目标位置和潜在的引物二聚体生成，可在Https://github.com/veltenlab/PrimerDesign(另见方法一节)。MutaSeq可以稳定地工作在30-40对引物(目标)上；当包含更多的引物时，库质量会逐渐下降(补充图)。1E)。在一个只有高表达的目标基因的测试中，目标扩增是从几乎所有单个细胞中的所有引物中产生的(补充图)。1F，g).
为了评估MutaSeq，我们对一名AML患者(P1)进行了深度外显子测序，并设计了针对14个核突变的引物(补充数据)。1和4)。然后，我们系统地比较了MutaSeq和非靶向智能seq 2在CD 34+细胞上的表现。MutaSeq将单个细胞覆盖的目标位点数量从中间值1增加到中位数4(图中所示)。1C-E)，并对外显子测序估计的变异等位基因频率进行了概述，其准确性高于Smart-seq 2(图2)。1F)，同时保持可比较的转录组数据质量(补充图。1H，I)。这两种方法都低估了移码突变的丰富程度，这可能是无意义的介导衰变的结果。35(无花果)1E，f)。虽然我们的数据没有为目标基因长度或序列复杂性对辍学的影响提供统计证据，但我们不能排除这种影响。
重要的是，这两种方法都能很好地覆盖线粒体基因组(平均100倍的线粒体覆盖率，平均测序深度为每细胞788,000次)，如图所示。1g)，与其他大多数用于克隆跟踪的rna-seq协议不同。27,28,29,31(补充图。1J)。总之，这些结果表明MutaSeq在单细胞RNA测序实验中有效地覆盖了线粒体基因组，并且与Smart-seq 2相比，提供了更好的基因组靶点覆盖范围。重要的是，它不需要改变现有的Smart-seq 2管道，只需要在cDNA扩增过程中添加靶向引物。
同时绘制线粒体和基因组突变图可以很好地跟踪白血病、白血病前期和健康克隆。
为了研究MutaSeq是否能区分白血病、白血病前和残留的健康克隆，我们从4例具有不同基因型和表型的AML患者中获得了数据(图1)。2A, 3B和补充图。2)。为了更好地表征每个病人的干细胞，对细胞进行了分类，使假定的干细胞和祖细胞(CD 34+)和推测更成熟的细胞(CD 34-)在等量的范围内被覆盖(补充图)。2)。值得注意的是，其中两位患者(P2，P4)的骨髓细胞占CD 34−细胞的99%以上(附图)。2A)。由于个体和门的捕获率不同，最终数据集包括每个病人618至1430个细胞，其中190至968个是CD 34+(补充图1)。2B，c)。因此，我们避免在整个手稿中说明患者之间的数量变化。
图2：线粒体突变作为AML的高置信度克隆标记.另见附图。2–6. a患者概况。CD 34+和CD 34-表明白血病细胞的主要表面表型(见图1)。3B和补充图。2(用于量化)。对于每个病人，含有突变的基因都用斜体印刷(见补充数据)。1以获得完整的清单)。亚克隆突变。b描述不同等位基因频率的热图(颜色编码，见图右图)。2C的单细胞rna-seq数据中所观察到的密钥。n=1430个P1细胞。灰色表示缺少值。根据PhISCS的聚类结果排列细胞和突变。36如“方法”一节所述，线粒体突变分析与克隆层次重建。在同一节中描述了可能性的计算。低覆盖率突变TET 2，和斯潘)不包含在集群中，并且在热图中被描述为元数据，但是，在所有情况下，除了TET 2移码，有定量的证据表明他们与特定的克隆(补充图)。5B)。若要复制计算，请参阅与mitoClone包一起的小片段。对于突变，nuc是核基因组，mt是线粒体基因组。c像面板b，但使用n=1066个P2细胞。DNMT3A是一种低覆盖率突变，与白血病前克隆和白血病克隆有显著关联(补充图)。5B). d描述不同等位基因频率的热图(颜色编码，见图右侧的图例)。2C)在目标dna-seq数据中观察到n=288个来自P1的单细胞集落。ePhISCS36根据P1的突变数据重建克隆层次，参见线粒体突变分析方法和克隆层次重建方法。请注意，虽然突变的顺序是基于PhISCS模型的，但是将突变分组成克隆是基于一个任意的截止点，以便为进一步的分析提供有用的聚类。见图中的克隆人。2C颜色代码的图例。f喜欢e但对于P2来说。
图3：健康人和白血病患者骨髓中观察到的细胞类型概述。另见附图。2和7. a来自五个个体的数据(图)。1A)都是使用scanorama集成的。60并使用UMAP在二维中可视化62,63。簇是彩色编码的。N=5228个细胞。bCD 34+细胞在5人骨髓中的比例。CD 34+细胞在FACS分选过程中富集，在单细胞RNA-seq数据中表现得更高(补充图)。2). c健康人CD 34+细胞22在UMAP上突出显示。黑点对应于HSC/MPP簇中的细胞。d每个病人的细胞分别在UMAP上突出显示。黑点对应于HSC/MPP簇中的细胞。e在UMAP(补充图)上突出显示的关键FACS标记的日志转换表达。7A). f数据来自n=667个来自HSC/MPP集群的细胞使用MNN跨个体集成64。健康HSC/MPP几个标记基因的平滑表达22在MNN(补充图)所识别的第一个可变性维度上绘制。7F). g中log 10表达式更改(LogFC)的火山图n=569 AP1-高CD 34+爆炸；n=667个HSC/MPP样细胞，与校正后绘制成图p-使用一种模型，说明图书馆质量和病人身份/批数的差异(见方法一节-单细胞基因表达数据分析)。选择AP1-高CD 34+细胞作为比较，因为从所有标记基因来看，AP1-低表达似乎构成了健康型HSC/MPPs和AP1-高表达之间的中间状态。h的对数归一化表达式FOS和君在UMAP的面板上a。见面板e作为一个色标。iVenn图显示AP1-高CD 34+细胞和CD 34−细胞表达显著过表达的基因，与数据集中的所有其他细胞相比较。
然后，我们将核基因组突变和线粒体突变称为单细胞水平的突变，以便将细胞聚集成克隆层次。大量外显子测序的病人已经发现已知的白血病前突变存在高等位基因频率和已知的白血病突变出现在一个略低的等位基因频率(图一)。2A和补充数据1。病人1：SRSF 2、TET 2/CEBPA和SRSF 2、TET 2/KLF7；病人2：DNMT3A/NPM 1；病人3：SRSF 2/IDH 2病人4：白血病三体8及BRAF突变)。虽然一些关于克隆等级的声明可以完全基于这些核体细胞突变的调用(补充图)。3A)，这些位点相对较高的脱落阻碍了细胞对克隆的健壮分配(补充图)。3B-d)。此外，这一结果被感兴趣的突变基因的表达水平所偏倚：在低表达的细胞中，辍学率较高，导致更高比例的假阴性呼叫，即对突变细胞的错误分类作为参考(图一)。1E和补充图3C，d)。其他使用相关方法从cDNA中扩增突变的方法也面临着类似的问题。27,28.
为了克服这些限制，我们接下来确定线粒体突变是否可以与核突变一起用于完善克隆层次。由于线粒体RNA被广泛编辑，因此仅根据突变来聚类细胞是很重要的，而不是由于转录后事件而与克隆结构无关的多态位点。在这里，我们开发和测试了一种过滤策略，它只利用线粒体突变进行克隆跟踪，如果它们在个别患者中唯一出现(补充图)。4A，另见方法)。这种想法假设RNA编辑事件通常在个体之间共享，而体细胞突变则不是。利用整个外显子测序数据，我们验证了这一方法，在基因组位点水平上，正确地区分突变和RNA编辑事件，准确率为97%(补充图)。4B，c)。我们进一步分析了线粒体突变与克隆之间已知关联的各种控制数据集。33为了验证这种方法可以检测相关的线粒体突变而不需要基于dna的参考，并进一步允许无监督地识别克隆(补充图)。4D-f)。我们已经实现了所有必要的筛选和黑名单例程，以确定有丝分裂克隆R包中高置信度的体细胞线粒体变异(Https://github.com/veltenlab/mitoClone).
然后，我们使用一个解释等位基因缺失的数学模型，从细胞核和线粒体体细胞变体中计算克隆层次。36(有关详细信息，请参阅方法，所有必需的工具都包含在mitoClone包中)。在P1和P2患者中，白血病前和亚克隆白血病突变与不同的线粒体变异密切相关(补充图)。5A，b)，这样就可以勾勒出克隆的层次结构，从而有可能对克隆进行有信心的细胞分配(如图所示)。2B，c见附图。3B进行定量分析)。与从cDNA中调用的基因组突变不同，从线粒体突变中识别克隆同一性的方法大多不受基因表达水平或文库质量的影响，而且在一种情况下影响较弱(补充图1)。3C、D、5c)，并且有可能在较低的测序深度(补充图)。5D-f)，因为线粒体基因一直都是高表达的。
重要的是，克隆结构已由单细胞衍生集落的靶向dna序列验证(例1，图)。二维空间)。在所有患者中，我们发现了携带已知白血病前突变的克隆(例如SRSF 2, DNMT3A)和携带已知白血病突变的亚克隆(例如，CEBPA, NPM 1)(图1.2E，f)。下面，我们根据这些克隆对健康血液生产的贡献，从功能上将它们定性为白血病或白血病前期(图一)。4).
图4：白血病前突变对细胞分化的影响。另见附图。8. aP1细胞在UMAP上的克隆特性(图1)。2B，e，3A)。灰点对应于其他病人的细胞。虚线椭圆作为识别HSC/MPP种群位置的指南。b在UMAP上强调P2细胞的克隆特性(图5)。2C，f, 3A). c所观察到的变异等位基因频率IDH 2P3的R88Q突变突出在UMAP上。小黑点对应的细胞没有覆盖突变(见附图)。8A估计目标捕获率)。d所观察到的同义变异等位基因频率NUP 188从P4突变突出在UMAP。该突变在总骨髓外显子数据中的等位基因频率为50%。请注意，CD 34+细胞在单细胞RNA-seq的分选过程中富集了100倍以上。2见附图。8A估计目标捕获率)。e估计不同克隆对细胞类型的贡献。P1和P2为无性系同一性图。2被利用了。对于P3，细胞被归类为白血病，如果IDH 2我们观察到了突变，就像白血病前，如果SRSF 2如果观察到这两种突变的参考等位基因，则观察到突变或非白血病。没有覆盖的细胞被排除在分析之外。对于P4，细胞被归类为白血病，如果NUP 188观察到突变，如果观察到参考等位基因，则为非白血病。条形图仅显示在覆盖至少10个细胞的人群中(见附图)。8B绝对数字和附图。8C，d进行定量分析)。
在患者P3中，白血病和白血病前突变的等位基因频率接近50%，表明存在单个白血病克隆(补充数据)。1)。患者p4，一名18岁的白血病患者，由于8号染色体的三倍增殖，没有发现线粒体标记，尽管外显子测序表明存在亚克隆变异(补充数据)。1)。在这种情况下，MutaSeq仍然允许仅使用基因组突变进行定性分析(见下文)。综上所述，我们的方法允许鉴别假性白血病、白血病前期和健康克隆，如果存在线粒体体细胞变异，则可以将细胞分配给具有高度置信度的克隆。
新克隆的鉴定与鉴定
接下来，我们研究了线粒体体细胞变体的使用是否可以在不事先知道核突变的情况下识别和鉴定克隆。为了达到这一目的，我们使用了一组来自P1患者的数据，该数据集没有核场所的放大(即标准的Smart-seq 2)。一个明确的克隆结构是以非监督的方式确定的，完全基于线粒体变异(补充图)。6A)。为了检查体细胞遗传变异的存在是否与不同的克隆有关，我们随后在宇宙数据库中询问了在AML中注释为突变的13,797个基因组位点的突变状态。37使用β-二项式模型(见方法)。这个未经监督的分析揭示了SRSF 2P95H突变与白血病和白血病前亚克隆(补充图。6B，c)。他们的恶性性质进一步证明了明显减少的能力，以T细胞谱系(补充图)。6d(另见下文)。
为了进一步展示我们识别克隆的能力，我们强调了P2中非白血病细胞的克隆扩张(图)。2F)。如果仅仅依靠基因组突变的方法，这个克隆就会被错过。27,28,31。有趣的是，这些细胞与白血病前无关。DNMT3A突变。再次查询宇宙数据库中的站点37使用β-二项式模型，我们发现他们在RPL 3基因(附图)6B，e)。这些结果表明，这种克隆扩增事件与白血病无关，并与获得无关核突变有关。
我们还注意到P1中的一个假定的非白血病克隆，其特征是一个线粒体变异体(5492 T>C)。除了一个例外，携带这种变异的所有细胞对T细胞标记CD3都是阳性的。2B, 4A)。因此，这种变异很可能是在T细胞前体或T细胞克隆中获得的，尽管我们不能正式排除它对应于特定于T细胞的RNA编辑事件。
总之，这些结果表明，我们的方法可以识别和定性克隆的新，而不事先了解核基因组突变。MitoClone包实现了克隆聚类和突变调用的所有例程。
白血病骨髓细胞状态图鉴定hsc样细胞
接下来，我们使用单细胞转录组数据来区分干细胞、祖细胞和白血病细胞。为了确定样本中的细胞数量，我们整合了来自所有四位患者的基因表达数据以及一位健康人的CD 34+骨髓细胞的数据。22转化为二维表达，并根据标记基因的表达特征细胞类型(图一)。3A，补充图。7A-c，f，补充数据2).
所有4份骨髓样本均含有来自健康个体的HSC和多能祖细胞(HSC/MPP)聚集的细胞(图)。3B-d)并显示CD 34。+CD 38低层、FSC/SSC低层表型(图1.3E)。无监督分析将这些细胞分离为静止的未成熟的HSC样细胞(HLF+)，增殖性较强的红髓启动祖细胞(GATA 2+)和淋巴肌样启动祖细胞(FLT 3+)(图1。3F和补充图。7F)。与健康的红系祖细胞和MEPs相似的细胞也被发现，同时还发现了各种类型的B细胞前体和T/NK细胞(附图)。7b，c).
与非白血病人群相比，白血病骨髓样本中的大多数细胞(“母细胞”)在患者之间有很大的不同，这与以前的观察结果一致。27(无花果)三维空间)：我们观察到(A)分化的细胞(CD 34-SSC/FSC)。嗨)表达中性粒细胞的基因，如caltectin(S100A8，S100A9)和AZU 1(无花果)3E和补充图。7A)；(B)高度有丝分裂并表达胎儿血红蛋白的CD 34+细胞HBZ(C)CD 34+CD 38低层表达造血干祖细胞(HSPC)典型标记的细胞，如PROM 1(CD 133)和Meis 1(补充图。7A，d，e)。后一个群体似乎与HSC/MPP群体之间的连续状态有关，这些状态逐渐上调AP1转录因子的表达(FOS，Jun，FosB，JunB，Jund)同时下调MHC II级(如图所示)。3G，h和补充数据3)。对所有群体的高表达基因进行的全球分析表明，AP1的高表达水平，以及几个Krüppel样因子和Poly-A结合蛋白，是所有不同BLAST群体与患者的共同之处，并将其与健康的祖细胞区分开来(见图)。3H，I)。值得注意的是，ap1和klf的高活性最近已被确认为基因上不同类型的aml基因保守的一个特征。38。我们的结果表明，这些转录因子似乎在所有的，表型非常不同的BLAST群体中都是相关的。
所有四种白血病样本合在一起，都可以分为干细胞、祖细胞和细胞。此外，所有患者保留的细胞高度类似于健康的HSCs，虽然在不同的丰度。
克隆跟踪识别细胞分化状态和与白血病前和白血病突变相关的基因表达模式。
仅仅基因表达信息不足以区分癌性和非癌性HSPC(补充图)。7F)。为了明确地将细胞定性为(前)LSCs或残存的健康细胞，我们整合了单细胞基因表达数据和克隆跟踪结果(图1)。4A-d)。如果线粒体体变异存在，我们能够以很高的置信度分配克隆的身份，使我们能够绘制定量陈述(病人P1和P2)。在没有线粒体体细胞可变性的情况下，我们在SRSF 2, IDH 2和NUP 188用于纯定性陈述(病人P3和P4)。这些标记位点的捕获率为70%(SRSF 2)至11%(NUP 188)(附图。8A).
与白血病突变相关的克隆在鼓室最常见，在HSPC室也有发现，但在淋巴系(B、NK、T)中几乎缺失。相比之下，与白血病前突变相关的克隆在所有谱系中都有发现，但大多数在淋巴系中的流行率都有所下降(图一)。4E和补充图。8B-d)。这些观察证实了这些克隆被命名为“白血病”和“白血病前”。此外，这些结果突出表明，白血病突变可能在不同水平上启动分化块，正如以前报道的那样。4,27,39。例如，在患者P1和P3中，白血病细胞保留了对红系的贡献能力，而在患者P2中，这种活性仅限于白血病前和非白血病克隆。重要的是，P1、P2和P3中的白血病细胞处于一种在分子水平上与健康HSCs/MPPs高度相似的细胞状态，并保留了对各种谱系作出贡献的能力，即功能上是多能的。
接下来，我们详细研究了不同突变的分子效应。在此之前，特定白血病突变的后果在小鼠模型中得到了广泛的研究。MutaSeq数据允许我们比较只有在一个突变中不同的克隆之间的基因表达，从而阐明该突变对人类造血的特定影响。
脱氧核糖核酸甲基转移酶的突变DNMT3A是老年人HSCs良性克隆性扩张的最常见原因。6,7。在病人P2中，DNMT3A-突变后的白血病前hspc具有较高的干细胞样(相对高表达率)。HLF)或启动红髓样方向(较高的表达为GATA 2)(无花果。4b和5A)。这些结果与dnmt3A敲除小鼠模型的最新发现相一致。40。有趣的是，独立于细胞状态，这与MLLT 3，这是一种基因，其强制表达促进hscs的红系巨核细胞输出。41(无花果)5B，c和补充数据3).
图5：白血病和白血病前突变的分子后果。另见附图。8. a的对数归一化表达式GATA 2, FLT 3和HLF在P2的HSC/MPPs中，按克隆的同一性分层(见方法一节，单细胞基因表达数据分析，有关数据规范化的详细信息)。星号表示双面Wilcoxon检验的意义，*p < 0.001, **p < 0.01, n.s.: not significant (see the Methods section Data Visualization, for a definition of boxplot elements). b白血病前log 10表达变化的火山图(LogFC)n=55)与白血病(n=50)P2的CD 34+细胞，与校正后的CD 34+细胞作图p-从桅杆中取值(FDR)65，使用说明单元格类型和库质量差异的模型(请参阅方法)。只有以下CD 34+细胞类型来自图。3A包括HSC/MPP、CD 34+细胞(两种亚群)、中性粒细胞前体和MEPs。c比较不同细胞类型非白血病、白血病前和白血病细胞相关基因表达的点图。符号大小与每个单元格类型的单元格数成比例。d散点图描述白血病细胞(前)细胞的比例与细胞比例的关系KLF7-P1中不同细胞类型的突变克隆。虚线表示所有单元的平均比率，误差条表示来自β分布的95%置信区间，星号表示与平均值的显著偏差，如下所示：p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. p-数值来自双面二项测试，没有为多次测试进行调整(见附图)。8C并为每个组下的单个单元格的数量显示源数据)。e(前)白血病中log 10表达变化(LogFC)的火山图n=105)与非白血病(n=41)P3的CD 34+细胞，与桅杆上校正的p-值(FDR)作图65，使用说明单元格类型和库质量差异的模型(请参阅方法)。只有图中的下列单元格类型。3A试验包括HSC/MPP样、CD 34+细胞(AP1高、低)、中性粒细胞前体和MEPs。f点图比较FOS不同类型的非白血病、白血病前和白血病细胞。点大小和颜色分别代表细胞数量和基因表达水平(见图中的图例)。5C). g的日志规范化表达式级别的比较FOS在有证据证明来自非白血病克隆的细胞与有证据来源于白血病或白血病前克隆的细胞之间。细胞被指定为无性系，如图所示。4E(有关数据规范化的详细信息，请参阅“方法”一节中的单细胞基因表达数据分析，请参阅每个组下单细胞数的图源数据，以及“方法”部分数据可视化，以获得盒图元素的定义)。
多功能核糖核蛋白的突变NPM 1在30%的患者中被确认为急性髓系白血病的驱动因素，并经常与白血病前共同发生。DNMT3A突变21。在病人P2中，红髓细胞的偏倚DNMT3A克隆人在获得白血病后丢失了。NPM 1突变。NPM 1突变细胞Hoxb 3，再次与鼠标模型中的数据保持一致。42,43,44(无花果)5B，c)。与细胞状态无关，这些细胞进一步表现出对CD 96Rna的表达，以前被认为是白血病干细胞特异性的标记。12. CD 96在患者P3的白血病HSC/MPP样细胞上也有高表达，而在患者P1中没有高表达，进一步说明了LSC标记物的患者特异性(补充图)。8E).
突变KLF7在白血病中并不常见；然而，krüppel样因子在基因和表型上都有不同程度的表达。38(见上文)。在病人P1中，KLF7突变克隆显示G2/M期细胞比例较高。5D)。人CD 34+细胞ATAC-seq数据的再分析45我们发现含有klf 7结合位点的增强子在抑癌基因附近富集。46，包括CDK 6, PTEN, RUNX 1，和FLT 3，与不含KLF 7结合位点的活性促进剂(p=0.002，补充图。8F).
总之，我们使用了一个小的异种患者队列来证明，作为概念的证明，获取特定突变常常与一个改变的基因表达程序联系在一起，这与从小鼠模型中获得的数据是一致的。40,42,43,44.
最后，我们比较了所有(预)白血病细胞和非白血病细胞的基因表达，目的是确定所有(预)白血病细胞中存在的潜在标记物或药物靶点，但不存在于残存的健康细胞中。在病人P2中，我们的分析确定了少量的命中(如图所示)。5E和补充数据3)，最值得注意的是FOS，它在所有(前)白血病细胞中都有表达，而非白血病HSC/MPPs则不表达(如图所示)。5F)，以及MHC I类基因赫拉-L和赫拉-H，所有健康细胞均有表达，但未见(前)白血病细胞表达。在所有病人中，FOS在HSCs/MPPs和其他细胞类型中，在携带(前)白血病病变的细胞中持续过度表达(见图)。5G).
综上所述，这些结果表明MutaSeq和mitoClone能够描述白血病和白血病前突变引起的克隆进化的发育和分子效应。
