口服耐受引起的小肠免疫环境变化对实验性特应性皮炎的抑制作用

特应性皮炎是一种由Th2型免疫反应介导的慢性皮肤炎症性疾病。虽然肠道免疫反应在特应性皮炎的发生或预防中起着至关重要的作用，但肠道免疫对特应性皮炎的确切影响尚不完全清楚。我们在此表明，经口服耐受的小鼠可免于因致敏和皮肤外皮(EC)对卵清蛋白的攻击而引起的实验性特应性皮炎。虽然口服耐受和EC攻击的小鼠小肠中Th2型细胞因子的表达没有明显变化，但随着EC刺激引起的微生物变化的恢复，这些小鼠的小肠炎症反应减少。有趣的是，小肠嗜酸性粒细胞随EC挑战而增加，口服耐受也抑制了这一作用。小肠嗜酸性粒细胞和微生物在实验性特应性皮炎发病机制中的作用，进一步证实了小肠炎症介质的减少，减轻了嗜酸性粒细胞缺乏和微生物消融小鼠皮肤Th2型炎症的EC挑战。在此基础上，我们认为皮肤与肠道的双向相互作用在特应性皮炎的发病机制中起着重要作用，调节肠道微环境可能是治疗特应性皮炎的一种方法。

特应性皮炎(AD)是一种慢性炎症性皮肤病，以持续性瘙痒伴皮肤病理改变为特征。1,2。发达国家的AD流行率比发展中国家高得多，表明遗传易感性和对环境抗原的免疫反应失调是导致全球AD流行的原因之一。3。编码角质形成细胞终末分化蛋白的基因突变，包括丝氨酸、氯菊酯、雪莲蛋白、富含脯氨酸的小蛋白、s100A家族蛋白和晚期变性包膜蛋白，是AD发展的最重要的遗传危险因素。4,5。对各种环境因素作出反应，如皮肤刺激物、气候、污染物、烟草烟雾、水硬度和饮食。6受损的皮肤上皮释放固有的炎症细胞因子如IL-25、IL-23和胸腺基质淋巴细胞生成素，通过触发IL-4、IL-5、IL-13、IL-31和IL-10的产生，促进Th2型炎症的发生。7,8)。根据上皮屏障缺陷在AD发病中的作用这一命题，将剥离的皮肤反复暴露于卵清蛋白(Ova)中，建立了AD的小鼠模型。9,10.

食物和吸入性变应原引起特应性皮肤损害，这也表现在食物过敏在AD发展中的致病作用和消除饮食对AD儿童的有益影响。11,12。越来越多的证据表明，除皮肤屏障功能障碍外，AD患者的肠道通透性也受到损害。3,13。在此背景下出现的一个重要概念是，肠道屏障功能失调是AD的主要驱动因素，因为通过受损的肠黏膜接触过敏原会使口腔耐受性被绕过。14,15。口服耐受是由口服无害抗原引起的局部和全身免疫无反应状态。16。我们的研究结果以及其他研究表明，口服耐受性介导的小鼠AD样炎症的预防作用。17,18。值得注意的是，皮肤和肠道具有相同的解剖特性。19，这些组织是抵御外界环境暴露的主要防线。然而，以口服耐受性为代表的稳态肠道免疫反应是否在皮肤过敏性炎症中发挥作用还有待确定。

本研究采用小鼠AD模型，结合口服耐受诱导，研究了肠内稳态免疫反应在抗过敏性皮肤炎症中的作用。根据我们的研究结果，我们认为皮肤和肠道免疫反应之间的双向相互作用在AD的发展中起着作用，促进肠道免疫稳态可以改善皮肤的过敏表现。

口服耐受性诱导抑制OVA致敏和EC刺激皮肤AD样炎症改变

为了探讨口服耐受的特应性炎症皮肤的详细免疫学变化，我们在饮水中喂养OVA小鼠，然后在全身OVA致敏后，通过反复接触OVA诱发AD样炎症(如图1所示)。1A)。与表皮增生和皮肤浸润相关的表皮和真皮厚度在EC攻击小鼠中增加(图1)。1b和C)。然而，在口服耐受小鼠，组织学上明显的病理变化没有观察到在皮肤，即使在随后的EC攻击(图一)。1b和C)。根据这些发现，淋巴样浸润(CD3e)+T细胞)和髓样细胞(Gr-1)+中性粒细胞，F4/80+巨噬细胞和MBP+(主要碱性蛋白)嗜酸性粒细胞(EOS)细胞在EC刺激小鼠皮肤上观察到的细胞在口服耐受小鼠中受到明显抑制(图1)。1d和E)。然后，我们分析了Th2型炎症介质在有或没有预先诱导的口服耐受的EC攻击小鼠皮肤中的表达。如图所示。2，编码先天细胞因子的基因的表达，如Il1rl1(编码IL-33受体ST2的基因)IL 25，引起过敏性炎症7,20，随着经典Th2型细胞因子的表达增加(IL5和IL 13)和皮肤屏障标记物的表达减少(FLG和洛尔)。与嗜酸性粒细胞浸润和激活相关的炎症介质基因的表达Ccr3和Prg 2)和肥大细胞活化(Mcpt 1)在EC刺激小鼠的皮肤中也有显著增加(图一)。2)。然而，在有口服耐受性的小鼠中，所列Th2型炎症标记物的上调被有效阻断，其表达与对照组相比无显着性差异(图1)。2)。综上所述，我们的观察表明，在EC暴露前诱导对抗原的口服耐受性能有效地抑制同一抗原在EC攻击下引起的过敏性皮肤炎症。

口服耐受性诱导OVA对EC诱导的肠免疫环境变化的恢复

因为口服抗原的消化和吸收只发生在小肠。21我们假设小肠免疫反应的变化会影响口服耐受对过敏性皮肤炎症的抑制作用。因此，我们评估了EC暴露于OVA是否会增加小肠炎症介质的表达，以及口腔耐受性是否与EC攻击小鼠小肠中这些介质的表达变化有关。如图所示。3A，对IL6, IL17A，和Ccr3以及对.的下调Cldn4在EC攻击小鼠小肠中观察到编码上皮紧密连接claudin-4基因的mRNA，提示EC抗原攻击所致的肠道炎症改变。诱导的口腔耐受性抑制了这些介质的表达，并显着地抑制了这些介导因子的表达。IL1b, 肿瘤坏死因子, Prg 2，和CCL 5小肠中的mRNAs与EC攻击小鼠中的mRNAs相比较。作为.的表达IL 25, IL 33, IL 13，和Mcpt 1无论是EC刺激还是口服耐受，小肠中的mRNAs均未发生明显改变(如图所示)。3A)，EC攻击小鼠小肠内的免疫反应不太可能被极化为Th2型炎症。肠道的异常免疫反应常常伴随着炎性细胞因子的异常产生，与肠道微生物区系的不平衡有关。22。为了研究EC刺激或口服耐受诱导引起的肠道细菌群落的全球变化，我们对有或没有口服耐受的EC小鼠盲肠粪便标本进行了16S rRNA测序。在主坐标分析中，具有相似微生物剖面的样本被聚在一起，对照组和口服耐受的粪便样本被聚在一起，而来自EC攻击小鼠的样本分别与对照组和口服耐受样本聚在一起(见图)。斯1)。在门的水平上，与对照组相比，费米克特显著增加(曼-惠特尼检验)，P=0.0500)和Tenericutes(Mann-Whitney检验，P和细菌数量的减少(Mann-Whitney检验，P在EC刺激小鼠中观察到0.0500，而在口服耐受小鼠中则发生逆转(图1)。3B)。在家庭层面，龙须草科(曼-惠特尼试验，P=0.0500)和牡丹科(曼-惠特尼试验，P=0.0500)，并显著减少了拟杆菌(曼-惠特尼试验，P=0.0500)和牛肝菌科(曼-惠特尼试验，PEC刺激组小鼠与对照组小鼠比较，观察值为0.0500。3C)。对照组小鼠和口服耐受小鼠的微生物组成在门和家系水平上无显着性差异(图二)。3b和C)。

口服耐受性诱导抑制OVA刺激下小肠嗜酸性粒细胞的增加

小肠固有层含有多种免疫细胞，包括B细胞、T细胞和几种先天细胞，如嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞，它们通过与抗原刺激物的积极相互作用来协调肠道免疫反应。21。因此，我们对小肠固有层中的免疫细胞群进行了研究，以确定EC刺激或口服耐受所引起的细胞变化。CD 45的总数+从对照组小肠固有层分离出的白细胞、EC刺激小鼠和口服耐受小鼠均无显着性差异(图二)。斯2)。CD4丰度+和CD8+T细胞，B 220+B细胞，CD11b+CD 68+巨噬细胞和CD11c+树突状细胞在EC刺激或口服耐受时变化不明显(图)。4B-E)。值得注意的是，CCR 3的频率和数量。+西格莱克+EC攻击小鼠小肠嗜酸性粒细胞显著增加(图一)。4A)，表明皮肤和胃肠道嗜酸性粒细胞之间存在双向关系。口服耐受小鼠小肠嗜酸性粒细胞的频率和数量与对照组小鼠相当(图1)。4A).

嗜酸性粒细胞缺乏的ΔdblGATA小鼠皮肤和小肠炎症改变被抑制。

当诱导的口服耐受抑制EC刺激引起的小肠嗜酸性粒细胞增多时，我们推测嗜酸性粒细胞介导了EC刺激引起的小肠炎症改变。为证实这一点，对嗜酸性粒细胞烧蚀的ΔdblGATA小鼠进行了EC攻击，并对其皮肤和小肠的免疫反应进行了分析。虽然没有观察到嗜酸性粒细胞，但EC挑战成功地诱发了Th2型皮肤炎症，如皮肤厚度的显著增加所示(图一)。5A和B)和血清抗OVA、IgE和IgG 1水平(图1)。斯3)，以及通过对.的升级换代。IL5和IL 13在EC攻击的ΔdblGATA小鼠的皮肤上与对照ΔdblGATA小鼠的皮肤进行比较(图1)。斯4A)。但EC攻击ΔdblGATA小鼠的皮肤厚度和组织病理学改变明显低于野生型小鼠(图1)。5(a和B)。此外，在EC刺激的ΔdblGATA小鼠血清中OVA特异性IgE和IgG 1的水平低于EC刺激WT小鼠的血清IgE和IgG 1水平。斯3)，表明嗜酸性粒细胞缺乏时局部和全身过敏炎症反应的减弱。与这些发现相一致的是，与过敏性炎症相关的基因的表达，如Il1rl1和IL 33，EC刺激的ΔdblGATA小鼠的皮肤与WT小鼠相比明显下降(图1)。5C)。此外，炎症介质的mRNA表达，包括IL1b, IL6, 肿瘤坏死因子, IL17A，和CCL 5，在小肠中显著减少，而Cldn4在EC刺激的ΔdblGATA小鼠中，其mRNA表达明显高于EC刺激的WT小鼠(如图所示)。5D)。MRNA表达Ccr3和Prg 2，与嗜酸性粒细胞迁移和激活相关的基因在EC刺激的ΔdblGATA小鼠的皮肤和小肠中均明显低于WT小鼠(图1)。5c和D)。嗜酸性粒细胞缺乏不可能影响口腔耐受诱导，考虑到口服耐受和EC刺激的ΔdblGATA小鼠的皮肤厚度和血清抗OVA、IgE和IgG 1水平明显低于EC刺激的ΔdblGATA小鼠，与口服耐受和EC刺激的WT小鼠相比，差异有显着性(图1)。5B和S3).

抗生素处理引起的肠道微生物群耗竭抑制了OVA EC攻击小鼠皮肤和小肠的炎症变化。

我们推测肠道微生物群可能调节皮肤和小肠的免疫反应，因为EC刺激或口服耐受性改变了微生物的组成。为了探索这一想法，我们口服万古霉素和克林霉素联合使用来消耗肠道细菌(如图所示)。6A)。用抗生素处理的小鼠盲肠标本进行实时聚合酶链反应显示，革兰氏阳性和革兰氏阴性的细菌门明显减少(如图所示)。斯5)。虽然抗生素治疗和EC攻击小鼠的血清抗OVA IgE和抗OVA IgG 1水平显着提高(图一)。斯6与抗生素治疗对照组相比，皮肤炎症介质水平升高(图一)。斯7A与未接受口服抗生素治疗的EC攻击小鼠相比，皮肤炎症的病理变化几乎完全被抑制(见图)。6b和C)。皮肤分析显示，先天(IL1b和Il1rl1)和Th2型细胞因子(IL5)，以及编码与嗜酸性粒细胞激活相关的蛋白质的基因(Ccr3, Prg 2，和CCL 11)和肥大细胞(Mcpt 1)抗生素治疗和EC攻击小鼠(图一)。6d)。在抗生素治疗下，小肠炎症细胞因子的表达在EC刺激下没有增强(图1)。斯7b)，我们观察到IL1b, 肿瘤坏死因子, IL17A, Mcpt 1, Ccr3，和CCL 5在EC攻击小鼠的小肠中(见图)。6E)。肠道微生物群的减少对诱导口腔耐受性没有明显影响，因为抗生素治疗、口服耐受和EC攻击小鼠的皮肤厚度都有明显的降低(图一)。6C)和血清抗OVA IgE水平。斯6)，以及过敏性炎症介质的表达。斯7A)与抗生素处理和EC攻击小鼠相比，皮肤中的含量也有所下降。

因为肠道暴露在大量的外来抗原物质中，并且被多种共生微生物所占据。16口服耐受是由口服无害抗原引起的局部和全身免疫无反应，是维持免疫稳态的关键。16,23。我们曾证明，口服耐受性诱导抑制EC抗原暴露引起的皮肤过敏炎症，增加肠系膜淋巴结耐受性免疫介质。18。在很大程度上尚不确定口服耐受是否会引起小肠的免疫改变，后者为口服抗原的吸收提供了广阔的表面，并包含大量先天和适应性免疫细胞。21。在此，我们证明小肠以前未被描述的功能有助于AD的发病机制和口服耐受介导的保护AD样炎症的发展，通过调节肠道免疫微环境。

皮肤上皮屏障功能障碍是遗传和环境因素共同作用的结果，它不仅是AD的一个标志，而且也是EC对食品蛋白致敏的重要危险因素。24。在我们的研究中，先天细胞因子基因的表达显著增加(IL6)，Th17型炎性细胞因子(IL17A)和嗜酸性粒细胞相关标记物(Ccr3)和肠上皮紧密连接分子基因的表达下降。Cldn4)在小鼠小肠内观察。虽然白细胞介素-17在变态反应性疾病中的作用仍然很大程度上还没有解决，但最近的研究表明，Th17的免疫反应在AD的慢性炎症中起着重要的作用。25,26。如电刺激小鼠所示IL17A我们认为IL-17可能与皮肤和肠道AD的发病机制有关。考虑到大肠炎症介质的表达不受EC刺激的影响(图1)。斯8)，可以认为皮肤通过受损的皮肤上皮接触蛋白质抗原会引起小肠炎症性改变和上皮损伤。与此相一致的是，人们观察到机械性皮肤损伤通过全身释放炎症细胞因子从受损的角质形成细胞中增加肠道通透性。27。我们还观察到，血清可溶性CD 14水平虽然不高，但仍有增加，这反映了肠屏障功能障碍。28，在EC攻击小鼠中，(P=0.0745，图1。斯9)。养分的吸收只发生在小肠，因为消化酶和营养转运蛋白嵌入在小肠的上皮中。21。此外，与结肠固有层相比，小肠的固有层含有多种白细胞，树突状细胞、Th17细胞和嗜酸性粒细胞的频率较高，有助于维持小肠屏障的完整性。29,30,31。Foxp 3的诱导+肠系膜淋巴结中的调节性T细胞对于通过口服途径引入的抗原诱导系统无反应是至关重要的。23,32。我们以前观察到通过口服耐受性诱导，小鼠肠系膜淋巴结中耐受性免疫介质的表达和调节性T细胞的增加。18。虽然.的表达Foxp 3EC攻击小鼠小肠中mRNA与口服耐受无明显变化(数据未显示)，口服耐受导致炎症介质和嗜酸性粒细胞相关标记物的调节下降，并恢复正常。Cldn4随着EC暴露于OVA所致皮肤变应性炎症特征的减轻，小肠中的表达也随之减少。考虑到小肠内的免疫微环境向树突状细胞提供信号，树突状细胞识别和呈现给肠系膜淋巴结中幼稚T细胞的口服抗原。33我们建议口服耐受性通过抑制肠道相关淋巴组织对口服抗原的敏化作用，促进小肠内的稳态免疫反应，并通过抑制肠相关淋巴组织对口服抗原的敏化作用，提供对皮肤致敏的保护。

致敏小鼠剥脱带皮后，皮肤和小肠嗜酸性粒细胞增多，与嗜酸性粒细胞浸润和活化相关的标记物mRNA表达增加。因此，与WT小鼠相比，嗜酸性粒细胞缺乏的小鼠在EC刺激下引起的致病性皮肤变化减弱，皮肤和小肠中几种炎症介质的水平降低。与这一发现相一致，最近已经证明，EC过敏原暴露导致在过敏原攻击部位的嗜酸性粒细胞的局部浸润，也增加了过敏原未暴露的肠道中嗜酸性粒细胞的浓度。34。嗜酸性粒细胞是终末期效应白细胞，与Th2型炎症的发病有关，因为它们能够释放储存在细胞质中的细胞毒颗粒。35。除了这些细胞毒性蛋白外，嗜酸性粒细胞还拥有一系列预先形成的分子，这些分子与分布在特定组织中的各种生物反应有关。36,37。由于小肠固有层拥有体内最大的嗜酸性粒细胞池，小肠嗜酸性粒细胞释放的免疫介质与各种稳态免疫反应相结合，形成了肠道的微环境。37。在嗜酸性粒细胞缺乏的ΔdblGATA小鼠中，EC挑战并没有导致小肠炎症介质水平的升高(图一)。斯4B)的表达量显著下降。IL1b, IL6, 肿瘤坏死因子，和CCL 5，随着表达的增加Cldn4EC暴露于OVA后的小肠，与WT小鼠相比。考虑到口服耐受和EC攻击小鼠小肠嗜酸性粒细胞水平和所列介质的表达降低，我们认为口服耐受通过调节分布在小肠内的嗜酸性粒细胞的炎症活动来控制皮肤抗原攻击引起的肠道炎症改变。

皮肤和肠道作为外界环境的主要界面，在维持生理稳态中起着重要的作用。19,38。虽然皮肤与肠道之间双向通讯的细节尚不清楚，但我们已经证明，EC OVA刺激引起肠道菌群的组成改变，抗生素介导的肠道菌群耗竭改善了EC挑战引起的实验性AD的严重程度。EC刺激前对OVA的口服耐受阻断了EC刺激引起的肠道细菌群落的整体转移及皮肤和小肠的相关炎症变化，表明肠道微生物在调节宿主免疫应答中起着关键作用。由于肠道微生物学失调，导致AD的风险增加。3,39我们推测，在诱导口服耐受或EC攻击之前，肠道细菌的减少可能会增加实验性AD的易感性。然而，肠道菌群耗竭的小鼠表现出全身和局部炎症反应减弱，表皮致病性改变明显减少。与这一发现相一致的是，在肠道细菌枯竭的成年小鼠身上，银屑病性皮炎得到了改善。40。考虑到早期肠道细菌的扰动会增加对多种炎症疾病的易感性。40,41,42认为肠道菌群在儿童和成年期形成免疫反应中具有独特的作用是合理的。

总之，通过对皮肤和肠道免疫反应的详细分析，我们发现口服耐受性能保护小鼠免受AD样皮炎的影响，并能抑制小肠嗜酸性粒细胞增多和肠道菌群失调。小肠嗜酸性粒细胞和肠道细菌在实验性AD易感性中的重要性，进一步证实了嗜酸性粒细胞缺乏和肠道细菌缺乏的小鼠皮肤的促炎症变化。由于EC刺激下小肠Th2型细胞因子的表达在嗜酸性粒细胞缺乏和缺乏细菌的小鼠中与未处理的小鼠相当，小肠嗜酸性粒细胞或肠道细菌可能有助于维持肠内稳态的微环境，而不是影响肠道的过敏敏化。考虑到嗜酸性粒细胞缺乏和细菌缺乏的小鼠继续表现出口服耐受引起的AD样炎症的减弱，我们推测肠道的额外调节亚群有助于调节过敏性皮肤炎症，这需要进一步阐明。