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表观血凝素疫苗对猪H3流感病毒的广泛交叉反应免疫

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发表时间:2021-03-09 10:51作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

甲型流感病毒感染猪,除了它的人畜共患病潜力外,还会影响农业。在这里,我们利用注解,一种计算算法,设计了一种通用的猪H3流感疫苗。该表血凝素蛋白用腺病毒5型载体传递,并与野生型血凝素和商业灭活疫苗FluSure进行了比较。在小鼠中,疫苗接种会导致对不同的swH 3分离株产生显著的交叉反应抗体和T细胞反应。在接种三种不同的swH 3病毒后,警号疫苗还可以降低小鼠的体重下降和肺病毒滴度。猪免疫研究表明,与野生型疫苗和流感疫苗相比,该疫苗免疫后的交叉反应抗体和T细胞反应水平更高。在小鼠和猪的模型中,注解疫苗显示出更好的交叉反应免疫,这应该作为一种通用的swH 3疫苗来进一步研究。

导言

猪流感是一种传染性很强的呼吸道病毒,在世界各地的猪群中流行。1。猪甲型流感病毒(IAV-S)可引起人畜共患病,对人类健康构成潜在威胁。2,3。当猪源的流感病毒感染人类时,它被称为变异型感染。自2010年以来,美利坚合众国报告的人体IAV-S变异感染超过460例。4。猪容易感染猪流感、禽流感和人类流感病毒,使它们成为新型重组流感病毒的完美“混合容器”。2,5。如果发生人畜共患病,这些新的重组病毒具有很大的大流行潜力,2009年H1N1“猪流感”大流行就证明了这一点。这种高度重组的猪源性流感病毒迅速传遍全球,感染了世界上惊人的24%的人口。6,7。作为21世纪的第一次流感大流行,这凸显了人畜共患病的IAV-S对人类健康的威胁。

IAV-S不仅构成了人畜共患病对人类健康的潜在威胁,而且也给猪肉产业带来了沉重的负担。猪的IAV-S感染导致高发病率,许多症状与人类流感感染相同。8。IAV-S感染会给猪生产厂家造成巨大的经济损失,每头市场猪的成本估计高达10.31美元。9。在美国,超过95%的养猪场为断奶猪接种了预防IAV-S感染的疫苗.然而,尽管接种了疫苗,这些地区中仍有50%的地区报告了其牛群中的IAV-S感染。10。这突出了对高度多样化和不断演变的流感病毒进行疫苗接种的持续挑战。目前,大多数商用iv-S疫苗是传统的包括h1和h3亚型的全灭活病毒(Wiv)疫苗,通常带有水包油佐剂。11。然而,这些商业疫苗是不经常更新,并没有保护,以防止大量的IAV-S在猪种群中流通。这导致了自生疫苗或定制疫苗的使用,这些疫苗含有特定于羊群的IAV-S毒株,并且仅限于在该群体中使用。据估计,出售的IAV-S疫苗中有50%是自体疫苗。10,11,12。然而,自体疫苗有许多缺点,包括用于诊断、分离、病毒生长和纯化的劳动强度高的实验室技术,这会导致疫苗接种前的一个滞后时期。11。目前商用猪流感疫苗中可用的有限株,加上自体疫苗的重大缺陷,突出表明迫切需要一种通用的猪流感疫苗。一种通用的猪流感疫苗可以减少IAV-S对猪肉产业的经济影响,同时也可以降低进入人类的紧急人畜共患流感病毒的风险。

目前,IAV-S亚型h1n1、h1n2和h3n2在全球猪群中流行。1。我们选择将重点放在猪H3(SwH3)亚型上,因为H3N2亚型占美国自2010年以来报告的IAV-S变异人感染病例的90%以上。4。SwH 3亚型是高度多样化的,多种人对猪的引种事件建立了当代H3N2菌株在世界不同地区流通。在欧洲,猪h3n2亚型是在20世纪70年代初从人类血统的h3n2菌株引进后出现的。8,13。然而,在北美,h3亚型直到1998年才在猪群中被发现,当时出现了一种三重组合的h3n2病毒。14。北美毒株分为第一-Ⅳ组,第四组又分为A-F组,与当代欧亚毒株不同。8。此外,在2010-2011年,一种人类季节性h3n2病毒被传播到北美猪身上,并建立了类似人类h3病毒的谱系,这些病毒在抗原上有别于其他北美集群。15,16。SwH 3群体的高度多样性是疫苗开发中的一个重大挑战,该疫苗诱导了广泛交叉反应性免疫的强大水平。

这项研究旨在评估一种名为“注解疫苗设计工具”的疫苗抗原设计者,用于设计一种通用的swH 3流感疫苗。17。注释是一种基于图表的算法,它创建了一种疫苗抗原的混合物,旨在最大限度地扩大高度多样化群体的潜在表位覆盖范围。这个注释算法已经被用来预测治疗性的HIV疫苗候选。18作为一种泛丝状病毒疫苗,在体内有着广阔的应用前景。19。在此,我们通过计算设计了三种swH 3血凝素(HA)的混合物,即流感表面糖蛋白(HA),在研制通用的swH 3疫苗时,我们利用了疫苗设计器。这是第一份评估用于广泛反应性流感疫苗设计的注解算法的报告。在复制缺陷型腺病毒5型(HAdV-5)载体上表达HA免疫原,并与野生型HA(TX98)和商品化灭活佐剂疫苗FluSure进行比较。我们通过检测小鼠和猪的抗体和T细胞反应来评价该疫苗的交叉反应性。此外,我们还评估了小鼠对三种不同的swH 3菌株的交叉保护性免疫。这些数据支持在研制通用的swH 3疫苗时使用铭文免疫原。

结果

SwH_3表观HA疫苗的研制与鉴定

我们使用注释疫苗设计工具设计了swh 3表位HA,这是一种基于图表的算法,它创建了一组免疫原的混合物,旨在最大限度地扩大群体中潜在的表位覆盖范围。17,18。首先,疫苗设计人员确定指定长度的每个潜在表位的频率(K-mer)在目标人群中。然后,该算法使用一种基于图表的方法来跟踪HA蛋白的路径,该路径包含人口中最常见的表位,从而得到计算设计的完整的HA蛋白(注1)。从设计上看,第一个铭文在其组成上往往是非常核心的(如图所示)。1A)。然后,该算法被重复,以创建互补的注释序列,尽可能减少包含在先前的注释免疫原中的潜在表位。这样,注释2和3结构通常分别包含第二和第三最常见的表位。这些序列将在系统发育中作为孤立点出现,因为它们的组成反映了与整个树的序列不同的k-mer频率(图)。1A)。由此产生的三价表位序列为一个3蛋白集提供了群体中潜在线性表位的最佳覆盖范围,将可能导致类型特异性免疫反应的稀有表位的包含量降到最低,而且尽管每个表位都是人工的,但每个表位都类似天然HA蛋白,从而能够同时诱导抗体和T细胞反应。

图1:铭文疫苗结构的特征。

这三种swH 3表位免疫原是利用疫苗设计工具进行计算设计的,目的是创造一种混合免疫原,以最大限度地扩大群体中潜在表位的覆盖范围。三个表表血凝素(HA)免疫原与1561个独特的猪H3 HA序列进行了集群W比对。构建了一棵近邻连接树,直观地观察了疫苗免疫原与swH 3序列群体之间的系统发育关系。对德州/1998(TX98)野生型HA比较器和两株流感毒株进行了系统发育树标记。注释、通配符和FluSure疫苗分别显示在蓝色、绿色和黑匣子中。北美星系团,2010年类人类血统,和欧亚血统在虚线上被圈起来(a)。将上述三种免疫原和TX98HA克隆到复制缺陷型5型腺病毒(HAdV-5)载体中,通过westernblot检测HA蛋白的表达。GAPDH用作细胞蛋白质负载控制(b)。三个独立的Westernblot实验证实了HA蛋白的表达。

将得到的3个序列序列与原始的swH 3序列群对齐,构建了一棵系统发生树,直观地显示了它们与swH 3群体的关系。三个铭文swH 3免疫原定位于系统发生树(图1)。1A)。为了评价该疫苗的计算设计,我们选择了一个位于树中心附近的HA基因(A/猪/德州/4199-2/1998[TX98])作为野生型比较器。此外,我们还将我们的铭文疫苗与一种商业化的IAV-S疫苗--FluSure进行了比较.FluSure是一种灭活的水中油佐剂疫苗,含有两株北美swH 3株(连同两株H1株),属于北美IV-A和IV-B群。将3个swH 3基因和TX98野生型HA比较器克隆到复制缺陷型HAdV-5载体中进行基因表达。基因表达经Westernblot证实。1B)和病毒粒子(Vp)与感染单位的比率,以确定种群之间的近似传染性(补充表)。1).

用尾针免疫小鼠产生了强烈的交叉反应抗体反应。

我们首先评估了小鼠接种疫苗后的免疫反应。Balb/c小鼠(n=10)接种了1010Hadv-5-铭文疫苗的vp,该疫苗由三种hadv-5-毒株的比例相等,总数为10。10副总裁。我们的铭文疫苗与接种10种疫苗的小鼠进行了比较。10HAdV-5-TX98野生型比较器的VP或50μL的FluSure(相当于3周龄猪等效剂量的10✕)。用PBS假疫苗作为阴性对照。三周后,用同样的疫苗刺激小鼠。免疫后2周处死小鼠,检测接种后的体液和细胞免疫反应。2A)。用血凝抑制试验(HI)检测抗体反应的交叉反应性.我们选择了一个由20个swH3菌株组成的小组,这些菌株代表了swH 3系统发育树的大部分多样性。这个小组包含来自多个北美集群以及欧亚分离物的有代表性的菌株。此外,该小组还包含了来自当代2010年类人类血统的类人类菌株,以及从人类到猪的传播事件(科罗拉多/1977年)中产生的一种类似人类的历史菌株。建立了一个系统发育树,以检验所选的20个菌株与疫苗株之间的关系(图1)。2B;补充表2)。在20株(70%)的swH 3菌株中,用免疫球蛋白免疫产生强烈的交叉反应抗体反应,HI滴度为40~14株。铭文疫苗对北美和2010年类人菌株的交叉反应最大,13株(85%)北美株和2010年类人株中HI滴度为40~11株。对欧亚株,在4株欧亚株中,警号疫苗诱导的HI滴度为≥40~1。更重要的是,与TX98和FluSure组相比,在20株swH 3毒株中,有11株疫苗免疫诱导的抗体滴度明显高于TX98和FluSure组(图1)。2C)。相比之下,TX98野生型比较器和FluSure免疫小鼠分别对20株(15%)和20株(20%)swH 3株中的3株(15%)和4株(20%)产生了较强的抗体滴度(≥40)。TX98组对得克萨斯/1998的匹配病毒产生了强烈的抗体反应,并且仅与其他两种病毒(怀俄明州/2013和明尼苏达/2012)的交叉反应性有限。FluSure疫苗组对两种IV-A群病毒和明尼苏达/2012簇IV-B株(与疫苗株相匹配)产生了强烈的抗体反应。然而,流感疫苗只提供有限的交叉反应与不匹配的病毒。

图2:小鼠免疫后与swH 3株交叉反应的抗体反应。

Balb/c小鼠(n=10)按时间和疫苗剂量接种(a)。为了检测疫苗接种后抗体反应的交叉反应,我们选择了一组跨越系统发生树的20株swH 3菌株。构建了一棵最大似然树,直观地显示了这些检测菌株与疫苗免疫原之间的关系。b)。群集或谱系名称在整个应变名称之后的括号中。两周后处死小鼠,用HI法检测20株swH 3代表菌株的血清。c)。簇或谱系的命名可以看到以上的HI效价条,为每一个品种(单向方差与图基的多重比较,与铭文组;n=10只小鼠,除n=5内布拉斯加/2013、明尼苏达/2011、俄亥俄/2016、丹麦/2011、意大利/1985、香港/1976、意大利/1995)。数据以标准误差(SEM)表示。建立了这些HI效价的热图,以进一步显示每种疫苗的总交叉反应抗体反应。

表观免疫小鼠具有较高的总T细胞反应,并能识别4个不同的swH 3菌株的表位。

交叉反应性T细胞在流感病毒感染期间病毒清除中起着重要作用。20,21。因此,我们想要评估免疫后T细胞反应的交叉反应性是否增加。为了检查交叉反应性,我们选择了4个swH 3菌株,它们代表了swH 3多样性的很大一部分。构建了俄亥俄/2011株(第IV-A群)、马尼托巴/2005(第四群)、德克萨斯/1998(第一群)和科罗拉多/1977(类人)的肽阵列。用干扰素γELISPOT对每株菌株的T细胞反应进行了定位,其中含有17-mERS的重叠肽阵列与10-氨基酸重叠。肽被认为是阳性的,如果反应大于50点形成细胞(证监会)每百万。与TX98疫苗接种的小鼠相比,注射疫苗的小鼠在所有四种swH 3菌株中识别出更多的表位(如图所示)。3A)。有趣的是,尽管无法检测到针对科罗拉多/1977病毒的抗体应答,但该疫苗对科罗拉多/1977病毒的T细胞反应却很明显。因此,在没有可检测到的交叉反应抗体的情况下,该菌株被专门用于检测交叉反应T细胞的潜能。相比之下,接种流感疫苗的小鼠在接种疫苗后并没有产生明显的T细胞反应。3)。对每个肽的反应大小显示HA1区(HA蛋白的氨基酸120-128)有一个免疫显性表位,在接种疫苗后的四个菌株中都是阳性的。该表位可与BALB/c小鼠的mhc-i复合物紧密结合。22,23因此,很可能是一个免疫显性的CD8表位。3B;补充图。1)。有趣的是,免疫小鼠的T细胞在德州/1998肽阵列中识别这一免疫优势表位,而TX98免疫小鼠的T细胞却没有。一种可能的解释可能是肽的加工和表达上的差异,这取决于周围的序列。总体而言,免疫小鼠对所有4株swH 3菌株的T细胞反应明显增强(图1)。3C).

图3:4株不同的swH 3株疫苗接种后的T细胞表位图。

BALB/c小鼠脾细胞n5)用干扰素γELISpot进行细胞免疫分析。针对俄亥俄/2011、马尼托巴/2005、得克萨斯/1998和科罗拉多/1977菌株的T细胞表位使用一个由17-MERS和10-氨基酸重叠组成的重叠肽阵列进行了定位,该重叠覆盖了整个血凝素(HA)蛋白。肽反应>50/百万点形成细胞被认为是阳性的.每种疫苗的阳性肽及其在HA蛋白上的位置(a)。肽数表示肽中最后一个氨基酸在总HA蛋白中的位置。对每一阳性肽的反应水平报告为每百万个脾细胞证监会,虚线表示每百万证监会/百万的截止值(b)。所有疫苗接种组的T细胞对每个病毒肽阵列的总反应(n=5;单因素方差分析与图基的多重比较)(c)。数据以标准误差(SEM)表示。

用尾针免疫小鼠减轻小鼠体重下降和小鼠肺病毒滴度

接下来,我们想确定交叉反应抗体和T细胞反应的增加是否转化为来自不同的swH 3菌株的保护。Balb/c小鼠(n=10)接种一针10针10HAdV-5-铭文或HAdV-5-TX98、FluSure或PBS假疫苗的VP。3周后,小鼠被用鼠适应的swH 3攻击病毒进行攻击(如图所示)。4A)。为了检测单次免疫后的抗体反应,在攻击时用HI试验检测三种攻击菌株中的每一种(如图所示)。4B)。单次免疫后,≥40滴度达到俄亥俄/2011和马尼托巴/2005。相比之下,TX98疫苗对这三种病毒没有任何可检测的抗体应答,而流感疫苗接种导致俄亥俄/2011和马尼托巴省/2005的低滴度(≤40)。没有疫苗组对科罗拉多/1977株产生抗体反应,这使得它成为评估交叉反应T细胞反应的潜在贡献的理想菌株。实验结束后,观察小鼠体重下降的情况。实验后第3天,处死5只小鼠检测肺病毒滴度。我们用两种方法测定了肺病毒滴度。50和qPCR分别评估感染病毒和病毒RNA拷贝数。4).

图4:不同的swH 3病毒对攻击的防护。

Balb/c小鼠(n=10)接种了1010副总裁HAdV-5-铭文或HAdV-5-TX98,商业灭活液,或PBS假疫苗,并提出挑战,按照时间表(a)。对小鼠血清进行HI效价试验,检测单次免疫后小鼠对攻击病毒株的抗体反应。n=10;与图基的多次比较与铭文组比较的单向方差分析)(b)。小鼠在鼻内受到攻击(n=10)与104TCID50俄亥俄州/2011(c), 105TCID50马尼托巴省/2005(d),或103.5TCID50科罗拉多/1977年(e)并监测14天以上的体重减轻情况。体重减轻25%的小鼠被人道安乐死。感染3天后,每组处死5只小鼠,用tcid检测肺病毒滴度。50和qPCR(n=5;单因素方差分析与图基的多重比较(与铭文组比较)。数据以标准误差(SEM)表示。

在挑战俄亥俄/2011株(第IV-A群)后,只有警号疫苗才能完全保护小鼠免受体重减轻(图一)。4C)。相比之下,注射TX98、FluSure和PBS疫苗的小鼠在第3天体重下降了8%-12%。这种疫苗含有类似的IV-A株,虽然小鼠没有得到最初的减肥保护,但与PBS接种的小鼠相比,小鼠在第8天恢复得更快(p < 0.0001). In addition, epigraph vaccinated mice showed significantly reduced day 3 lung viral titers as compared to the TX98, FluSure, and PBS vaccinated mice (Fig. 4C).

对马尼托巴/2005菌株(第四组)的挑战使接种了FluSure和PBS疫苗的小鼠体重严重减轻,而附图和TX98免疫小鼠则不受体重减轻的影响(图一)。4D)。然而,注射疫苗的小鼠在攻击后第3天的肺病毒滴度低于其他三个疫苗组。有趣的是,虽然针状图和TX98疫苗都能保护体重不减,但TX98疫苗接种组的肺病毒滴度明显高于接种组,这说明体重减轻并不总是与肺病毒滴度相关。24,25.

最后,我们受到了高度分歧的科罗拉多/1977年毒株的挑战。所有疫苗接种组均在攻击后早期体重减轻,但免疫后第6天,附图和TX98免疫小鼠的体重下降幅度明显低于FluSure和PBS免疫小鼠(图一)。4E; p < 0.001). Since epigraph and TX98 vaccination does not induce detectable anti-Colorado/1977 antibody responses, the early weight loss but the increased recovery could be a result of T cell-mediated protection. Again, epigraph vaccinated mice showed significantly lower lung viral titers on day 3 as compared to the TX98, FluSure, and PBS vaccination mice (Fig. 4E).

摘要疫苗接种导致对多种人H3株产生交叉反应抗体和T细胞反应。

反向人畜共患病是人向猪传播流感病毒的过程,是影响猪iv-S多样性的关键因素。1,26,27。因此,我们想确定我们的swH 3疫苗是否能诱导对人类H3(HuH 3)株的交叉反应性免疫反应,以减少反向人畜共患病事件。我们选择了7株huH 3菌株为研究对象,采用HI法对交叉反应抗体反应进行了评价。构建了一棵系统发育树,研究了这7株毒株与疫苗株的关系(图1)。5A)。在7株(43%)huH 3株中,≥抗体效价较高(43%)。5B)。血栓素98疫苗接种后,7株≥抗体效价为40~2株(29%),与这两株菌的抗体效价(>95.9%)密切相关。5A,补充表3)。相反,接种流感疫苗不会对任何一株huH 3菌株产生交叉反应抗体反应。

图5:交叉反应性免疫与人类H3分离物的相关和保护。

(为了确定swH 3疫苗对huH 3株的交叉反应性免疫应答,选择了7株具有代表性的huH 3株作为研究对象。构建了一个最大似然系统发育树,直观地观察了这些huH_3检测菌株与swH_3疫苗免疫原的关系。a)。用免疫BALB/c小鼠的血清对这些HuH 3株进行了HI效价测定。2 (n=5;与图基的多重比较与铭文组比较的单向方差分析)(b)。建立了这些HI效价的热图,以进一步显示每种疫苗的总交叉反应抗体反应。从免疫小鼠中分离出的脾细胞也用干扰素γELISpot检测了对3株huH 3株的交叉反应细胞免疫应答。利用重叠肽阵列对密西西比/1985、爱知/1986和德克萨斯/1977菌株的T细胞表位进行了定位。肽反应>50/百万点形成细胞被认为是阳性的.每种疫苗的阳性肽及其在HA蛋白上的相对位置(c)。肽数表示肽中最后一个氨基酸在总HA蛋白中的位置。对每一阳性肽的反应水平报告为每百万脾细胞证监会,虚线表示每百万证监会/百万的截止值(d)。所有疫苗接种组的T细胞对每个病毒肽阵列的总反应(n=5;单因素方差分析与图基的多重比较)(e)。Balb/c小鼠(n=10)接种了1010Vp的hadv-5-铭文或hadv-5-xx 98,商业灭活疫苗流,或假pbs疫苗,然后挑战3周后,以10。4.3TCID50得克萨斯州/1977年(f)。监测小鼠体重下降情况,当体重减轻25%时,以人道方式处死。每组5只小鼠于感染后第3天处死,用TCID法检测肺病毒滴度。50和qPCR(n=5;单因素方差分析与图基的多重比较(与铭文组比较)。数据以标准误差(SEM)表示。

我们还使用带有重叠肽阵列的IFNγELISPOT评估了对三株huH3株(密西西比州/1985、爱知/1968和得克萨斯/1977)的交叉反应性T细胞反应。用swH 3分离株进行T细胞定位。有趣的是,疫苗接种诱导了T细胞对所有三个huH_3分离物中保守的单一免疫显性表位的反应(图一)。5C,d)。该表位与诱导产生的针对swH 3分离物的免疫显性表位相同(氨基酸位置为120-128)。在huH 3群体中,该表位中的氨基酸高度保守(在huH 3群体中~94%保守;附图)。2)。TX98疫苗对该免疫显性表位没有诱导T细胞反应,而FluSure疫苗对任何一株huH 3菌株都没有产生明显的T细胞反应。洞口疫苗接种也导致了对所有三个h3分离物的总T细胞反应(图一)。5E).

为了确定huh 3交叉反应性免疫反应是否产生了保护作用,我们用小鼠适应的huh 3德州/1977分离物对接种过疫苗的小鼠进行了攻击。Balb/c小鼠(n=10)接种一针10针10HAdV-5-铭文或HAdV-5-TX98、FluSure或PBS假疫苗的VP。3周后,小鼠接受德州/1977年的攻击。只有警号疫苗才能完全保护老鼠免于体重减轻和死亡(如图所示)。5F)。相比之下,接种TX98疫苗的小鼠在开始恢复之前,体重下降了16%以上。FLOSure和PBS接种后小鼠体重迅速下降,感染后第7天全部被人道安乐死。根据tcid的测量,在第3天,疫苗接种还降低了肺部感染病毒的检测水平。50(无花果)5F).

猪诱导的强交叉反应抗体和T细胞反应的警号免疫

最后,为了证实小鼠的实验结果转化为目标动物,我们给3周龄的猪注射了10只肌肉注射疫苗。11我们的hadv-5-铭文疫苗的vp,并比较了10种疫苗对猪的免疫反应。11VP的HAdV-5-TX98野生型比较器或商业疫苗剂量在制造商的推荐剂量.三周后,采集血清检测单次免疫后的抗体反应(图一)。6A)。单次免疫后,20株(65%)swH 3株中,≥抗体效价为40~13株(65%),与TX98组和FluSure组相比,20株中有11株产生较高的抗体应答率。重要的是,该疫苗产生交叉反应抗体(≥40)的13(85%)北美株和2010年人类类毒株后,仅一次免疫。与之形成对照的是,TX98只对得克萨斯/1998毒株产生较强的抗体滴度(≥40),单次免疫后不产生对任何一株swH 3的显著效价。

图6:猪疫苗接种后对swH3株的免疫应答。

为了证实在小鼠免疫后观察到的交叉反应免疫反应转化为目标动物,3周龄猪(n=5)接种了10枚疫苗11副总裁的HAdV-5-铭文或HAdV-5-TX98或商业灭活疫苗的剂量,根据制造商的指示。3周后,猪被放血检测一次注射后的抗体反应,然后用相同的疫苗和剂量进行增强。两周后,猪被人道地牺牲了。单次注射血清(a)或在推动(b)对20株具有代表性的菌株进行HI分析。在HI效价栏上方可以看到群集或谱系标识(n=5;单因素方差分析与图基的多重比较(与铭文组比较)。建立了这些HI效价的热图,以进一步显示每种疫苗的总交叉反应抗体反应。用干扰素γELISpot检测四株有代表性的swH 3菌株(俄亥俄/2011、马尼托巴/2005、得克萨斯/1998和科罗拉多/1977)对PBMC的总反应。n=4;TX98和FluSuren=5;单因素方差分析与图基的多重比较)(c)。数据以标准误差(SEM)表示。

启动后3周用相同的疫苗和剂量刺激猪,2周后处死,在免疫高峰时检测免疫相关。第二次免疫提高了免疫猪的交叉反应抗体滴度,20株(75%)猪的≥效价为40~15株(如图所示)。6B)。此外,与TX98疫苗接种相比,20株中15株的抗体滴度显著高于TX98,10株中的10株抗体滴度明显高于全剂量疫苗。与此形成对照的是,在20株(25%)swH 3菌株中,TX98疫苗接种猪的抗体效价(≥40)为5株,对得克萨斯州/1998毒株的抗体效价最高。用FluSure增强后诱导的最强抗体反应是针对与疫苗、IV-A群病毒和匹配的FluSure病毒相似的毒株(明尼苏达/2012;第IV-B簇)。有趣的是,使用FluSure的增强也增加了跨swH 3面板的交叉反应抗体反应,12株(75%)毒株中的≥效价为40到15。然而,对大多数不匹配病毒的反应明显低于免疫后的反应,平均低4倍的HI滴度。事实上,HAdV-5的单次免疫导致了与两种剂量免疫相当的交叉反应抗体水平。

为了证实HI法测定的交叉反应抗体反应也是功能性中和反应,我们进行了微整化试验。中和效价与HI试验中所见的相匹配,证实了这些交叉反应抗体的功能(补充图)。3)。增强后2周收集PMBCs,用干扰素γELISpot检测细胞免疫反应。洞口疫苗接种诱导了对所有4个swH 3菌株的最强烈的T细胞反应(如图所示)。6C)。TX98疫苗对得克萨斯/1998毒株产生了强烈的T细胞反应,但与其他三株swH 3株相比,只有轻微的交叉反应T细胞水平。疫苗接种不能产生可检测到的交叉反应性T细胞反应.

在接种后的猪血清也检查了交叉反应抗体的小组7株huH3。单次免疫后,在7种(43%)huH 3病毒中,出现强烈交叉反应抗体效价为40~3的病毒,在小鼠模型中表现出交叉反应性(图一)。7A)。与之形成对照的是,TX98疫苗接种后,7株(14%)huH 3株的抗体滴度为40~1,单次免疫后未见任何抗hH3株的交叉反应抗体。经过第二次免疫后,所有三个疫苗组的交叉反应抗体水平都增加了(如图所示)。7b)。在7株(86%)huH 3病毒中,≥4 0~6株(86%),而TX98和FluSure则分别使7株(43%)和4株(5 7%)huH 3病毒的抗体效价分别达到≥40~3(43%)和4株(5 7%)。然而,与TX98和流感疫苗接种相比,表观抗体对7个分离株中的3个菌株的抗体滴度明显提高。

图7:猪疫苗接种后对人H3株的免疫应答。

接种疫苗的猪的血清n5)采用HI法对7株具有代表性的7株huH 3菌株进行交叉反应性分析。一次注射后检测抗体反应(a)或助推(b)并建立了这些HI效价的热图,以进一步显示每种疫苗的总交叉反应抗体反应。n=5;单因素方差分析与图基的多重比较(与铭文组比较)。数据以标准误差(SEM)表示。

讨论

在本研究中,我们对泛交叉反应的swH 3 HA免疫原设计算法进行了评价,以建立一种通用的swH 3疫苗。理想的iav-S疫苗可在一次免疫后诱导保护性免疫,同时对不断进化的田间菌株提供广泛的保护。28,29。在这里,我们证明了我们的疫苗诱导了强烈的交叉反应的抗体反应的面板不同的swH 3病毒,这代表了很大一部分的swH 3多样性。免疫小鼠后,该疫苗对20种高度分化的swH 3病毒中的14株诱导出强的交叉反应抗体滴度。相比之下,TX98和FluSure疫苗在每种疫苗所含菌株之外的交叉反应有限。通过对猪的免疫研究,进一步证实了尾针免疫诱导的小鼠交叉反应性免疫增强。更重要的是,单次免疫针状图可产生较强的交叉反应抗体滴度,而用TX98或FluSure免疫则显示针对不匹配菌株的抗体开发有限。这一数据表明,HAdV-5-表观疫苗可以作为一种广泛交叉反应的疫苗来实施,只需要一次免疫就可以诱导出较强的免疫力。

重要的是,疫苗接种显示出对北美毒株的最大交叉反应抗体反应,13株北美毒株(85%)中的抗体效价为≥40至11,而2010年的类人毒株只在猪身上进行一次免疫。然而,疫苗接种对四种欧亚毒株和历史人类一样的科罗拉多/1977株的交叉反应性较低,后者定位于欧亚毒株附近。这很可能是数据库中欧亚序列减少的结果,因为用于构建铭文疫苗的下载序列中只有11%来自欧亚。因此,北美菌株占原始序列种群的绝大部分,因此,由于铭文疫苗设计算法的目标是创造一种免疫原组合,以最大限度地扩大群体中潜在的表位覆盖范围,由此产生的结构最好涵盖北美菌株。因此,目前的铭文疫苗在北美猪群中作为一种广泛的交叉反应疫苗将很有吸引力,但为了保护欧亚猪群,可能需要设计一种替代的疫苗。

有趣的是,在猪进行第二次免疫后,FluSure疫苗的抗体应答范围有所增加。然而,对不匹配菌株的反应强度平均比警号疫苗低4倍。该疫苗含有两株swH 3和一种水中油佐剂,可促进增强后所观察到的抗体宽度的增加。24,30。重要的是,这一数据表明,在流感疫苗接种过程中,增强抗体的作用是至关重要的。然而,当疫苗和挑战株HA不匹配时,水中油佐剂的灭活疫苗与疫苗相关的增强呼吸道疾病(Vaerd)的发展也有牵连。24,31。因此,在研制一种通用的IAV-S疫苗的目标中,迫切需要在不引起VAERD的情况下,开发新的疫苗平台来防止异源感染。在这里,我们使用了一个hadv-5载体,它可以减少病毒的脱落而不会引起病毒的变异。32。此外,hadv-5载体疫苗在母源抗体存在的情况下也显示出有效性,这限制了灭活疫苗的效力。33,34,35,36。在本研究中,我们证明HAdV-5-表观swH 3疫苗只需一次免疫就能诱导出高滴度的交叉反应抗体。相比之下,HAdV-5-TX98疫苗诱导的相对菌株特异性免疫反应有限.因此,腺病毒载体只需一次免疫就能诱导出较强的免疫力,而疫苗的计算设计有助于交叉反应抗体的诱导。

接种IAV-S疫苗有两个直接好处:(1)减少猪的临床疾病,以防止经济损失;(2)减少病毒脱落,以减少在畜群内的传播。28。这减少了病毒的脱落,也降低了向人类扩散感染的可能性。我们对小鼠的挑战研究表明,与其他疫苗组相比,与其他疫苗组相比,免疫疫苗除了减少体重之外,还能最大程度地降低三种不同的swH 3病毒的肺病毒滴度。这种病毒滴度的降低可能导致病毒脱落减少,从而减少种内和种间的传播。然而,猪的挑战研究是需要的,以支持交叉保护的效力,见下文铭文疫苗在小鼠身上。

流感病毒从人到猪的传播是导致IAV-S病毒多样性的原因之一。26,37。在这里,我们已经证明,在小鼠和猪接种疫苗后,对多株huH3菌株产生交叉反应性抗体滴度。重要的是,单次免疫猪只对7株huH3株中的3株产生交叉反应抗体滴度,而用TX98或FluSure单次免疫则分别诱导7株huH3株中的1株或0株产生抗体滴度。此外,该疫苗诱导小鼠交叉反应性T细胞反应,完全保护小鼠在攻击后体重减轻和死亡与致命的huH 3株。这一数据表明,单次使用swH 3免疫可以保护猪免受几种huH3毒株的感染,但需要在猪身上进行挑战研究来证实这一点。

除了强烈的交叉反应抗体应答外,HAdV-5-表观疫苗还诱导了对猪和人流感病毒的强交叉反应性T细胞免疫。在小鼠中,我们检测到一个免疫显性T细胞表位,预测是一个细胞毒性T淋巴细胞CD8表位,以及多个亚显性T细胞反应,可能是CD4 T辅助细胞(Th)。此外,猪的尾注疫苗对4个不同的swH 3菌株诱导了明显的T细胞反应。在人类中,交叉反应T细胞和记忆T细胞的发育与对流感病毒的长期免疫有关。38,39,40,41。相比之下,T细胞在猪流感感染中的作用还没有得到很好的界定。以前对猪的研究表明,在没有可检测到的抗体的情况下,对不同的IAV-S毒株具有交叉保护作用。42,43,44,45。这表明交叉反应的T细胞反应在保护IAV-S的作用,这也可能导致长期的持久免疫。然而,虽然T细胞在保护人类流感病毒感染中的作用已经被证明,但还需要进一步的研究来充分阐明T细胞反应在预防猪流感感染中的作用。此外,猪的长寿研究将需要建立铭文疫苗诱导免疫的持久性。

在这里,我们已经证明了铭文疫苗设计工具在开发一种广泛交叉反应的swH 3流感疫苗中的有效性。我们的结果不仅提供了一种很有前途的猪流感疫苗,而且也为人类流感提供了一个模型。事实上,猪的流感感染与人类的流感感染有很多相似之处,例如临床症状相似,病毒受体在呼吸道的分布,以及引致流行性感冒的亚型。46。因此,猪是开发和检测通用流感疫苗的优良模型。利用我们的研究成果,本研究成果可应用于人类流感疫苗的研究,为人类流感疫苗的研制提供了一种新的候选疫苗。此外,未来的研究还可以探讨每一个铭文结构对诱导交叉反应免疫的贡献。在本研究中,我们展示了免疫后广泛交叉反应的体液免疫和细胞免疫,在小鼠和猪的模型。这些数据支持了作为一种通用的swH 3疫苗,能够提供交叉保护,以对抗高度分歧的swH 3毒株的铭文疫苗的发展。


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