复发性多发性骨髓瘤表现出明显的免疫微环境和恶性细胞介导的免疫抑制

免疫治疗在复发性多发性骨髓瘤(MM)中显示出一定的疗效。然而，这些治疗可能依赖于功能性肿瘤免疫微环境(ITME)的有效性。描述ITME在疾病过程中的演变是优化免疫治疗时机所必需的。我们对39例MM患者(13例新诊断的[NDMM]，11例复发的Daratumab前接触[RMM]和13例三重难治性(TRMM)的MM患者的骨髓标本进行了质量细胞分析、细胞因子分析和RNA测序。发现三个不同的细胞ITME簇，第1组主要由NDMM和RMM患者组成，第2组和第3组主要由TRMM患者组成。我们发现，在第2组和第3组中，幼稚T细胞减少，第2组以衰老T细胞增多为特征，而第3组则以早期记忆T细胞减少为特征。与第1组相比，第2和第3簇中的浆细胞可上调E2F转录因子和MYC增殖途径，下调干扰素、转化生长因子-β、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α信号通路。本研究表明，与第1组相比，MM-ITME变得越来越不正常，而MM克隆可能不依赖于炎症介导的生长途径，对IFN介导的免疫监视不太敏感。我们的发现可能解释了TRMM患者对新的免疫治疗的敏感性降低的原因。

尽管出现了治疗多发性骨髓瘤(MM)的新的治疗方案，但这种疾病仍然无法治愈。随着时间的推移，患者的预后继续改善。1，大量的研究表明，复发后的结果很差。2,3,4。三重难治性患者(在使用蛋白酶体抑制剂(PI)、免疫调节药物(Imid)和抗CD 38单克隆抗体治疗后进展特别差)。5。肿瘤的内在和外在因素导致疾病的难治性。MM是一种由基因异质的多个亚克隆组成的疾病。治疗诱导的克隆选择与克隆进化6,7,8在疾病进展中起作用。除了浆细胞克隆的改变外，正常骨髓免疫微环境(ITME)的改变也会导致肿瘤逃避免疫监视。9,10,11,12。利用免疫系统来控制MM进展的重要性在于最近在大量预处理的MM患者中使用了基于免疫的治疗方法。这些基于免疫的治疗依赖于功能性ITME的有效性。然而，目前的模式是，用于细胞治疗的免疫效应细胞(即嵌合抗原受体T细胞[car-T])是在许多免疫调节疗法失败后获得的，这些疗法彻底改变了他们免疫系统的细胞组成，并可能选择更具攻击性的克隆。因此，虽然免疫治疗方法显示出了有希望的结果13,14,15,16对于治疗较重的三重难治性疾病的患者，他们的疗效不高也就不足为奇了。14,17,18.

了解复发骨髓瘤的转录(肿瘤)和免疫组织学前景是必要的，以了解疾病进展的驱动因素和现有治疗的难治性。ITME的特征还可以为选择最佳的时间来获取免疫效应细胞用于细胞治疗，以及理想的基于免疫的治疗序列提供依据。因此，本研究的目的是用多组学的方法来描述新诊断的、复发的和三重难治性MM患者的恶性浆细胞转录体、体液ITME(细胞因子)和细胞ITME。

对新诊断的多发性骨髓瘤(NDMM)患者、对蛋白酶体抑制剂(PI)和(或)免疫调节药物(IMID)不耐药但对抗CD 38单克隆抗体(RMM)不耐药的患者、对PI、IMID和抗CD 38单克隆抗体不耐药的患者(TRMM)进行了Mayo临床生物谱数据库的检索。除1例患者外，其余患者均有以下骨髓标本类型：CD 138+分类浆细胞、CD 138−分类或未分类单个核细胞、BM血浆。1例患者没有CD 138−细胞，被排除在流式细胞术分析之外。在我们的机构，病人在自体干细胞移植后大约2-3个月进行常规骨髓活检，以评估疾病的反应。然而，移植后骨髓样本被排除在预期的显著扰动ITME在这个时间点。回顾电子病历，获得患者的临床特征和治疗信息。所有患者都同意将他们的BM样本和临床数据用于研究目的，这项研究得到了梅奥诊所机构审查委员会的批准。

Luminex分析

应用Luminex xMAP技术测定BM血浆中细胞因子和趋化因子蛋白水平。在Luminex 100系统上使用65路免疫监测试剂盒(ProcartaPlex，™)进行多路复用分析。原始数据根据制造商的协议进行分析。分析细胞因子：G-CSF、GM-CSF、IFN-α、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(CXCL 8)、IL-9、IL-10、IL-12 p70、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17A(CTLA-8)、IL-18、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-31、L、M-、MIF。TNFα，TNFβ，TSLP]；趋化因子[BLC(CXCL 13)、ENA-78(CXCL 5)、Eotaxin-2(CCL 11)、Eotaxin-2(CCL 24)、Eotaxin-3(CCL 26)、Fractalkine(CX3CL1)、Gro-alpha(CXCL 1)、IP-10(CXCL 10)、I-TAC(CXCL 11)、MCP-1(CCL 2)、MCP-2(CCL 8)、MCP-3(CCL 7)、MDC(CCL 22)、MIG(CXCL 9)、MIP-1α(CCL 3)、MIP-β(CCl4)、MIP-α(CCL3)、CCL20(CCL 12)；生长因子/调节因子[FGF-2，HGF，MMP-1，NGFβ，SCF，VEGF-A；可溶性受体：4，BAFF，CD 30，CD40L(CD 154)，IL-2R(CD 25)，TNF-RII，TRAIL(CD 253)，TWIT]。

质量流式细胞术

我们的抗体小组包括36种针对淋巴细胞表面标记物(T细胞、B细胞、NK−细胞)的抗体。质量流式细胞术抗体-金属结合物组合详见补充表。1。样本制备、抗体染色和细胞TOF获取详见补充方法。主要淋巴样细胞表型在补充表中有定义。2.

大量流式细胞术数据分析

流式细胞术标准(FCS)文件的规范化和连接使用Fluidigm采集软件。FCS文件被上传到Astrolabe细胞计量学平台(Astrolabe Diagnotics，Inc.)其中转换、清理(双体、碎片)、标记和无监督的聚类(基于FlowSOM)19)如先前所述20。数据的转换采用了协因子为5的圆弧变换，所给出的标记强度都是在变换后得到的。每个文件至少使用40395个CD 45+事件进行聚类。由于星盘平台的设计是为了对数据进行过度聚类，因此有时会合并星盘识别的细胞簇，从而使最小中聚类大小不小于中位双元率。作为鲁棒聚类识别的另一种方法，我们只考虑在visne可视化后形成离散岛的簇，这种方法对异常值和批处理效应非常敏感。21。然后将确定的集群出口到下游进行统计分析。

RNA分离与测序

从CD 138+浆细胞中提取RNA。用荧光定量法(Invitrogen)和Agilent片段分析仪测定总RNA浓度和质量。使用Illumina TruSeq RNA Exome Library Prep工具包，根据制造商的说明编写库。用Agilent TapeStation D 1000检测cDNA文库的浓度和纯度。利用4个cDNA文库，以200 ng为单位，获得转录组的编码区。用Agilent生物分析仪、DNA 1000芯片和Qubit荧光法(Invitrogen)测定所建文库的浓度和大小分布。根据Illumina的标准协议，使用IlluminaCBOT和HiSeq 3000/4000 PE集群工具包，以每条车道多达8个样本对库进行排序。用HiSeq控制软件HD 3.4.0.38在IlluminaHiSeq 4000上按100×2对末端读取顺序对流动细胞进行测序。基本调用是使用Illumina的RTA版本2.7.7执行的。

统计方法

以CD 45+细胞的丰度(CD 45+细胞)为指标，采用Ward方法对患者进行分级聚类。用Kruskal-Wallis统计检验来描述各组间的差异。采用Kaplan-Meier生存分析方法评估患者的总体生存率(定义为从样本收集到死亡或上次随访之间的时间)和无进展的生存时间(定义为从样本收集到死亡/进展之间的时间或最后的随访时间)。用Pearson相关检验连续变量间的相关性。调整的双边错误发现率(Fdr)p<0.05的值被认为是显著的。统计分析采用JMP Pro统计软件14.1版(SAS研究所，CARY，NC)。使用Edger软件进行不同兴趣组的差异基因表达。基因集富集分析(GSEA)22利用肿瘤标记数据库，确定各组间差异表达(FDR<0.05)基因通路。

病人特征

本研究共包括39例(13例NDMM，11例RMM，15例TRMM)患者。其临床和实验室特征见补充表。3。如预期，三重难治性(TRMM队列)患者的OS(中位数12.4[95%CI 6.1~15.5]个月)和PFS(6.1[95%CI 5.4-19.1]个月)比RMM(中位OS 124.1[95%CI 25.9~131]个月)和NDMM(中位数110.3[95%CI 19.3~132.4]个月)低。然而，本研究中的NDMM队列往往有一个异常侵略性的疾病过程(补充图)。18/13例(64%)患者均接受了新的药物诱导治疗，10/13(77%)采用三联或四联诱导方案。

三重耐药患者有明显的细胞ITME。

考虑到我们队列的小规模和异质性，并且为了减少偏倚(通过对患者复发状况的先验了解)分析方法，我们根据患者的细胞ITME组成对患者进行分组，并将其作为我们的“锚定变量”，原因有几个。首先，新的免疫疗法的效果，主要是针对浆细胞，而不管其克隆生物学，取决于一个功能细胞ITME。其次，随着时间的推移，体液ITME(细胞因子)与单个细胞组成相比不太稳定，因此基于细胞因子表达的分组可能不那么可靠。此外，样本细胞因子谱很可能反映细胞微环境，这是由我们的大量细胞分析和转录数据。最后，我们的队列是小的，异质性的，这一点从NDMM患者异常侵略性的疾病过程中可以看出。因此，我们没有使用基于转录的分组或分组的基础上的先验知识，他们的复发状态(NDMM，RMM，TRMM)。

基于细胞ITME的分级聚类非常准确地再现了基于预先治疗暴露的疾病生物学。1和2第1组主要由NDMM和RMM患者组成，而第2组和第3组主要由TRMM患者组成。表中总结了基于免疫簇的患者的临床特点。1。第2组的患者大多(4/5例)为三重难治性患者，但与第3组(第2组的2条中位治疗线和第3组的8条线)相比，预处理程度较低。p < 0.001). The median overall survival (mOS) from sample collection was significantly better for patients in cluster 1 (Supplementary Fig. 2)。然而，在第2组的5名患者中，有4名患者在接受达瘤抗药物治疗的同时采集了他们的样本。为了确保最近的达拉图玛布暴露不是改变免疫微环境和推动细胞ITME聚集的主要因素，我们在排除了所有7名在进行基于daratumab的治疗过程中收集到的样本后，我们重复了细胞ITME分级聚类。只有2例患者(均有NDMM)聚类不同。总的来说，细胞内ITME簇内患者的组成与包括或不包括在Daratumab上的患者相似(Cohen‘s kappa系数=0.863，与p < 0.001), suggesting that the iTME clustering was not driven primarily by recent daratumumab exposure. These data suggest that triple-refractory patients have a distinct cellular iTME compared to non-triple-refractory patients.

三重难治性复发与CD4 T细胞池缩小和终末分化T细胞增多有关。

然后，我们考虑了三个簇的淋巴样细胞亚群的差异。我们注意到三种免疫簇之间的B细胞亚群频率没有差异。各组间NK细胞的整体浸润无显着性差异(P>0.05)。然而，CD 39+/NKG2D−NK-细胞亚群(NK细胞-5)被认为具有免疫抑制性。23,24无法识别MM细胞25，在第3组中增加。

当考虑T细胞的差异时，第3组患者的T细胞浸润率明显低于第1组和第2组(分别为23%和40%比51%)。p < 0.001). The CD4 to CD8 ratio was significantly higher in cluster 1 compared to clusters 2 and 3 (2.0 vs 0.61 vs 1.15, respectively, p < 0.001). CD4+ T cells were highest in cluster 1 compared to 2 and 3 (median 26.97% of CD45+ cells versus 16.3% and 7.9%, respectively, p < 0.0001). However, CD8+ T cells were highest in cluster 2 (median 18.4%, 36.3%, and 9.5% of CD45+ cells for clusters 1, 2, and 3, respectively, p < 0.0001).

特异性免疫亚群的差异丰度如图所示。3。如图所示，簇1的特征是T1、T2和T12群体的丰度增加，其表型与天真的CD4和CD8 T细胞一致。4。CD8/CD 161+T17亚群在第1组中也最高，其他CD4/CD 161+T细胞群(T6，T7)在第3组中最低，但在第2组中保存。CD 161+T细胞被认为是具有相似转录和表型特征的T细胞亚群，具有较高的增殖能力和分泌高水平IFNγ和TNFα的能力。26,27。第2组具有较高丰度的免疫荧光、终末分化(CD 27/CD 28−、CD 57/KLRG 1+/−)群体(T10、T16、T18、T19、T20、TCRgd-3)以及以组织归巢(CCR 5+)和早期分化标记(CD 27/28+)为特征的T14群体，也有耗竭标记(PD-1，TIGIT)。第3组的特征是减少了以下亚群：T8和T15群体，具有中央记忆(CCR 7/CD 127+)表型；CCR 5+T9效应记忆群，这是T细胞介导的最大抗肿瘤反应所必需的子集。28CD 103+T13细胞群，被认为是由肿瘤反应的、组织内的记忆T细胞组成的。29,30表达早期分化标记(CD 27、CD 28)、组织归巢(CCR 5)和肿瘤细胞毒性(CD 226)的TCRgd-1亚群。31.

这些数据表明，三重耐受性与T细胞池的整体收缩有关，特别是CD4+和天真的亚群。因此，在一些三重难治性患者中，早期记忆T细胞亚群减少，而在其他衰老患者中，终末分化T细胞亚群积累.

三不耐药复发与抑制免疫效应分子信号通路的增殖性浆细胞克隆有关。

由于上述第2组和第3组患者在TRMM病例中富集，与第1组(主要由NDMM和RMM患者组成)相比有明显的ITME，我们对恶性浆细胞进行了GSEA检查，并将第1组与第2组和第3组进行了比较。在簇2/3的患者中，E2F靶点、G2M检查点基因和Myc靶基因增加(图1)。5)，提示2/3簇中的恶性细胞上调了转录网络，与DNA复制、细胞分裂和MYC信号转导有关。这组患者还表现出多种炎症通路的下调，最明显的是肿瘤坏死因子α(TNFa)和干扰素(IFN)信号。值得注意的是，我们没有发现细胞因子在上述三个免疫簇之间或在考虑簇2和簇3时有不同程度的表达。由于这个原因，我们不提供细胞因子数据，可以根据要求提供。这些数据表明，更多的预处理患者有高度增殖的恶性克隆，下调了肿瘤免疫监视所需的途径。

本研究对NDMM、RMM和TRMM患者的体液和细胞ITME及恶性克隆进行了评价。我们发现大多数三重难治性患者有明显的ITME，其特征是CD4 T细胞池减少，幼稚T细胞亚群降低。在大多数三重难治性患者中，中央记忆T细胞与其他几个与抗肿瘤免疫有关的亚群一起减少。我们发现，三重耐药患者的恶性浆细胞是高度增殖的，正如预期的那样，但也显示出与免疫介导的肿瘤排斥反应相关的几条信号通路的下调。

我们队列中大部分淋巴室ITME的差异是由T细胞驱动的。这可能是由于我们的大量细胞分析小组中T细胞标记的选择。它也可能是B细胞免疫导入的结果，无论治疗状况如何，它都存在于诊断或复发。32,33。有趣的是，NK细胞在用daratumab治疗后呈均匀的CD 38+减少。34被保存下来。这与先前的数据一致，即NK细胞池在停止使用daratumab后3-6个月内恢复。34并建议依赖NK细胞介导的细胞毒性的疗法，如elotuzumab。35，可在CD 38抗体复发后早期应用。然而，NK细胞缺乏抗肿瘤反应所需的激活受体，例如NKG2D。36和CD 22637，在大多数三重难治性患者中增加，这可以解释NK细胞导向治疗对这些患者的疗效降低的原因。

大多数非三重难治性患者(第1组)有较高水平的CD4+T细胞和亚群，具有天真的表型。对于簇1中的NDMM来说，这可能反映T细胞室不能对骨髓瘤产生细胞毒性反应，这将需要更多分化的CD8+效应细胞。对于第1组中的RMM来说，这很可能反映了与抗CD 38抗体治疗的患者相比，先前的治疗对ITME的不同影响。例如，利那度胺治疗会增加分化程度较低的T细胞的比例，包括天真的T细胞。38,39。相反，用抗CD 38单克隆抗体治疗使T细胞池向分化程度更高的T细胞表型倾斜。40有更多的效应器功能。这些效应细胞对CD 38抗体的效力起着很大的作用，因为它们是通过克隆扩张来根除恶性细胞的。41。或者，由于T1和T2的朴素亚型都是CD 38+，daratumab可能导致这些亚群的“靶外肿瘤”耗尽。

一旦疾病在抗CD 38抗体治疗后复发，终末分化T细胞亚群的积累以及天真和早期记忆表型的减少，将使三重难治性患者出现功能失调的T细胞室。这种效果在第2组中更为明显，其中包括5例中有4例在达瘤抗复发。许多CAR-T细胞产品目前是从复发时收获的细胞中提炼出来的，因此对于三重难治性患者来说，他们的分离产物将包括较低水平的CD4+和早期记忆T细胞。然而，平衡的CD4：CD8比值和较低分化的T细胞表型都与car-T产品的疗效有关。18,42,43,44。因此，优化T细胞收集的时间，以最大限度地提高幼稚和记忆性T细胞亚群，并尽量减少终末分化、衰老或耗尽的T细胞亚群，可能会提高多发性骨髓瘤的细胞治疗效果。43,44。例如，诱导治疗后收获的T细胞可能具有较高的CD8+记忆表型。18而自体干细胞移植后早期收集的T细胞与分化程度较高的T细胞有关45。用IL-7扩增car-T细胞，可获得较高的car-T细胞增殖和长期抗肿瘤活性，是本研究中考虑到IL7R/CD 127在多个T细胞亚群中表达的优化car-T细胞增殖的另一种策略。46。最后，即使在没有接受CAR-T细胞的复发患者中，现有的T细胞池对其他新的单克隆抗体的分化和扩展的能力也可能受到限制，这可能解释了经过大量预处理的患者对治疗的不良反应。

虽然细胞ITME的现状对新的免疫治疗提出了挑战，但恶性克隆的特点是不容忽视的。在这里，我们发现，经过大量预处理的患者(群集2和3)上调了与增殖相关的基因通路。这并非意料之外，也不应成为新的免疫疗法的有效性的一个特殊障碍，这些免疫疗法针对的是恶性细胞，而不管其增殖能力如何。然而，我们也发现，这些患者的恶性细胞已经适应于下调与免疫介导的肿瘤排斥反应相关的基因通路，例如干扰素。干扰素和肿瘤坏死因子信号的缺失已被证明可以保护肿瘤细胞免受T细胞的杀伤，从而为肿瘤逃避免疫系统提供了一种机制。47。我们还发现，MM细胞在这个阶段可能不那么依赖炎症介导的生长途径，如IL-6和TGF-β。虽然这些观察背后的机制尚不清楚，但抗CD 38抗体介导的恶性细胞克隆选择能够避开免疫效应细胞，并具有更多的增殖特性。这一发现与包括car-T细胞在内的新型免疫疗法的使用有关，这些免疫疗法能在刺激后诱导细胞因子信号。48，以及治疗性抗体35部分依赖于完整的肿瘤干扰素和肿瘤坏死因子介导的T细胞介导的肿瘤根除信号。47,49.

有趣的是，我们没有发现在体液ITME(细胞因子)的复发状态(NDMM//RMM/TRMM)或免疫聚类方面有显著差异。这可能是由于我们的群体规模小和异质性所致。此外，由于我们所有的样本都是在疾病活跃时(在诊断/复发时)获得的，所以所有已知的与MM生长相关的炎性细胞因子都有可能是一致升高的。

我们的研究有一些重要的局限性。我们的NDMM从一线治疗进展的中位时间小于20个月，很可能反映了那些在诊断时被转介到我们的机构并且在开始诱导治疗之前有了所有必要的生物样本的患者的选择偏见。由于样本可用性的限制，我们无法研究在疾病过程中从统一治疗的患者中收集的配对样本，或者根据先前治疗暴露而匹配的样本。在我们的机构，我们不定期获得每一次复发的骨髓样本。因此，治疗的异质性是本研究的一个主要限制，我们无法确定ITME中观察到的异常是由于特定治疗(例如抗CD 38抗体耐受性)还是更有可能是继发于所有先前治疗的累积效应和侵袭性恶性克隆的增殖。今后的工作应集中于在抗CD 38抗体耐受性发展前后对成对样本的患者队列中验证这些结果。此外，我们的研究没有报告髓系细胞室的改变。我们的流式细胞术小组没有描述髓系细胞，而且样本材料的有限限制了我们可以分析的CD 45+细胞的最大数量，从而限制了分析深度(最小的可检测免疫子集)。此外，虽然淋巴样细胞在冻存样本中以随机的方式发生，但对于一些重要的髓样细胞亚群，如髓细胞衍生抑制细胞，这些细胞在冷冻保存中优先丢失，情况并非如此。50.