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线粒体精氨酸酶-2在炎症巨噬细胞IL-10代谢重组中起重要作用

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发表时间:2021-03-09 10:14作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

线粒体是巨噬细胞极化的重要调节因子。提示精氨酸酶-2(Arg2)是一种微RNA-155(miR-155)和白细胞介素-10(IL-10)调节蛋白,定位于炎性巨噬细胞线粒体,是IL-10诱导的线粒体动力学调节和氧化呼吸的关键。机械地说,Arg 2在线粒体上的催化活性和存在是氧化磷酸化的关键。我们进一步证明Arg 2通过增加配合物Ⅱ(琥珀酸脱氢酶)的活性来介导这一过程。此外,Arg 2对IL-10介导的炎症介质琥珀酸、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和IL-1β的下调具有重要作用。因此,hf-1α和IL-1β在lps诱导的急性炎症模型中高表达。Arg 2−/−老鼠。这些发现揭示了IL-10介导的代谢调节的一个新的手臂,致力于解决细胞的炎症状态。

导言

巨噬细胞是一种重要的免疫细胞,可发挥促进炎症或抗炎的作用,既可用于先天免疫反应,也可用于适应性免疫反应。1。代谢方面,已经证明在体外‘M1样’炎性巨噬细胞利用有氧糖酵解产生ATP。这同时伴随着线粒体氧化磷酸化(OxPhos)的下调,以及某些代谢产物在三羧酸(TCA)循环中的积累,如柠檬酸和琥珀酸盐。2,3。相反,包括IL-10、IL-4和IL-13在内的多种抗炎刺激是M2类抗炎表型诱导剂.M2样细胞被证明有利于OxPhos的使用。4,5,这与巨噬细胞线粒体动力学的特定改变有关。6,7,8.

IL-10是一种抗炎细胞因子,在巨噬细胞中以自分泌的方式发挥作用,通过减少促炎细胞因子的产生来限制炎症反应。9,10。同时,IL-10增加抗炎基因,典型的依赖于STAT 3。10,11,12,13。此外,炎性巨噬细胞利用精氨酸产生一氧化氮(NO),IL-10可通过抑制诱导型一氧化氮合酶mRNA(NOS 2)14,15或者通过促进iNOS蛋白的降解10,16。同时,IL-10增加了精氨酸酶的表达,限制了精氨酸对NO的利用。13,17。事实上,IL-10通过抑制NO来保护OxPhos,从而调节巨噬细胞的糖耐量。18或通过抑制哺乳动物的雷帕霉素靶点(MTOR)19。研究还表明,IL-10通过STAT 3抑制促炎微RNA miR-155。20。IL-10可调节miR-155的靶基因,提示IL-10在巨噬细胞中维持抗炎状态有一个独特的机制。20.

在这里,我们确定Arg 2它是由IL-10/miR-155轴调控的最显着的代谢基因之一。我们还发现,IL-10介导的Arg 2蛋白的诱导是导致炎症巨噬细胞线粒体动力学和生物能学向氧化表型转变的关键,特别是通过增强电子传递链上复合物II(CII)的活性。这项工作突出了Arg 2作为IL-10的下游介质,并为其作为炎症解决器的功能提供了一种机制。

结果

炎症巨噬细胞中白细胞介素-10对Arg 2有正调节作用。

我们首先鉴定了这个基因Arg 2当研究炎症巨噬细胞在IL-10/miR-155轴交界处的调节时。采用基因芯片技术检测了野生型小鼠骨髓源性巨噬细胞(Bmdm)与LPS+IL-10(抗炎)刺激后的基因表达变化。MiR 155−/−BMDM受LPS刺激,米尔-155−/−(预测抗炎)(如图所示)。1A和补充图。1A)。旋转基因集富集分析(Romer)表明,这个轴上的基因比例最高的是代谢途径(补充图)。1B)。特别是,Arg 2在WT(LPS+IL-10)和米尔-155−/−(LP)群(图1)。1B),是唯一在其3‘UTR中与miR-155结合位点的基因(如图所示)。1B和补充图。1C)21。我们确认Arg 2用荧光素酶法检测巨噬细胞中miR-155的靶点,Arg 23‘UTR活性在miR-155模拟物存在时被显著抑制,而在抗肿瘤药物存在时则呈反作用增强(图1)。1C)。重要的是,Arg 2蛋白水平在米尔-155−/−(LPS+IL-10)与米尔-155+/+(LPS+IL-10),而Arg 1在基因型间的表达是一致的(图)。1D).

图1:在炎症巨噬细胞中,精氨酸酶-2受IL-10/miR-155轴的调节.

巨噬细胞(bmdm、来源264.7或thp-1)未经LPS、LPS+IL-10或IL-10单独刺激24 h。a微阵列设计原理图。Wt(LPS)、BMDM(炎症)、WT(LPS+IL-10)、BMDM(抗炎)或米尔-155−/−(LPS)BMDM,(预测抗炎)。b说明测井褶皱变化的Ma图米尔-155−/−LPS和WT(LPS+IL-10)激活的巨噬细胞具有共同的上调(红色)和下调(蓝色)基因。还显示了巨噬细胞中常见的炎症和抗炎基因。c荧光素酶活性测定Arg 23‘UTR报告为相对光单位(Rlu)在存在或不存在miR-155模拟或抑制剂在原始264.7细胞(n=3项独立实验)。非靶向控制(NC)模拟或抑制剂被报道为参考,并设定为100%.dArg 2和Arg 1蛋白水平米尔-155+/+米尔-155−/−BMDM代表.n=3个生物复制体。eRT-PCR分析Arg 2Arg 1BMDM中mRNA的表达n=3个生物复制体)。通过将数据规范化为M18s并分析相对褶皱变化对非受刺激对照的影响。fBMDM中Arg 2和Arg 1蛋白的表达水平。代表(至少)n=5项生物独立实验。gRT-PCR分析Arg 2THP-1细胞的mRNA水平n=3项独立实验。数据点表示每个独立实验的技术三倍的平均值)。数据通过标准化来进行比较M18s,并与未受刺激的对照组比较,分析其相对皱褶变化。hjArg 2和Arg 1蛋白水平(代表n=3项独立生物实验)hTHP-1细胞iBMDM在有或没有抗IL-10Ra(抗IL-10R)抗体的情况下,j IL 10+/+IL 10−/−BMDMk, l尿素对精氨酸酶活性的影响:k野生型BMDM(n=6个生物复制),以及l Arg 2+/+VSArg 2−/−BMDM(n=3个生物复制体)。c, e, g, k, l所显示的数据是平均的,误差条代表±SEM。数据分析c普通的单向方差,以及e, l双向方差,其次是c, e图基和l西达克的多重比较后特别测试。g, k双尾双尾法比较LPS与LPS+IL-10的数据t-测试。P-数值显示在图表上,以便进行统计上的显着比较。

虽然大家都知道IL-10能诱导arg 1。10,13,22,只有一种推测表明,IL-10介导了炎症巨噬细胞中Arg 2的增加。10。在此,我们通过验证外源性IL-10在LPS处理的小鼠和人巨噬细胞中对Arg 2的上调,在mRNA和蛋白水平上与LPS或IL-10单独处理的细胞相比,显著扩展了这些研究。1E-H和补充图。1D)。相反,Arg 1只在小鼠巨噬细胞中被LPS+IL-10协同上调。和补充图。1D)。IL-10Rα阻断抗体可降低脂多糖介导的Arg 2的诱导作用,证实了IL-10对Arg 2表达的依赖性(如图1所示)。1I)和IL 10−/−BMDM受LPS刺激。1J)。此外,外源性IL-10在LPS中的加入也刺激了LPS的产生。IL 10−/−BMDM恢复了Arg 2的表达。1J)。另外,在STAT 3抑制剂STATTIC处理的BMDM中,Arg2mRNA和蛋白水平明显降低(补充图)。1E-g).

我们接下来通过测定LPS、LPS+IL-10和IL-10刺激的BMDM中的副产物尿素来研究精氨酸酶的催化活性(L-精氨酸转化为L-鸟氨酸)。第一,在WT,BMDM,LPS处理增加尿素的产生,但在LPS+IL-10处理的细胞中加入IL-10,这一作用显著增强。1K),一种失去的效果IL 10−/−补充图)。PAN精氨酸酶抑制剂NOR-NOHA对精氨酸酶催化活性的药理抑制作用证实了这两种异构体对LPS+IL-10刺激细胞中精氨酸酶活性的依赖性(补充图1)。1I,j)。此外,为了确定Arg 1和Arg 2的相对贡献,我们使用了针对每个异构体的siRNAs(补充图)。1K,l),并说明LPS+IL-10处理的巨噬细胞在产生尿素时对这两种亚型的依赖(补充图)。1M). Arg 1−/−小鼠在出生后约2周死亡,阻碍了BMDM的收获能力。23。然而,我们证实了Arg 2对精氨酸代谢的贡献。Arg 2−/−BMDM的尿素产量大幅度下降Arg 2−/−(LPS+IL-10)细胞。1L)。同时也检测到NO水平的增加(补充图)。1N),提示Arg 2的缺乏可能提高L-精氨酸对iNOS的有效性。

Arg 2定位于线粒体。

为了进一步确定精氨酸酶异构体的独立作用,我们着重于以下事实:Arg 2包含线粒体靶向序列(Mts)。24。虽然这推断了线粒体的本构定位,但这还没有在巨噬细胞中得到彻底的验证。25并在内皮细胞中观察到细胞液的易位。26表明Arg2定位是一个受不同条件影响的动态过程。在这里,我们明确说明线粒体Arg 2在巨噬细胞中的定位,并更具体地评估IL-10对此过程的影响。与Arg 1相比,我们首次发现Arg 2定位于线粒体,利用体外转录/翻译(IVTT)系统(图1)。2A)。Arg1(pCMV-Arg1)和Arg2(pCMV-Arg2)在60 min的高表达质粒显示Arg2被大量导入线粒体。然而,Arg 1的情况并非如此(图1)。2A比较2-4号和7-9号车道)。此外,在线粒体膜去极化后,Arg 2通过加入fcp(通道10)而保持进口,这可能表明arg 2定位于线粒体内膜(Imm),因为针对线粒体基质的蛋白质需要膜电位才能穿过imm。27,28。然而,今后的研究需要确认这一本土化的真正性质。

图2:精氨酸酶-2调节炎症巨噬细胞对IL-10反应的线粒体动力学.

aIVTT法测定pCMV-Arg1和pCMV-Arg2的线粒体导入量。凝胶暴露在荧光粉现场检测进口蛋白。将完整IVTT蛋白的1μ1作为输入对照(通道1和6)。时间历程超过60分钟,显示代表与线粒体膜结合和发现的蛋白质的条带。FCCP被用作去极化控制。以三个实验为代表的X线片并行运行和处理。图通过测量相对表达式对集合实验的密度进行了分析。bArg 1和Arg 2在分馏中的免疫印迹IL 10–/未受刺激的BMDM(CTL),或仅用LPS、LPS+IL-10或IL-10单独刺激的BMDM。VdA和β-微管蛋白分别作为线粒体和细胞质的对照.三个独立实验的代表。cImageStream显示未受刺激(CTL)或LPS或LPS+IL-10刺激的BMDM中Tom20和Arg2的共定位水平。(左)代表图片显示的~1000个事件。显示的通道是亮场(Ch01)、Tom20(绿色/Ch02)、Arg 2(红色/Ch11)和一个合并。原始放大倍数,×60。(右)在两个独立的生物学实验中,显示了Tom20和Arg2在不同处理中的共定位指数。每个数据点表示大约1000幅处理图像的中值索引。dfBMDM要么不受刺激(CTL),要么单独用LPS、LPS+IL-10或IL-10刺激,然后用MitoTracker Red-CMXRos染色。共聚焦显微镜观察线粒体形态。较低的面板显示了图像在白色方格内的更高放大率。箭头显示线粒体融合和分裂。图表显示线粒体形态学分析的结果n=3项独立生物学实验。标尺代表5m。d野生型BMDM,e用DMSO或NOR-NOHA和f Arg 2+/+Arg 2–/–BMDMa, df用误差条显示的数据表示±SEM。df采用双向方差分析和Tukey后特设检验进行多重比较,确定统计学意义。P-在延长的线粒体组分之间有显着意义的图表上表示值。

接下来,我们想确定我们的刺激是否导致arg 2在线粒体上或从线粒体中易位(如先前报道的内皮细胞对oxldl的反应)。26)。经bmdm细胞分馏证实,arg 2在bmdm中对lps+IL-10的反应是在线粒体内被定位和上调的。IL 10–/–BMDM(图1.2B)。Arg 1的情况并非如此,它只在不同处理的胞质组分中检测到(如图所示)。2B)。此外,使用ImageStreamTM流式细胞术显示Arg 2主要以线粒体蛋白Tom20表达和定位,尤其是在LPS+IL-10刺激细胞中。2C)。定量分析显示,静止细胞中Tom20/Arg 2的共定位率为44.6%(附图)。2A),LPS+IL-10处理BMDM后,这一比例提高到60%(补充图)。2A)。此外,在LPS+IL-10处理的264.7巨噬细胞中,还可检测到Arg 2在线粒体上的表达和定位。2B).

Arg 2调节线粒体动力学

鉴于Arg 2在LPS+IL-10细胞线粒体中的大量表达,我们决定在实验条件下观察线粒体的形态学和动力学。线粒体功能与它们的塑性结构密切相关,而塑性结构会根据细胞的需要不断变化。2929,30,31,以线粒体(≤1μm)为代表。相反,线粒体拉长的“融合”状态(≥3μm)有利于线粒体呼吸和存活。32。线粒体动力学分析显示,仅LPS刺激的细胞与对照组相比,线粒体分裂明显增加(≤1μm~(-1))。CTL:16%;LPS:85%)。二维空间)。但值得注意的是,这种裂变状态不仅在LPS+IL-10(≤1μm.线粒体以融合状态为主(≥3μm~(-1))。LPS:10%;LPS+IL-10:64%)。二维空间)。接下来,我们研究了精氨酸酶的活性是否是这种形态效应的必要条件。线粒体融合明显减少(≥3μm~(-1))。(22%)LPS+IL-10处理BMDM,NOR-NOHA预处理后BMDM的表达率为22%.(无花果)2E和补充图。2C)。更重要的是,我们展示了Arg 2–/–(LPS+IL-10)细胞(≥3μm.)(18%)线粒体融合水平明显低于Arg 2+/+(LPS+IL-10)细胞(≥3μm.)64%)2F和补充图。二维空间).

Arg 2增强巨噬细胞线粒体呼吸

IL-10已被证明影响线粒体的特征和相关的功能,如质量,膜电位(ΔΨ)。m)和氧化磷酸化(OxPhos)19。鉴于Arg 2对线粒体动力学的影响,我们研究了Arg 2在IL-10驱动的线粒体功能中可能发挥的作用。我们首先用流式细胞仪证明Arg 2–/–BMDM的整体细胞大小和细胞内复杂性与Arg 2+/+(补充图。2E,f)。此外,我们发现在所有实验条件下,各基因型之间的线粒体质量没有变化(补充图)。2G)。然而,我们观察到膜电位,ΔΨm,在.Arg 2–/–(LPS+IL-10)细胞与Arg 2+/+(LPS+IL-10)(附图)2H)。由于膜电位是线粒体ATP合成的驱动力,这一发现导致我们研究了Arg 2对OxPhos的影响。LPS刺激的巨噬细胞减少了他们对OxPhos作为一种能量生产手段的承诺。33而外源性IL-10则能促进LPS刺激的OxPhos。IL 10–/–巨噬细胞19。当然,我们验证了外源IL-10显着恢复OxPhos的能力。IL 10–/–BMDM经LPS处理,表现为基础氧消耗率(OCR)、最大呼吸能力(MRC)和氧诱导ATP生成(补充图)。3A,b)。然而,用sirna处理的264.7巨噬细胞中,IL-10对这些参数的恢复作用明显减弱。Arg 2(SiArg 2)与非目标对照(SINT)比较(补充图2)。3C)。这一发现在siRNA处理的iBMDM中被重新描述(见图)。3A,b和补充图。三维空间),并在Arg 2–/–(LPS+IL-10)BMDM(图1)3C,d).

图3:精氨酸酶-2增强炎症巨噬细胞氧化磷酸化。

ah, j, k分别加入寡霉素(1M)、FCCP(0.9M)和鱼藤酮+抗霉素A(ROT/Ant A)(0.5mol),实时测定氧耗率(OCR)。a(左)未受刺激的Sint和siArg 2永生化BMDM(IBMDM)细胞和(右)LPS和/或LPS+IL-10对Sint和si的作用Arg 2IBMDM(代表n=2个生物实验)。b, d, f, h, k定量变化的基础氧消耗率(基础OCR),最大呼吸能力(MRC),和OXPHOS诱导的ATP水平。bLPS和LPS+IL-10处理转染Sint或si的iBMDM细胞Arg 2。所显示的数据点是两个独立实验的15-20个技术复制。c Arg 2–/–BMDM(跟踪代表n=3个生物重复序列)。dLPS/LPS+IL-10刺激后氧化参数的定量变化Arg 2–/–BMDM(n=3项生物学实验)。e IL 10–/–BMDM(左)未受刺激,或(右)LPS/LPS+IL-10受刺激(n=3项生物学实验)。细胞经DMSO或150μM NOR-NOHA预处理后1h,再加入IL-10和/或LPS刺激。f数量变化IL 10–/–DMSO或NOR-NOHA预处理BMDMS对LPS+IL-10细胞的氧化参数影响.数据点是生物复制(n=3)。gRaw264.7巨噬细胞表达pCMV-EV、pCMV-Arg1或pCMV-Arg2。三个独立实验的痕迹代表。h转染过表达质粒的Raw264.7细胞氧化定量参数的变化g)。数据点是三个独立的实验(n=3)。ik原264.7巨噬细胞表达pCMV-EV、pCMV-Arg2或催化死亡突变体pCMV-H145F。i精氨酸酶活性测定。数据点显示了三个独立的实验。j线粒体OCR示踪是两个独立实验的代表。kArg2vsH145F OCR参数。数据点显示,从两个独立的实验中收集了15-20个技术复制。ak所有痕迹和散点图的数据均为平均值±扫描电镜。d, f, h每个生物或独立数据点都有10-20个技术复制。用双尾学生的数据分析了数据的统计意义。t-测试,以及b, I, k使用普通的单因素方差分析与图基的后特别检验进行多重比较。各别p-数值显示在图表上,其结果具有统计学意义。

其次,我们研究了该工艺对精氨酸酶催化活性的要求,发现在此过程中,基本的ocr和mrc明显减弱。IL 10–/–(LPS+IL-10)细胞经NOR-NOHA预处理后,氧磷诱导的ATP降低(图1)。3E,f)。与bmdm相似,NO-NOHA(补充图)预处理后的264.7巨噬细胞中的OxPhos明显下调.3E)。为了了解Arg 1与Arg 2在OxPhos上的相对贡献,我们通过免疫印迹分析证实了Arg 1与Arg 2在原264.7中的原位氧化呼吸参数。3F)。线粒体呼吸实验结果表明,pCMV-Arg2对OxPhos有明显的促进作用。第三代),如增加的OCR参数所示。3H)。而pCMV-Arg1与空载体pCMV-EV无明显差异。3g和h34至苯丙氨酸(H145F)。精氨酸酶分析证实了H145F突变体的催化失活。3I),免疫印迹显示pCMV-Arg2与野生型pCMV-Arg2具有相似的表达。(补充图。第三代)。随后,我们证明Arg 2的催化位点在其对OxPhos的调控中起着重要的作用。3J由于与pCMV-Arg2相比,H145F突变体中OXPHOS的所有参数均被下调。3K)。总的来说,这是Arg 2亚型影响免疫细胞型氧化机制的第一次报告。

Arg 2提高琥珀酸脱氢酶/复合物II活性

在确定Arg 2促进线粒体氧化代谢后,我们想要解开这个过程的细节,因此,我们展望了TCA循环等等。首先,利用气相色谱-串联质谱(GC-MS)研究了IL-10对TCA循环代谢产物的影响。我们观察到,与对照组相比,LPS+IL-10线粒体野生型bmdm微丸的富马酸和苹果酸水平显著升高(补充图)。4A)酶琥珀酸脱氢酶(SDH)下游的两个代谢产物。另一项研究证实了这一点,研究表明富马酸和苹果酸含量显著下降。IL 10–/–Bmdm对lps的响应,与野生类型的bmdm相比较。18.

SDH是一种双功能酶,在TCA循环中起着核心作用,在ETC中也起着复合物II(CII)的作用。为了研究内皮细胞在正常结构环境下的功能,我们通过测定谷氨酸和苹果酸盐(CI)和琥珀酸盐(CII)处理后渗透细胞的耗氧率(OCR)来检测单个复合物的活性。35。CI和CII在LPS+IL-10BMDM中的OCR较未受刺激或LPS刺激的细胞显著升高(图一)。4A)。IL-10可能在复杂的活动中起作用。IL 10–/–在静息过程中检测到明显降低CI和CII活性的BMDM。IL 10–/–细胞与野生型对照(补充图)。4B)。接下来,在这种情况下检查Arg 2的任何影响是很重要的。有趣的是,在静止状态下,只检测到特定于ci的ocr显著下降。Arg 2–/–相比较Arg 2+/+BMDM,而CI特异性OCR在基因型间具有可比性。4B)。此外,外源性IL-10的加入也不能促进CII特异性OCR的产生。Arg 2–/–(LPS+IL-10)细胞比较(见图)。4C)。我们还观察到,当比较LPS+IL-10处理Arg 2纯合子时,有显著的基因剂量效应。Arg 2+/+)、杂合子(Arg 2+/–)和缺陷(Arg 2–/–)BMDM(图1.4D)。相反,Arg 2在264.7巨噬细胞中的过表达促进了CII依赖的OCR(如图所示).4E)。这在表达H145F催化突变体的细胞中明显减弱,表明Arg 2的催化活性在这一过程中的重要性。重要的是,我们证实Arg 1的过表达对空载体(pCMV-EV)控制的CII活性没有显著影响。4E).

图4:精氨酸酶-2影响复合物Ⅱ的活性,调节IL-1β的分泌.

aeXFe96例未处理(CTL)BMDM或刺激细胞(LPS或LPS+IL-10作用24h)复合物I和(或)复合物Ⅱ特异性OCR的比较。加入衬底后,氧耗率百分比(OCR%)增加的数据:a野生型细胞。n=3(复数I)和n=7(复合体II)生物复制。b静止野生型(Arg 2+/+)与Arg 2–/–, cCTL vs刺激Arg 2–/–, dLPS+IL-10刺激Arg 2+/+, Arg 2+/–,和Arg 2–/–; bd显示的数据是生物的n=3。e复合物II特异性OCR在原264.7过表达pCMV-Sport6质粒的EV(空载体),Arg 2,H145F和Arg 1。数据显示,在两个独立的实验中,20个技术复制(H145F和Arg1)和40个技术复制(EV和Arg2)。f四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞SDH活性Arg 2+/+Arg 2–/–BMDMSDH抑制剂二甲基丙二酸(DMM)作为对照(n=3个生物复制体)。g用紫外-可见分光光度法测定阿格2+/+Arg 2–/–BMDM以柠檬酸合成酶(CS)为对照。n=3项生物三重),hl野生型比较(Arg 2+/+)和Arg 2–/–级别的BMDMh琥珀酸盐i富马酸盐j线粒体活性氧(MtROS),kHif-1α、Arg 2、Arg 1和β-tubulin的蛋白表达(作为负载对照);lIL-1β酶联免疫吸附试验(ELISA)比较上清液分泌水平。hj, l n=3个生物复制,和k代表.n=3项独立实验;m, n Arg 2+/+Arg 2–/–C57BL/6J小鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg,持续8h:m(左)脾Hif-1α,Arg 2,β-tubulin。6只野生型小鼠和6只野生型小鼠的杂交代表Arg 2–/–。(右)密度分析显示Hif-1α的相对表达水平(n=6);n腹腔灌洗液中IL-1β、IL-10和IL-6分泌水平n=6个生物复制体)。aj, ln散点图的数据为均值±扫描电镜。数据分析ag, l普通的单向方差与图基的多重比较,h, j, n双尾t-用韦尔奇的修正进行测试,以及I, m双尾配对t-测试。无论是什么重要的,准确的p-数值按数字计算。

为了充分验证我们关于arg 2和cii活性的发现,我们还测量了mtd对formazan的还原作用,这是SDH活性的一种常见测定方法。36,这表明Arg 2–/–BMDMs在静息状态和LPS+IL-10治疗条件下SDH活性均明显降低(图二)。4F)。无差异Arg 2+/+Arg 2–/–4F)。类似于我们的通量分析器实验,在264.7巨噬细胞中Arg 2的过表达促进了CII的活性,在H145F的表达细胞中,这一作用明显减弱(补充图)。4C)。最后,我们使用单波长分光光度计技术询问cii的特异性活性,并将其表达为柠檬酸合酶(Cs)的比活性,以使线粒体质量的活动正常化,如前所述。37。结果表明,静息时CII活性明显降低。阿格2–/–BMDM与Arg 2+/+控件(图1.4G)。此外,外源性IL-10能显著恢复cii的特异性活性。Arg 2+/+(LPS+IL-10)细胞Arg 2+/+(有限责任公司)。然而,IL-10恢复ci特定活动的能力在Arg 2–/–(LPS+IL-10)BMDM(图1)4G)。在LPS+IL-10中检测细胞琥珀酸和富马酸时,证实了arg 2在cii特异性活性中的作用。Arg 2–/–BMDM与野生型控件相比。在这里,我们证明了IL-10减少了整体琥珀酸盐(图1)。4H与单纯LPS相比,LPS+IL-10刺激BMDM的富马酸水平升高(图二)。4I)。这种效果又一次消失了。Arg 2–/–(LPS+IL-10)BMDM(图1)4H-I).

急性炎症过程中Arg 2对HIF-1α和IL-1β的调节作用

在tca循环中,LPS刺激的断裂和异常等活动的机制被广泛认为是炎症性的。38。在这种情况下,研究报告说,由于直接产生线粒体活性氧(MtROS),炎症表型增加。这与hif-1α的稳定、细胞因子IL-1β的增加以及抗氧化反应的降低密切相关。2,39。我们发现mtros在Arg 2–/–(LP+IL-10)BMDM与Arg 2+/+(LPS+IL-10)(图1)。4J)伴随着HIF-1α蛋白水平的升高。Arg 2–/–(无花果)4K)。重要的是,在我们的条件下检测IL-1β水平,显示IL-10对IL-1β的抑制作用。Arg 2+/+(lps+IL-10)细胞在Arg 2–/–(LPS+IL-10)(图1)。4L)。值得注意的是,肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-6(IL-6)水平在两组间Arg 2+/+(LP+IL-10)及Arg 2–/–(LPS+IL-10)(附图)4D)。此外,还检测到nrf 2水平下降,这是一种已知的诱导抗氧化基因表达的转录因子。Arg 2–/–细胞跨处理(补充图。4E).

提示IL-10通过线粒体的Arg 2介导其抗炎作用对IL-1β的产生起调节作用。接下来,我们研究了arg 2在IL-10受到体内LPS攻击时是否受到限制。IL 10+/+IL 10–/–老鼠。腹腔灌洗液中肿瘤坏死因子、白细胞介素-6和白细胞介素-1β蛋白水平明显升高。IL 10–/–(补充图。4F)。有趣的是,Arg 2MRNA水平显著降低IL 10–/–补充图4G)从脾脏取出来的组织中缺少Arg 2蛋白。IL 10–/–无蛋白表达变化,可见于Arg 1(补充图1)。4H)。最后,我们检测了在体内的LPS攻击后的反应。Arg 2+/+Arg 2–/–老鼠。我们观察到,与我们在原代bmdm中的体外实验结果相比较,hdf-1α在小鼠脾脏中的表达明显增强。Arg 2–/–老鼠(图1.4m)。此外,即使白细胞介素-10分泌显著增加Arg 2–/–小鼠腹腔灌洗后,IL-1β分泌水平在这些小鼠中仍显着高于野生型小鼠(图一)。4N)。有趣的是,这一结果在siRNA基因敲除后在体外得到了反映。Arg 2在LPS+IL-10处理的iBMDM(补充图)。4I)。这些结果共同表明,在缺乏Arg 2的情况下,IL-10对IL-1β的抑制作用消失。


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