Sars-cov-2 nsp 12抑制Ⅰ型干扰素的活化
为了研究sars-CoV-2 nsp 12是否能调节天然免疫反应，我们首先评估了nsp 12对干扰素-β启动子激活的影响。将pIFN-β启动子驱动的荧光素酶报告质粒(pIFN-β-Luc)和对照PRL-TK质粒瞬时转染293 T细胞。24h后，用SeV或高分子量的聚(I：C)(HMW-poly[I：C])刺激细胞，激活RAP-I和MDA 5信号通路。18,24刺激12h后测定荧光素酶活性。我们发现，nsp 12以剂量依赖性的方式抑制SeV-或HMW-聚(I：C)诱导的干扰素-β启动子的激活。1A，b)。RT-PCR法检测IFN-β内源性表达，证实nsp12抑制了RAP-I和MDA 5信号通路(图1)。1C)。Nsp 12的过表达也抑制了SeV刺激的STAT 1磷酸化，这是IFN-β产生后的一个事件(如图所示)。1D)。我们进一步研究了nsp 12是否影响干扰素-β产生下游的信号通路。瞬时转染293 T细胞，转染载体质粒或表达nsp 12的质粒，同时转染干扰素刺激应答元件(ISRE)报告质粒和对照PRL-TK质粒。24h后，用干扰素-β刺激细胞12h，测定荧光素酶活性。我们发现nsp 12不能抑制干扰素β诱导的启动子激活。1E)，提示nsp 12干扰IFN-β的活化而不是下游信号。
图1SARS-CoV-2nsp 12可减弱病毒RNA相关的I型干扰素应答.aNsp 12对SeV诱导的IFN-β启动子激活的影响。将IFN-β报告质粒与对照质粒一起转染HEK293T细胞，或加入大量表达nsp 12的质粒转染HEK293T细胞。细胞感染SeV 12h，检测荧光素酶活性。Westernblotting分析所指示的蛋白表达水平。采用P-IRF 3评价SeV感染后的刺激情况。bNsp 12对高分子量聚(I：C)诱导的IFN-β启动子激活的影响。将IFN-β报告质粒与对照质粒一起转染HEK293T细胞，或加入大量表达nsp 12的质粒转染HEK293T细胞。用高分子量聚(I：C)转染细胞12h，检测荧光素酶活性。Westernblotting分析所指示的蛋白表达水平。采用P-IRF 3评价对聚I：C治疗的刺激作用。cNsp 12对内源的影响干扰素-βSeV(左)和高分子量聚(I：C)诱导的mRNA表达(右)。用表达nsp 12的质粒转染HEK293T细胞。24 h后，用Sev感染细胞8h，或转染高分子量的Polyi：C，转染6h，提取总RNA，并将其表达。干扰素-β用实时RT-PCR法检测.dNsp 12对SeV诱导内源P-STAT 1的影响。用表达nsp 12的质粒转染HEK293T细胞。24 h后，用SeV感染细胞8h，用Westernblotting法检测SeV的P-STAT 1、nsp 12和P蛋白。eNsp 12对IFN诱导ISRE启动子激活的影响。将ISRE-Luc报告质粒与对照质粒一起转染HEK293T细胞，或加入大量表达nsp 12的质粒转染HEK293T细胞。24h后，用干扰素(1000 U/ml)作用12h，检测荧光素酶活性。Westernblotting分析所指示的蛋白表达水平。所有的实验至少进行了两次，并显示了一个代表性。误差栏表示技术三项的SDS。单因素方差分析(或非参数等值)用于柱分析(a, b)。双尾未配对T-试验采用两组比较(c). **P < 0.01, ***P < 0.001
Sars-cov-2 nsp12抑制IRF 3诱导的干扰素-β活化
为了鉴定SARS-CoV-2nsp 12对宿主产生抑制作用的靶点，我们将增加nsp 12的数量与Rig-IN(一种活性形式的Rip-I)、MDA 5、MAVS和IRF 3-5D(一个构成活性的IRF 3突变体)共转染，并确定了IFN-β启动子的激活。荧光素酶报告试验结果表明，nsp 12的过表达抑制了RIP-IN-、MDA 5-、Mavs-和IRF 3-5D-启动子的激活，且呈剂量依赖性。2A-d)。这些结果表明，nsp 12在IRF 3激活水平或下游抑制IFN-β的产生。
图2SARS-CoV-2nsp12可抑制IRF 3的活化。Nsp 12对启动子激活的影响。将IFN-β报告质粒与对照质粒一起转染HEK293T细胞，同时转染表达nsp 12的质粒和表达rig-in的质粒(a)，MDA 5(b)、小牛(c)，或IRF3-5D(d)。转染24h后测定荧光素酶活性。用Westernblotting分析所指示蛋白的表达水平。所有的实验至少进行了两次，并显示了一个代表性。误差栏表示技术三项的SDS。单因素方差分析(及非参数等效)用于列分析，*P < 0.001
Sars-cov-2 nsp 12不抑制irf 3的磷酸化。
IRF 3被激酶Ikki和TBK 1磷酸化后激活。23为确定SARS-CoV-2nsp 12是否拮抗IRF 3磷酸化，将293 T细胞瞬时转染载体质粒或表达nsp 12的质粒。24小时后，用SeV刺激细胞，持续不同时间(见图)。3A)。另一种方法是用表达nsp 12的质粒转染细胞24h，然后用SeV感染细胞8h(见图)。3B)。在nsp 12存在或不存在时，SEV诱导IRF 3磷酸化水平相当(图12)。3A，b)在不同的环境下，提示SARS-CoV-2nsp 12不影响病毒触发的IRF 3磷酸化。
图3SARS-CoV-2nsp 12不抑制IRF 3的磷酸化。用对照质粒或nsp 12表达质粒转染HEK293T细胞。24小时后，细胞感染SeV，并在指定的时间收集。采用Westernblotting方法对猪传染性病毒性肝炎病毒(Sev)的P-IRF 3、IRF 3、TBK 1、nsp 12和P蛋白进行了分析。b转染HEK293T细胞后，转染正常质粒或增加表达nsp 12的质粒数量。24 h后，用Sev感染细胞8h，用westernblotting方法检测pIrf 3、irf 3、nsp 12和p蛋白的表达。
Sars-cov-2 nsp 12抑制IRF 3的核易位
磷酸化的IRF 3在IFN-β转录中起着关键的作用.由于nsp 12不影响IRF 3磷酸化，我们随后研究了nsp 12是否影响293 T细胞的IRF 3核易位。免疫荧光分析显示，在未感染的细胞中，IRF 3分布于胞浆内，nsp 12表达过表达或不表达(如图12所示)。4A，第1及2行)。在转染对照载体的细胞中，在SeV感染后，IRF 3能有效地转移到细胞核(如图1所示)。4A，第3行)。然而，在表达nsp 12的细胞中，SeV诱导的IRF 3核易位受到严重损害(图12)。4A(第4行)b)。在HeLa-ACE 2细胞中也观察到了类似的结果，这些细胞允许SARS-CoV-2感染(附图)。1)。核分馏实验进一步证实了这一观察，表明nsp 12的过表达明显抑制了SeV引发的IRF 3的核积累(图3)。4C)。这些数据支持SARS-CoV-2nsp 12可以抑制IRF 3在病毒感染时的核易位。此外，这种nsp 12介导的抑制被重复时，IRF 3核易位被刺激的钻机-IN过表达(图1)。4D).
图4SARS-CoV-2nsp 12可抑制IRF 3的核易位。aSARS-CoV-2nsp 12对SeV诱导的IRF 3核易位的影响。用对照质粒或nsp 12表达质粒转染HEK293T细胞。转染24h后，用SeV感染细胞4h，然后用所指示的抗体进行免疫染色。合并1和合并2分别表示合并的红色和绿色通道以及合并的红色、绿色和蓝色通道。缩放条，10μM放大后的图像是一个放大的视图对应的框。bIRF 3核转运的定量研究。在三个独立的实验中，分别测定了IRF 3阳性转染细胞的百分率。双尾未配对T-试验用于两组比较，*P < 0.001. cSeV感染后细胞质和细胞核IRF 3的免疫印迹分析。用对照质粒或nsp 12表达质粒转染HEK293T细胞。24 h后，用SeV感染细胞4h，再将细胞分为细胞质组分和细胞核组分。采用Westernblotting方法对各组分进行IRF 3和nsp 12检测。β-微管蛋白和LaminA分别作为细胞质和核标记物.车道下的数表示IRF 3波段的强度，这与拉明A的强度是一致的。dSARS-CoV-2nsp 12对RAP-IN诱导的IRF 3核易位的影响。转染HEK293T细胞后，分别用Rig-IN或Rig-IN和nsp 12表达质粒转染HEK293T细胞。转染后24h，细胞免疫染色。
然后我们研究了nsp 12是否通过与IRF 3的物理相互作用而发挥其抑制作用。免疫共沉淀试验显示nsp 12与IRF 3无关，无论是否存在SeV感染(补充图1)。2A)。作为阳性对照，TBK 1与IRF 3有效共沉淀。2B).
Nsp 12通过一种与酶活性无关的机制抑制干扰素-β的产生。
由于nsp 12负责催化病毒RNA的合成，我们探讨了它的酶活性是否参与IFN的调节。首先，我们研究了SARS-CoV-2nsp 12的RdRp活性是否是抑制病毒感染时IRF 3核易位的必要条件。在冠状病毒和其他RNA病毒中产生了两个nsp 12变异体，其中包括SDD-AAA(氨基酸759~761被丙氨酸残基取代)和G823V(氨基酸823被缬草碱取代)。检测野生型nsp 12和nsp 12突变体对IFN启动子激活和IRF 3核易位的影响。我们发现nsp 12的SDD-AAA和G823V突变体抑制了SeV诱导的IFN-β启动子激活，与野生型nsp 12的水平相当。5A)。这两个突变体也抑制了病毒感染时IRF 3的核易位(图一)。5B，c).
图5SARS-CoV-2nsp 12的聚合酶活性不需要抑制Ⅰ型干扰素的激活。aSARS-CoV-2nsp 12及其突变体对SeV诱导的IFN-β启动子激活的影响。用IFN-β报告质粒转染HEK 293 T细胞，同时转染表达野生型SARS-CoV-2 nsp 12或所指示的SARS-CoV-2 nsp 12变异体的对照质粒或质粒。细胞感染SeV 12h，检测荧光素酶活性。用Westernblotting分析所指示蛋白的表达水平。bSARS-CoV-2nsp 12及其突变体对SeV诱导的IRF 3核易位的影响。转染HEK 293 T细胞，转染表达野生型SARS-CoV-2 nsp 12或所指示的SARS-CoV-2 nsp 12变异体的对照质粒或质粒。转染24h后，用SeV感染细胞4h，然后用所指示的抗体进行免疫染色。合并1和合并2分别表示合并的红色和绿色通道以及合并的红色、绿色和蓝色通道。缩放栏，20μM.放大后的图像是相应框的放大视图。cIRF 3核转运的定量研究。dVERO细胞感染SARS-CoV-2，MOI为0.1，加入或不加10μM受体24 h，用实时RT-PCR(左面板)检测病毒在培养上清液中的拷贝数。将IFN-β报告质粒、对照质粒或nsp 12表达质粒和表达IRF 3-5D的质粒转染HEK293T细胞。转染5h后，在培养液中加入雷莫司韦(10μM)。转染24h后测定荧光素酶活性(右侧)。所有的实验至少进行了两次，并显示了一个代表性。误差栏表示技术三项的SDS。双尾未配对T-与向量组比较时，使用了两组比较，**P < 0.01, ***P < 0.001
为了进一步研究聚合酶活性是否与nsp 12的拮抗作用有关，我们检测了抑制nsp 12聚合酶活性的核苷类类似抗病毒药物瑞昔韦的作用。7雷莫司韦能有效地抑制SARS-CoV-2在细胞培养中的复制。5D然而，它未能阻断因IRF3-5D过度表达而引起的nsp 12对IFN-β激活的拮抗作用(如图所示)。5D右面板)。在此基础上，我们得出结论：SARS-CoV-2nsp 12可以以不依赖于聚合酶活性的方式抑制干扰素-β的活化。
我们随后研究了nsp 12 Niran结构域的作用，该结构域被认为具有核苷酸转移酶活性。为此，我们构建了一个没有Niran域(ΔNiran)的nsp 12突变体。瞬时转染293 T细胞，转染表达nsp 12或ΔNiran的质粒和pIFN-β-Luc及PRL-TK。24 h后，用Δ病毒刺激细胞12h，发现该突变体对干扰素的抑制作用与野生型nsp 12相似(图1)。6)，提示Niran域不参与IFN的抑制。
图6SARS-CoV-2nsp 12对IFN的调节与Niran结构域无关.aSARS-CoV-2nsp 12的示意图。bSARS-CoV-2nsp 12和ΔNiran突变体对SEV诱导的IFN-β启动子激活的影响。将IFN-β报告质粒与表达野生型nsp 12或ΔNiran突变体的对照质粒一起转染HEK 293 T细胞。细胞感染SeV 12h，检测荧光素酶活性。Westernblotting分析所指示蛋白的表达水平。双尾未配对T-与向量组*进行比较时，使用了两组比较试验。P < 0.001
冠状病毒聚合酶复合物由nsp 12和两个辅助因子nsp 7和nsp 8组成。26接下来我们将讨论这两种辅助性因子是否在nsp 12介导的IFN抑制中发挥作用。我们发现虽然nsp 7和nsp 8有促进nsp 12聚合酶活性的报道，27他们未能增强nsp 12对IFN(补充图)的抑制作用。3)，进一步提示nsp 12作为独立的IFN拮抗剂发挥作用。
