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Sars-cov-2 nsp 12抑制IRF 3核易位抑制Ⅰ型干扰素的产生

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发表时间:2021-03-09 10:05作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

SARS-CoV-2是新冠肺炎的致病剂,它已经演变成全球大流行.与其他一些呼吸道RNA病毒相比,SARS-CoV-2是一种很差的I型干扰素(IFN)诱导剂.在这里,我们报告,SARS-CoV-2nsp 12,病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),抑制宿主抗病毒反应。SARS-CoV-2nsp 12可抑制仙台病毒或聚(I:C)诱导的干扰素-β启动子激活,并呈剂量依赖性.它还能抑制RQI、MDA 5、MAVS和IRF 3过表达引起的IFN启动子激活。Nsp 12不影响IRF 3的磷酸化,但能抑制IRF 3的核转运。突变分析表明,这种抑制不依赖于nsp 12的聚合酶活性。鉴于这些发现,我们的研究表明,SARS-CoV-2RdRp可以对抗宿主抗病毒天然免疫,从而为病毒的发病机制提供了深入的见解。

导言

冠状病毒病2019(新冠肺炎)已演变成全球大流行。据世卫组织冠状病毒疾病仪表盘显示,截至2020年12月2日,新冠肺炎确诊病例为63,360,234例,其中死亡人数为1,475,825人(Https://covid19.who.int/)。严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)是新冠肺炎的致病剂.1,2,3国际病毒分类委员会已将sars-cov-2分类为冠状病毒科家庭[医]直角皮层病毒科亚家族Betacoronavirus属和萨贝格病毒亚属4

SARS-CoV-2是一种基因组约为29.7kb的正链RNA病毒.1随着ORF1a和ORF1b在进入和基因组释放后的翻译,冠状病毒的复制周期开始。5。首次合成了两种大型复制酶蛋白(pp1a和pp1ab)。然后,它们被木瓜蛋白酶(Nsp 3)和3C类蛋白酶(Nsp 5)切割成16种非结构蛋白(NSPS),包括nsp 12,一种依赖于病毒的RNA聚合酶(RdRp)。5病毒NSPS利用宿主细胞膜结构组装成复制和转录复合物,进行负链RNA合成。5,6然后合成亚基因组RNA,并表达结构蛋白和辅助蛋白。

Nsp 12由932个氨基酸组成。Nsp 12的结构包括nidvirus RdRp相关核苷酸转移酶(Niran)结构域和右RdRp结构域。7Niran域和RdRp域通过接口域连接。7RdRp结构域含有催化残基(氨基酸759-761[SDD])。7值得注意的是,sars-cov-2 rdRp有一个gdd模块(氨基酸823-825),其残基在其他病毒rdRps中起催化作用,如HCV NS5b和脊髓灰质炎病毒3d。波尔.8,9除了RNA合成外,肠道病毒、丙型肝炎病毒、蜱传脑炎病毒和朗加特病毒的rdRps通过抑制或激活IFN-β或其他细胞因子的表达,调节宿主的天然免疫应答。10,11,12,13在sars-cov-2基因的筛选中参与调节宿主的抗病毒反应,14我们发现nsp 12可以抑制SeV诱导的IFN-β启动子的激活,但其机制尚不清楚。

先天免疫系统对于病毒感染的初始检测和限制至关重要。当一个细胞被病原体感染后,模式识别受体,如钻机-I-样受体(RLRs)和Toll样受体(Toll样受体),会立即识别病原体相关的分子模式(PAMPs),从而激活天然免疫系统。15,16,17,18视黄酸诱导基因I(Rig-I)和黑色素瘤分化基因5(MDA 5)是PAMP识别后发现的两种细胞质RLRs,它们在PAMP的识别后,会产生适配蛋白线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)。19,20,21,22MAVS随后启动多个激酶的信号通路,导致干扰素调节因子3/7(IRF 3/7)的磷酸化。23经磷酸化和二聚后,IRF 3/7转运到细胞核,促进IFN-α/β的产生。24,25

在此,我们发现SARS-CoV-2nsp 12通过抑制IRF 3核易位来减弱Ⅰ型IFN反应。据我们所知,这是第一次证明冠状病毒RdRp除了显示其聚合酶和核苷酸转移酶活性外,还能拮抗Ⅰ型干扰素反应。

结果

Sars-cov-2 nsp 12抑制Ⅰ型干扰素的活化

为了研究sars-CoV-2 nsp 12是否能调节天然免疫反应,我们首先评估了nsp 12对干扰素-β启动子激活的影响。将pIFN-β启动子驱动的荧光素酶报告质粒(pIFN-β-Luc)和对照PRL-TK质粒瞬时转染293 T细胞。24h后,用SeV或高分子量的聚(I:C)(HMW-poly[I:C])刺激细胞,激活RAP-I和MDA 5信号通路。18,24刺激12h后测定荧光素酶活性。我们发现,nsp 12以剂量依赖性的方式抑制SeV-或HMW-聚(I:C)诱导的干扰素-β启动子的激活。1A,b)。RT-PCR法检测IFN-β内源性表达,证实nsp12抑制了RAP-I和MDA 5信号通路(图1)。1C)。Nsp 12的过表达也抑制了SeV刺激的STAT 1磷酸化,这是IFN-β产生后的一个事件(如图所示)。1D)。我们进一步研究了nsp 12是否影响干扰素-β产生下游的信号通路。瞬时转染293 T细胞,转染载体质粒或表达nsp 12的质粒,同时转染干扰素刺激应答元件(ISRE)报告质粒和对照PRL-TK质粒。24h后,用干扰素-β刺激细胞12h,测定荧光素酶活性。我们发现nsp 12不能抑制干扰素β诱导的启动子激活。1E),提示nsp 12干扰IFN-β的活化而不是下游信号。

图1

SARS-CoV-2nsp 12可减弱病毒RNA相关的I型干扰素应答.aNsp 12对SeV诱导的IFN-β启动子激活的影响。将IFN-β报告质粒与对照质粒一起转染HEK293T细胞,或加入大量表达nsp 12的质粒转染HEK293T细胞。细胞感染SeV 12h,检测荧光素酶活性。Westernblotting分析所指示的蛋白表达水平。采用P-IRF 3评价SeV感染后的刺激情况。bNsp 12对高分子量聚(I:C)诱导的IFN-β启动子激活的影响。将IFN-β报告质粒与对照质粒一起转染HEK293T细胞,或加入大量表达nsp 12的质粒转染HEK293T细胞。用高分子量聚(I:C)转染细胞12h,检测荧光素酶活性。Westernblotting分析所指示的蛋白表达水平。采用P-IRF 3评价对聚I:C治疗的刺激作用。cNsp 12对内源的影响干扰素-βSeV(左)和高分子量聚(I:C)诱导的mRNA表达(右)。用表达nsp 12的质粒转染HEK293T细胞。24 h后,用Sev感染细胞8h,或转染高分子量的Polyi:C,转染6h,提取总RNA,并将其表达。干扰素-β用实时RT-PCR法检测.dNsp 12对SeV诱导内源P-STAT 1的影响。用表达nsp 12的质粒转染HEK293T细胞。24 h后,用SeV感染细胞8h,用Westernblotting法检测SeV的P-STAT 1、nsp 12和P蛋白。eNsp 12对IFN诱导ISRE启动子激活的影响。将ISRE-Luc报告质粒与对照质粒一起转染HEK293T细胞,或加入大量表达nsp 12的质粒转染HEK293T细胞。24h后,用干扰素(1000 U/ml)作用12h,检测荧光素酶活性。Westernblotting分析所指示的蛋白表达水平。所有的实验至少进行了两次,并显示了一个代表性。误差栏表示技术三项的SDS。单因素方差分析(或非参数等值)用于柱分析(a, b)。双尾未配对T-试验采用两组比较(c). **P < 0.01, ***P < 0.001

Sars-cov-2 nsp12抑制IRF 3诱导的干扰素-β活化

为了鉴定SARS-CoV-2nsp 12对宿主产生抑制作用的靶点,我们将增加nsp 12的数量与Rig-IN(一种活性形式的Rip-I)、MDA 5、MAVS和IRF 3-5D(一个构成活性的IRF 3突变体)共转染,并确定了IFN-β启动子的激活。荧光素酶报告试验结果表明,nsp 12的过表达抑制了RIP-IN-、MDA 5-、Mavs-和IRF 3-5D-启动子的激活,且呈剂量依赖性。2A-d)。这些结果表明,nsp 12在IRF 3激活水平或下游抑制IFN-β的产生。

图2

SARS-CoV-2nsp12可抑制IRF 3的活化。Nsp 12对启动子激活的影响。将IFN-β报告质粒与对照质粒一起转染HEK293T细胞,同时转染表达nsp 12的质粒和表达rig-in的质粒(a),MDA 5(b)、小牛(c),或IRF3-5D(d)。转染24h后测定荧光素酶活性。用Westernblotting分析所指示蛋白的表达水平。所有的实验至少进行了两次,并显示了一个代表性。误差栏表示技术三项的SDS。单因素方差分析(及非参数等效)用于列分析,*P < 0.001

Sars-cov-2 nsp 12不抑制irf 3的磷酸化。

IRF 3被激酶Ikki和TBK 1磷酸化后激活。23为确定SARS-CoV-2nsp 12是否拮抗IRF 3磷酸化,将293 T细胞瞬时转染载体质粒或表达nsp 12的质粒。24小时后,用SeV刺激细胞,持续不同时间(见图)。3A)。另一种方法是用表达nsp 12的质粒转染细胞24h,然后用SeV感染细胞8h(见图)。3B)。在nsp 12存在或不存在时,SEV诱导IRF 3磷酸化水平相当(图12)。3A,b)在不同的环境下,提示SARS-CoV-2nsp 12不影响病毒触发的IRF 3磷酸化。

图3

SARS-CoV-2nsp 12不抑制IRF 3的磷酸化。用对照质粒或nsp 12表达质粒转染HEK293T细胞。24小时后,细胞感染SeV,并在指定的时间收集。采用Westernblotting方法对猪传染性病毒性肝炎病毒(Sev)的P-IRF 3、IRF 3、TBK 1、nsp 12和P蛋白进行了分析。b转染HEK293T细胞后,转染正常质粒或增加表达nsp 12的质粒数量。24 h后,用Sev感染细胞8h,用westernblotting方法检测pIrf 3、irf 3、nsp 12和p蛋白的表达。

Sars-cov-2 nsp 12抑制IRF 3的核易位

磷酸化的IRF 3在IFN-β转录中起着关键的作用.由于nsp 12不影响IRF 3磷酸化,我们随后研究了nsp 12是否影响293 T细胞的IRF 3核易位。免疫荧光分析显示,在未感染的细胞中,IRF 3分布于胞浆内,nsp 12表达过表达或不表达(如图12所示)。4A,第1及2行)。在转染对照载体的细胞中,在SeV感染后,IRF 3能有效地转移到细胞核(如图1所示)。4A,第3行)。然而,在表达nsp 12的细胞中,SeV诱导的IRF 3核易位受到严重损害(图12)。4A(第4行)b)。在HeLa-ACE 2细胞中也观察到了类似的结果,这些细胞允许SARS-CoV-2感染(附图)。1)。核分馏实验进一步证实了这一观察,表明nsp 12的过表达明显抑制了SeV引发的IRF 3的核积累(图3)。4C)。这些数据支持SARS-CoV-2nsp 12可以抑制IRF 3在病毒感染时的核易位。此外,这种nsp 12介导的抑制被重复时,IRF 3核易位被刺激的钻机-IN过表达(图1)。4D).

图4

SARS-CoV-2nsp 12可抑制IRF 3的核易位。aSARS-CoV-2nsp 12对SeV诱导的IRF 3核易位的影响。用对照质粒或nsp 12表达质粒转染HEK293T细胞。转染24h后,用SeV感染细胞4h,然后用所指示的抗体进行免疫染色。合并1和合并2分别表示合并的红色和绿色通道以及合并的红色、绿色和蓝色通道。缩放条,10μM放大后的图像是一个放大的视图对应的框。bIRF 3核转运的定量研究。在三个独立的实验中,分别测定了IRF 3阳性转染细胞的百分率。双尾未配对T-试验用于两组比较,*P < 0.001. cSeV感染后细胞质和细胞核IRF 3的免疫印迹分析。用对照质粒或nsp 12表达质粒转染HEK293T细胞。24 h后,用SeV感染细胞4h,再将细胞分为细胞质组分和细胞核组分。采用Westernblotting方法对各组分进行IRF 3和nsp 12检测。β-微管蛋白和LaminA分别作为细胞质和核标记物.车道下的数表示IRF 3波段的强度,这与拉明A的强度是一致的。dSARS-CoV-2nsp 12对RAP-IN诱导的IRF 3核易位的影响。转染HEK293T细胞后,分别用Rig-IN或Rig-IN和nsp 12表达质粒转染HEK293T细胞。转染后24h,细胞免疫染色。

然后我们研究了nsp 12是否通过与IRF 3的物理相互作用而发挥其抑制作用。免疫共沉淀试验显示nsp 12与IRF 3无关,无论是否存在SeV感染(补充图1)。2A)。作为阳性对照,TBK 1与IRF 3有效共沉淀。2B).

Nsp 12通过一种与酶活性无关的机制抑制干扰素-β的产生。

由于nsp 12负责催化病毒RNA的合成,我们探讨了它的酶活性是否参与IFN的调节。首先,我们研究了SARS-CoV-2nsp 12的RdRp活性是否是抑制病毒感染时IRF 3核易位的必要条件。在冠状病毒和其他RNA病毒中产生了两个nsp 12变异体,其中包括SDD-AAA(氨基酸759~761被丙氨酸残基取代)和G823V(氨基酸823被缬草碱取代)。检测野生型nsp 12和nsp 12突变体对IFN启动子激活和IRF 3核易位的影响。我们发现nsp 12的SDD-AAA和G823V突变体抑制了SeV诱导的IFN-β启动子激活,与野生型nsp 12的水平相当。5A)。这两个突变体也抑制了病毒感染时IRF 3的核易位(图一)。5B,c).

图5

SARS-CoV-2nsp 12的聚合酶活性不需要抑制Ⅰ型干扰素的激活。aSARS-CoV-2nsp 12及其突变体对SeV诱导的IFN-β启动子激活的影响。用IFN-β报告质粒转染HEK 293 T细胞,同时转染表达野生型SARS-CoV-2 nsp 12或所指示的SARS-CoV-2 nsp 12变异体的对照质粒或质粒。细胞感染SeV 12h,检测荧光素酶活性。用Westernblotting分析所指示蛋白的表达水平。bSARS-CoV-2nsp 12及其突变体对SeV诱导的IRF 3核易位的影响。转染HEK 293 T细胞,转染表达野生型SARS-CoV-2 nsp 12或所指示的SARS-CoV-2 nsp 12变异体的对照质粒或质粒。转染24h后,用SeV感染细胞4h,然后用所指示的抗体进行免疫染色。合并1和合并2分别表示合并的红色和绿色通道以及合并的红色、绿色和蓝色通道。缩放栏,20μM.放大后的图像是相应框的放大视图。cIRF 3核转运的定量研究。dVERO细胞感染SARS-CoV-2,MOI为0.1,加入或不加10μM受体24 h,用实时RT-PCR(左面板)检测病毒在培养上清液中的拷贝数。将IFN-β报告质粒、对照质粒或nsp 12表达质粒和表达IRF 3-5D的质粒转染HEK293T细胞。转染5h后,在培养液中加入雷莫司韦(10μM)。转染24h后测定荧光素酶活性(右侧)。所有的实验至少进行了两次,并显示了一个代表性。误差栏表示技术三项的SDS。双尾未配对T-与向量组比较时,使用了两组比较,**P < 0.01, ***P < 0.001

为了进一步研究聚合酶活性是否与nsp 12的拮抗作用有关,我们检测了抑制nsp 12聚合酶活性的核苷类类似抗病毒药物瑞昔韦的作用。7雷莫司韦能有效地抑制SARS-CoV-2在细胞培养中的复制。5D然而,它未能阻断因IRF3-5D过度表达而引起的nsp 12对IFN-β激活的拮抗作用(如图所示)。5D右面板)。在此基础上,我们得出结论:SARS-CoV-2nsp 12可以以不依赖于聚合酶活性的方式抑制干扰素-β的活化。

我们随后研究了nsp 12 Niran结构域的作用,该结构域被认为具有核苷酸转移酶活性。为此,我们构建了一个没有Niran域(ΔNiran)的nsp 12突变体。瞬时转染293 T细胞,转染表达nsp 12或ΔNiran的质粒和pIFN-β-Luc及PRL-TK。24 h后,用Δ病毒刺激细胞12h,发现该突变体对干扰素的抑制作用与野生型nsp 12相似(图1)。6),提示Niran域不参与IFN的抑制。

图6

SARS-CoV-2nsp 12对IFN的调节与Niran结构域无关.aSARS-CoV-2nsp 12的示意图。bSARS-CoV-2nsp 12和ΔNiran突变体对SEV诱导的IFN-β启动子激活的影响。将IFN-β报告质粒与表达野生型nsp 12或ΔNiran突变体的对照质粒一起转染HEK 293 T细胞。细胞感染SeV 12h,检测荧光素酶活性。Westernblotting分析所指示蛋白的表达水平。双尾未配对T-与向量组*进行比较时,使用了两组比较试验。P < 0.001

冠状病毒聚合酶复合物由nsp 12和两个辅助因子nsp 7和nsp 8组成。26接下来我们将讨论这两种辅助性因子是否在nsp 12介导的IFN抑制中发挥作用。我们发现虽然nsp 7和nsp 8有促进nsp 12聚合酶活性的报道,27他们未能增强nsp 12对IFN(补充图)的抑制作用。3),进一步提示nsp 12作为独立的IFN拮抗剂发挥作用。

讨论

SARS-CoV-2感染可诱导培养细胞和新冠肺炎患者产生异常的Ⅰ型干扰素.28这一现象至少在一定程度上是由于病毒逃避和抑制IFN活化的各种机制所致。29,30SARS-CoV-2蛋白,包括nsp 1、nsp 3、nsp 6、nsp 8、nsp 12、nsp 13、nsp 14、nsp 15、ORF 3、ORF 6、ORF 8、ORF9b、M和N,均能抑制I型IFN的激活及相应的应答。14,31,32,33,34,35,36,37,38,39在此,我们报道了SARS-CoV-2的nsp 12通过抑制IRF 3核易位来减弱I型IFN的诱导。

在我们和其他小组筛选可能调节I型干扰素的病毒蛋白的过程中,14,38多个NSPS,包括nsp 12、nsp 13、nsp 14和nsp 15,具有拮抗作用。这些NSPS立即从传入的病毒基因组RNA中翻译出来。我们推测,这些“早期”病毒蛋白,包括nsp 12,可能有助于对抗感染开始时由传入的病毒RNA或其他信号引发的宿主先天免疫反应。然后,这些蛋白质被吸收到双膜囊泡中,形成一个复制/转录复合物,催化病毒基因组复制和转录。然后,从亚基因组RNA(包括ORF 3、ORF 6和M)中翻译出“晚期”病毒蛋白,这些RNA对宿主IFN的激活和信号传递有很强的抑制作用。

其他RNA病毒的聚合酶已被报道调节Ⅰ型干扰素的激活。三维空间波尔肠道病毒71和柯萨奇病毒B3与MDA 5的caspase激活和募集结构域相互作用,抑制IFN-β启动子的激活和mRNA的表达。10与sars-cov-2 nsp 12的情况相似,ev 71 3d的聚合酶活性。波尔不需要抑制I型干扰素的激活。10丙型肝炎病毒、蜱传播脑炎病毒和Langat病毒等黄病毒聚合酶通过RdRp活性调节Ⅰ型干扰素的应答。11,12,13这些发现表明,病毒聚合酶除了发挥RdRp活性外,还能发挥多种作用。目前尚不清楚nsp12如何抑制IRF 3核易位,其潜在机制有待进一步研究。

总之,我们证明SARS-CoV-2nsp 12通过抑制IRF 3核易位来抑制Ⅰ型干扰素的激活。这种抑制作用与nsp 12聚合酶活性无关。进一步了解nsp 12的作用机制可能会为我们提供新的治疗靶点。


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