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INKT细胞的转录体和染色质形态是由亚群分化和抗原暴露形成的

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发表时间:2021-03-09 09:29作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

自然杀伤T细胞(iNKT细胞)分化为胸腺和外周NKT 1、NKT 2和NKT 17亚群。在这里,我们使用rna-seq和ATAC-seq分析,并表明iNKT亚群是相似的,无论组织位置.肺iNKT细胞亚群具有最明显的位置特异性特征,与肺内其他先天淋巴细胞共有,可能与活化增强相一致。在抗原刺激后,iNKT细胞经历染色质和转录的变化,描绘出两个群体:一个类似于滤泡辅助T细胞,另一个类似NK或效应细胞。表型分析表明,这些变化是长期观察到的,表明iNKT细胞基因程序不是固定的,但它们能够在抗原后进行染色质重塑,从而产生额外的亚群。

导言

不变自然杀伤T(INKT)细胞被认为是一种与生俱来的T淋巴细胞群体,可以启动或抑制免疫反应,这取决于背景。激活后,iNKT细胞迅速产生大量的细胞因子,类似于其他先天的淋巴细胞。1。INKT细胞表达由Vα14-Jα18组成的不变体TCRα链(Trav 11-Traj 18)小鼠的重排,人类和许多其他哺乳动物的保守重排。这些细胞由非经典的mhcⅠ类分子CD1d提出的自身或微生物糖脂抗原激活。2.

在胸腺中,iNKT细胞分化为三种效应细胞亚群NKT 1、NKT 2和NKT 17,而不受外源抗原的影响。它们的效应功能和细胞因子谱类似于T。H1,TH2,和TH17 CD4+T细胞和其他淋巴细胞亚群,包括ILC、黏膜相关不变T细胞和γδT细胞。3,4,5。在胸腺内,这些iNKT细胞亚群具有高度不同的表观遗传景观和转录程序。6,7,8。值得注意的是,有几百个基因在胸腺iNKT细胞亚群之间有差异表达,尽管它们具有相似的特异性,尽管它们有不同的阳性选择途径。9。有证据表明,一些iNKT细胞是长期居住在胸腺的居民,这些细胞可能参与了胸腺的动态平衡。6。从胸腺流出后,iNKT细胞定位于全身各组织,大部分外周iNKT细胞不会再循环。10,11.

虽然已经发现了不同的胸腺iNKT细胞亚群,但它们与相应的外周iNKT细胞亚群的关系还没有得到评估。我们和其他人已经通过基因表达和染色质可及性的全基因组分析来定义iNKT细胞亚群分化的分子细节。7,8,11,12。这些数据确定了胸腺iNKT细胞亚群之间转录程序的诱导和分化,但组织定位对这些程序的影响仍不完全清楚。为了解决这些问题,我们比较了来自胸腺的iNKT细胞的转录和表观基因组数据。类似的方法被用来跟踪这些细胞在抗原暴露后的变化。我们对iNKT细胞亚群的转录组和表观基因组的全基因组分析,提供了对胸腺中启动的染色质景观的稳定性和可塑性的洞察,也许也是通过外周启动的。

结果

胸腺iNKT细胞亚群的发散染色质景观

在此之前,我们发现胸腺iNKT细胞亚群具有高度分化的转录序列。8。其他人也得到了类似的结果。7,11,12。此外,我们通过h3k27乙酰化修饰的全基因组分析表明,胸腺iNKT细胞亚群在增强子标记上存在显著差异。8。由于一个细胞群体的表观遗传格局比转录组更稳定,我们用测序法分析了胸腺iNKT细胞亚群的表观遗传格局,并对转座酶可访问的染色质进行了分析(atac-seq)。13。胸腺iNKT细胞亚群根据表面蛋白的表达进行分类,并通过转录因子染色进行验证(附图)。1A、b)。根据我们先前对胸腺iNKT细胞亚群的rna-seq分析,我们排除了CD1d-四聚体的群体。+具有中间表型的细胞,或称IL-17 RB+表达CXCR 3或CD 122的细胞,以获得更多的纯化亚群(附图)。1C)。表达RORCTbx 21各iNKT细胞亚群在多个组织中的转录本进一步显示了分选效率;RORC转录本仅在NKT 17细胞中表达,而Tbx 21NKT 1细胞主要表达转录本(附图)。1D).

与先前的结果一致,我们发现iNKT细胞胸腺亚群中的可访问染色质的分布是非常分散的,在500-7500个差异可达的染色质区(图.1A)。作为对比,幼稚和记忆CD8+T细胞5700个染色质差异可达区14,15。图形1B重点介绍了一些关键的细胞因子和转录因子基因位点的研究结果。例如,在IFNG胸腺NKT 1细胞的位点(图)。1B)。虽然NKT 2细胞在多个峰值也有明显的信号,但在tss(垂直灰度棒)上游的近端增强子5 kb处检测不到信号。IFNG转录(图1.1B)16。不出所料,我们发现IL17A位点在NKT 17细胞中最易接触。这个IL4IL 13NKT 2和NKT 1细胞中的位点都是开放的,很可能反映了NKT 1细胞产生某些T的能力。H2强激活后的细胞因子。1B)。同样,对于驱动关键细胞因子表达的转录因子,Tbx 21编码T-bet的位点在NKT 1细胞中更易进入,RORCNKT 17细胞表达增强。1B,右)。Zbtb 16编码PLZF,一种产生所有iNKT细胞所需的转录因子9,可在所有子集中获得,但mRNA和蛋白的表达(补充图)。1B)NKT 2胸腺细胞表达较高。这些来自C57BL/6J胸腺iNKT细胞的观察与以前对BALB/c小鼠胸腺iNKT细胞的基因表达和染色质可及性的分析相一致。7,12.

图1:胸腺iNKT细胞在染色质可达性方面有差异。

a每峰平均ATAC-seq计数的散射图,比较胸腺iNKT细胞亚群染色质的差异可达区域。颜色表示由limma/voom定义的不同可访问区域(“方法”中的详细信息)。蓝色=富集NKT 2,绿色=富集NKT 1,紫色=富集NKT 17。胸腺=你的。并对差异表达基因的数量进行了分析。bAtac-seq覆盖范围为0-600的所有样本所指示的基因位点.左上面板中的灰色条(IFNG)位点指示增强子区域。c左边,k-相对ATAC-seq密度的聚类(每百万映射读取数/kb,日志)2从平均数中找出8组相似变化的可达区域(行),其中3组为NKT 1,2组为NKT 2,3组为NKT 17。列表示复制的数量,3或4。d在可到达区域的丛集中丰富了主题。所有带有荷马原木的母题p数值小于-15使用累积二项分布测试,并发现在10%或以上的区域中,至少一个集群显示。

我们在胸腺子集之间划分了所有不同的可访问区域(如图所示)。1A)分成八组k-意味着对ATAC-seq信号进行聚类,以确定具有类似变化的潜在调控元素。然后,我们检查了在不同的胸腺细胞iNKT细胞亚群中,每一组区域的可达性(如图所示)。1C)。在NKT 1和NKT 17细胞中,簇1~3区的信号最高,而第4~5组和第6~8组的信号最高。为了将调节元件可达性的变化与转录因子联系起来,我们确定了与dna结合蛋白相关的已知基序的富集。在NKT 1细胞典型的簇1-3中,可达区常含有TBox基序,而Runt和ETS基序在较小程度上含有TBox基序。与Tcf 1和Lef1相关的HMG盒蛋白基序在NKT 2胸腺细胞中富集,锌指区和RHD结构域分别含有Egr1和NFAT基序。Tcf 1的表达(编码为Tcf7)在NKT 2细胞中富集,是iNKT细胞发育所必需的。17。此外,iNKT细胞的增殖和分化需要Lef1,NKT细胞的效应器功能与Tcf 1无关。18。NKT 17细胞中可进入的区域被浓缩成核受体的一致基序,其中可以包括RORC和Re谓词(图1)。1D).

不同位点的iNKT细胞亚群相似。

为了了解胸腺相关基因在周围的表达程度,并评估组织定位对染色质可及性和转录组的影响,我们通过RNA-seq和ATAC-seq分析比较了胸腺和脾脏、肝脏和肺中的iNKT细胞亚群。以往的研究表明,NKT 1细胞是C57BL/6J小鼠iNKT细胞的优势群体,在分析的所有组织部位中,NKT 1细胞占大多数。6。NKT 17细胞优先定位于肺、淋巴结和皮肤,NKT 2细胞在脾脏和肠系膜淋巴结中更丰富。6。由于细胞数量非常少,因此未对来自肝脏的NKT 2和NKT 17细胞进行分析。虽然我们使用了一种不同的rna-seq技术,允许更高的测序深度。19,我们发现胸腺NKT 1、NKT 2和NKT 17胸腺细胞的基因表达谱与先前的研究非常相似。8(补充图。2)。根据大量的RNA-seq分析,我们观察到,就像在胸腺中一样,特定组织中的iNKT细胞亚群是相互区别的(补充图)。2)。同样,来自脾脏的iNKT亚群的染色质可达性剖面显示出不同的可及区模式(图1)。2A)。虽然脾NKT 2和NKT 17细胞的相似程度高于胸腺,但仍有3500多个差异可达位点(图1)。2A).

图2:与子集相比,组织位置的印记较小。

a每峰平均ATAC-seq计数散点图,比较脾iNKT细胞亚群(SPL.)染色质差异可达区。颜色表示由limma/voom定义的不同可访问区域(“方法”中的详细信息)。b在区分胸腺iNKT细胞亚群的差异可达区域,指示样本(标记在底部)的归一化平均ATAC-seq计数。方格表示中间四分位数范围,晶须+/−为此范围的1.5倍,并指出离群点。n=4胸腺NKT 1和NKT 2,n=3胸腺NKT 17和肺NKT 1,n=1表示肺NKT 2,和n=2适用于所有其他样本。c, dATACseq的PCA显示(c)和rna-seq(d)来自不同组织的iNKT细胞亚群的数据。e从rna-seq读取胸腺与外周iNKT细胞亚群差异调节基因的热图,n>2倍差,p=0.1。

在比较胸腺iNKT细胞亚群与其外周对应物时,我们发现与组织位置相关的差异较小,而与子集同一性相关的差异较小。例如,比较外周血NKT 1和胸腺NKT 1细胞,我们发现差异可达染色质区少于1000个。同样,我们观察到不同外周组织之间NKT 1细胞在可接近染色质区的差异相对较小(见图)。2B)。通过分析不同组织的NKT 2和NKT 17细胞染色质的可及性,得到了类似的结果。ATAC-seq数据的主成分分析(PCA)揭示了子集同一性的强烈影响。2C)。对于rna-seq数据,我们也得到了类似的结论,尽管我们确实发现了一些基于组织的分离(见图)。二维空间).

尽管胸腺和外周组织之间存在着整体的相似性,但在特定的胸腺子集中,有一些转录本与每个外周部位相同的子集相比较,特别丰富了转录本,包括Egr2毒理(无花果)2E)。这些转录因子是iNKT细胞分化早期所必需的。20,21,因此,这可能反映了这些基因在成熟胸腺iNKT细胞亚群中的残留表达,在胸腺中存活很长时间。有些转录本是相反的,与胸腺相比,在所有或几个外周组织中富集,不受子集限制。这些包括第2条P2rx 7,以前有报道称,外周血iNKT细胞总数有所增加。22,这使得细胞对NAD诱导的细胞死亡和奥斯金1,在其他情况下被确认为抑制生长的蛋白质。23。这些基因的表达可能反映了对潜在的自身反应性iNKT细胞的扩张和功能的抑制作用。24。外周血iNKT细胞各部位均有富集。TSpan 13,和Klf 3,其在记忆CD8中的表达增加。+T细胞25.

肺组织中一种基因表达标志的鉴定

虽然iNKT细胞亚群是导致基因组差异的主要因素,但肺iNKT细胞与其他部位的细胞有共同的特征。这是由rna-seq数据的PC2所揭示的。二维空间),或对ATAC-seq数据进行PC3分析(如图所示)。3A)。编码ap-1和其他bZIP家族成员以及NF-κB家族的部分成员的转录本在所有肺iNKT细胞亚群中都有丰富,编码ctla-4、CD 69和Nr4a1编码NURE 77(图7.3B和补充图。3)。此外,与转录因子AP1和ATF相关的bZIP基序以及可包括NF-κB-p65结合位点的rHD基序也丰富了肺iNKT细胞中较易进入的区域(如图1所示)。3C)。这些数据与肺iNKT细胞的组织定位或活化增强相一致,而且我们确实发现了一个亚群体的肺iNKT细胞通过流式细胞术表达CTLA-4(如图1所示)。三维空间)。为了确定iNKT细胞的特征不能归因于单个小鼠的感染或炎症,我们从一家商业供应商获得的iNKT细胞亚群中筛选出iNKT细胞亚群,并进行了RNA-seq检测。我们在每个个体中发现了相似的肺基因表达特征(补充图)。3).

图3:肺特异性转录组和表观基因组。

aPC1通过PC3显示ATAC-seq数据,显示不同组织iNKT细胞亚群的分布情况。肝脏=Liv.b从所述位点选择的AP-1和ATF家族基因在iNKT亚组中的相对RNA表达热图。cChromVAR计算ATAC-seq信号(Z-记分)在含有指示转录因子基序的区域的偏差。带a的母题p数值小于1e-25显示,家庭和有代表性的成员被标记。样本显示在底部,来自肺的iNKT细胞亚群被装箱以突出肺丰富的结构。dCTLA-4在体外诱导的iNKT细胞中的表达。代表iNKT细胞(左)和百分比CTLA-4的细胞图谱+细胞内的每个子集来自不同的器官(右)。符号描绘的是个体老鼠,酒吧描绘的是中庸和SD。数据来自五个实验,n=8只小鼠,统计学意义(p < 0.001 for NKT1 and p=0.0004(NKT 2和NKT 17)通过Kruskal-Wallis测试评估。eCTLA-4在体外培养的iNKT细胞中的表达。符号描绘的是个体老鼠,酒吧描绘的是中庸和SD,n=8只来自两个独立实验的小鼠。统计意义(p < 0.0001) assessed via one-way ANOVA.

肺内的细胞暴露在环境和微生物抗原以及氧气的不同环境中。接下来,我们询问来自另一个富含抗原的小肠的iNKT细胞是否有类似的CTLA-4表达增加。我们发现来自小肠固有层的总iNKT细胞(SI-LPL)与肺iNKT细胞表达CTLA-4相似,而脾iNKT细胞则不表达CTLA-4。3E)。这些数据表明,抗原丰富的环境可能会在不同的部位印证我们所称的肺激活特征的各个方面。