INKT细胞的转录体和染色质形态是由亚群分化和抗原暴露形成的

自然杀伤T细胞(iNKT细胞)分化为胸腺和外周NKT 1、NKT 2和NKT 17亚群。在这里，我们使用rna-seq和ATAC-seq分析，并表明iNKT亚群是相似的，无论组织位置.肺iNKT细胞亚群具有最明显的位置特异性特征，与肺内其他先天淋巴细胞共有，可能与活化增强相一致。在抗原刺激后，iNKT细胞经历染色质和转录的变化，描绘出两个群体：一个类似于滤泡辅助T细胞，另一个类似NK或效应细胞。表型分析表明，这些变化是长期观察到的，表明iNKT细胞基因程序不是固定的，但它们能够在抗原后进行染色质重塑，从而产生额外的亚群。

不变自然杀伤T(INKT)细胞被认为是一种与生俱来的T淋巴细胞群体，可以启动或抑制免疫反应，这取决于背景。激活后，iNKT细胞迅速产生大量的细胞因子，类似于其他先天的淋巴细胞。1。INKT细胞表达由Vα14-Jα18组成的不变体TCRα链(Trav 11-Traj 18)小鼠的重排，人类和许多其他哺乳动物的保守重排。这些细胞由非经典的mhcⅠ类分子CD1d提出的自身或微生物糖脂抗原激活。2.

在胸腺中，iNKT细胞分化为三种效应细胞亚群NKT 1、NKT 2和NKT 17，而不受外源抗原的影响。它们的效应功能和细胞因子谱类似于T。H1，TH2，和TH17 CD4+T细胞和其他淋巴细胞亚群，包括ILC、黏膜相关不变T细胞和γδT细胞。3,4,5。在胸腺内，这些iNKT细胞亚群具有高度不同的表观遗传景观和转录程序。6,7,8。值得注意的是，有几百个基因在胸腺iNKT细胞亚群之间有差异表达，尽管它们具有相似的特异性，尽管它们有不同的阳性选择途径。9。有证据表明，一些iNKT细胞是长期居住在胸腺的居民，这些细胞可能参与了胸腺的动态平衡。6。从胸腺流出后，iNKT细胞定位于全身各组织，大部分外周iNKT细胞不会再循环。10,11.

虽然已经发现了不同的胸腺iNKT细胞亚群，但它们与相应的外周iNKT细胞亚群的关系还没有得到评估。我们和其他人已经通过基因表达和染色质可及性的全基因组分析来定义iNKT细胞亚群分化的分子细节。7,8,11,12。这些数据确定了胸腺iNKT细胞亚群之间转录程序的诱导和分化，但组织定位对这些程序的影响仍不完全清楚。为了解决这些问题，我们比较了来自胸腺的iNKT细胞的转录和表观基因组数据。类似的方法被用来跟踪这些细胞在抗原暴露后的变化。我们对iNKT细胞亚群的转录组和表观基因组的全基因组分析，提供了对胸腺中启动的染色质景观的稳定性和可塑性的洞察，也许也是通过外周启动的。

胸腺iNKT细胞亚群的发散染色质景观

在此之前，我们发现胸腺iNKT细胞亚群具有高度分化的转录序列。8。其他人也得到了类似的结果。7,11,12。此外，我们通过h3k27乙酰化修饰的全基因组分析表明，胸腺iNKT细胞亚群在增强子标记上存在显著差异。8。由于一个细胞群体的表观遗传格局比转录组更稳定，我们用测序法分析了胸腺iNKT细胞亚群的表观遗传格局，并对转座酶可访问的染色质进行了分析(atac-seq)。13。胸腺iNKT细胞亚群根据表面蛋白的表达进行分类，并通过转录因子染色进行验证(附图)。1A、b)。根据我们先前对胸腺iNKT细胞亚群的rna-seq分析，我们排除了CD1d-四聚体的群体。+具有中间表型的细胞高，或称IL-17 RB+表达CXCR 3或CD 122的细胞，以获得更多的纯化亚群(附图)。1C)。表达RORC和Tbx 21各iNKT细胞亚群在多个组织中的转录本进一步显示了分选效率；RORC转录本仅在NKT 17细胞中表达，而Tbx 21NKT 1细胞主要表达转录本(附图)。1D).

与先前的结果一致，我们发现iNKT细胞胸腺亚群中的可访问染色质的分布是非常分散的，在∼500-7500个差异可达的染色质区(图.1A)。作为对比，幼稚和记忆CD8+T细胞∼5700个染色质差异可达区14,15。图形1B重点介绍了一些关键的细胞因子和转录因子基因位点的研究结果。例如，在IFNG胸腺NKT 1细胞的位点(图)。1B)。虽然NKT 2细胞在多个峰值也有明显的信号，但在tss(垂直灰度棒)上游的近端增强子5 kb处检测不到信号。IFNG转录(图1.1B)16。不出所料，我们发现IL17A位点在NKT 17细胞中最易接触。这个IL4和IL 13NKT 2和NKT 1细胞中的位点都是开放的，很可能反映了NKT 1细胞产生某些T的能力。H2强激活后的细胞因子。1B)。同样，对于驱动关键细胞因子表达的转录因子，Tbx 21编码T-bet的位点在NKT 1细胞中更易进入，RORCNKT 17细胞表达增强。1B，右)。Zbtb 16编码PLZF，一种产生所有iNKT细胞所需的转录因子9，可在所有子集中获得，但mRNA和蛋白的表达(补充图)。1B)NKT 2胸腺细胞表达较高。这些来自C57BL/6J胸腺iNKT细胞的观察与以前对BALB/c小鼠胸腺iNKT细胞的基因表达和染色质可及性的分析相一致。7,12.

我们在胸腺子集之间划分了所有不同的可访问区域(如图所示)。1A)分成八组k-意味着对ATAC-seq信号进行聚类，以确定具有类似变化的潜在调控元素。然后，我们检查了在不同的胸腺细胞iNKT细胞亚群中，每一组区域的可达性(如图所示)。1C)。在NKT 1和NKT 17细胞中，簇1~3区的信号最高，而第4~5组和第6~8组的信号最高。为了将调节元件可达性的变化与转录因子联系起来，我们确定了与dna结合蛋白相关的已知基序的富集。在NKT 1细胞典型的簇1-3中，可达区常含有TBox基序，而Runt和ETS基序在较小程度上含有TBox基序。与Tcf 1和Lef1相关的HMG盒蛋白基序在NKT 2胸腺细胞中富集，锌指区和RHD结构域分别含有Egr1和NFAT基序。Tcf 1的表达(编码为Tcf7)在NKT 2细胞中富集，是iNKT细胞发育所必需的。17。此外，iNKT细胞的增殖和分化需要Lef1，NKT细胞的效应器功能与Tcf 1无关。18。NKT 17细胞中可进入的区域被浓缩成核受体的一致基序，其中可以包括RORC和Re谓词(图1)。1D).

不同位点的iNKT细胞亚群相似。

为了了解胸腺相关基因在周围的表达程度，并评估组织定位对染色质可及性和转录组的影响，我们通过RNA-seq和ATAC-seq分析比较了胸腺和脾脏、肝脏和肺中的iNKT细胞亚群。以往的研究表明，NKT 1细胞是C57BL/6J小鼠iNKT细胞的优势群体，在分析的所有组织部位中，NKT 1细胞占大多数。6。NKT 17细胞优先定位于肺、淋巴结和皮肤，NKT 2细胞在脾脏和肠系膜淋巴结中更丰富。6。由于细胞数量非常少，因此未对来自肝脏的NKT 2和NKT 17细胞进行分析。虽然我们使用了一种不同的rna-seq技术，允许更高的测序深度。19，我们发现胸腺NKT 1、NKT 2和NKT 17胸腺细胞的基因表达谱与先前的研究非常相似。8(补充图。2)。根据大量的RNA-seq分析，我们观察到，就像在胸腺中一样，特定组织中的iNKT细胞亚群是相互区别的(补充图)。2)。同样，来自脾脏的iNKT亚群的染色质可达性剖面显示出不同的可及区模式(图1)。2A)。虽然脾NKT 2和NKT 17细胞的相似程度高于胸腺，但仍有3500多个差异可达位点(图1)。2A).

在比较胸腺iNKT细胞亚群与其外周对应物时，我们发现与组织位置相关的差异较小，而与子集同一性相关的差异较小。例如，比较外周血NKT 1和胸腺NKT 1细胞，我们发现差异可达染色质区少于1000个。同样，我们观察到不同外周组织之间NKT 1细胞在可接近染色质区的差异相对较小(见图)。2B)。通过分析不同组织的NKT 2和NKT 17细胞染色质的可及性，得到了类似的结果。ATAC-seq数据的主成分分析(PCA)揭示了子集同一性的强烈影响。2C)。对于rna-seq数据，我们也得到了类似的结论，尽管我们确实发现了一些基于组织的分离(见图)。二维空间).

尽管胸腺和外周组织之间存在着整体的相似性，但在特定的胸腺子集中，有一些转录本与每个外周部位相同的子集相比较，特别丰富了转录本，包括Egr2和毒理(无花果)2E)。这些转录因子是iNKT细胞分化早期所必需的。20,21，因此，这可能反映了这些基因在成熟胸腺iNKT细胞亚群中的残留表达，在胸腺中存活很长时间。有些转录本是相反的，与胸腺相比，在所有或几个外周组织中富集，不受子集限制。这些包括第2条和P2rx 7，以前有报道称，外周血iNKT细胞总数有所增加。22，这使得细胞对NAD诱导的细胞死亡和奥斯金1，在其他情况下被确认为抑制生长的蛋白质。23。这些基因的表达可能反映了对潜在的自身反应性iNKT细胞的扩张和功能的抑制作用。24。外周血iNKT细胞各部位均有富集。TSpan 13，和Klf 3，其在记忆CD8中的表达增加。+T细胞25.

肺组织中一种基因表达标志的鉴定

虽然iNKT细胞亚群是导致基因组差异的主要因素，但肺iNKT细胞与其他部位的细胞有共同的特征。这是由rna-seq数据的PC2所揭示的。二维空间)，或对ATAC-seq数据进行PC3分析(如图所示)。3A)。编码ap-1和其他bZIP家族成员以及NF-κB家族的部分成员的转录本在所有肺iNKT细胞亚群中都有丰富，编码ctla-4、CD 69和Nr4a1编码NURE 77(图7.3B和补充图。3)。此外，与转录因子AP1和ATF相关的bZIP基序以及可包括NF-κB-p65结合位点的rHD基序也丰富了肺iNKT细胞中较易进入的区域(如图1所示)。3C)。这些数据与肺iNKT细胞的组织定位或活化增强相一致，而且我们确实发现了一个亚群体的肺iNKT细胞通过流式细胞术表达CTLA-4(如图1所示)。三维空间)。为了确定iNKT细胞的特征不能归因于单个小鼠的感染或炎症，我们从一家商业供应商获得的iNKT细胞亚群中筛选出iNKT细胞亚群，并进行了RNA-seq检测。我们在每个个体中发现了相似的肺基因表达特征(补充图)。3).

肺内的细胞暴露在环境和微生物抗原以及氧气的不同环境中。接下来，我们询问来自另一个富含抗原的小肠的iNKT细胞是否有类似的CTLA-4表达增加。我们发现来自小肠固有层的总iNKT细胞(SI-LPL)与肺iNKT细胞表达CTLA-4相似，而脾iNKT细胞则不表达CTLA-4。3E)。这些数据表明，抗原丰富的环境可能会在不同的部位印证我们所称的肺激活特征的各个方面。

其他先天或先天样淋巴细胞群体存在于肺中，包括γδT细胞、MAIT细胞、ILC和NK细胞，以及主流常驻淋巴细胞和一些循环细胞。我们检测了iNKT细胞的肺激活特征是否扩展到其他几个肺群。因此，我们对分类的γδT细胞、NK细胞以及幼稚的CD4进行了atac-seq和rna-seq分析。+T细胞来自肺和脾脏。肺γδT细胞和NK细胞在bZIP和rHD基序富集区域的染色质可达性增加的基础上表现出肺信号(如图所示)。4AγδT细胞在核受体基序富集区具有可及性，其中包括rORγt-结合位点，而NK细胞则是T盒基序富集的。肺CD4+T细胞与其他细胞类型不同，但在含有bZIP(ATF)和RHD(NF-κB-p65)基序的区域有一定的信号增强(如图所示)。4A)。对rna-seq数据的pca分析，包括来自脾脏或肺的iNKT细胞，显示出每种肺细胞类型的分离，包括CD4。+T细胞，来自于脾脏中相应的细胞类型(如图所示)。4B)。此外，我们发现iNKT细胞肺标志基因的表达增加，列在补充图中。3，在肺γδT细胞中，NK细胞与相应的脾细胞群体进行比较(图一)。4C)。肺CD4转录体+T细胞分化程度较高，但与肺内先天或先天样淋巴细胞群仍有一些共同特征(图一)。4C)。如图所示。4D，这表明Fosl 2，Bhlhe 40，和TNFAIP 3肺组织的所有细胞类型都较高。基因集富集分析(GSEA)26利用iNKT细胞肺信号对肺和脾各细胞型进行预排序分析，进一步证实了每种细胞型肺信号的强烈富集(图一)。4E).

抗原后表观和转录的变化

基于这些数据的统一假设是，iNKT细胞亚群在胸腺和种子周围组织中形成，其功能固定，对其染色质景观和转录谱的影响相对较小，但肺组织中的部分细胞除外。为了验证这一点，我们确定了在脾iNKT细胞(主要是NKT 1细胞)强烈的抗原性攻击后，这些特征是否仍然存在。为了研究抗原对iNKT细胞染色质结构和转录体的影响，我们给小鼠注射αGalCer，6天后取脾。据报道，在暴露于强效糖脂抗原α-半乳糖基神经酰胺(αGalcer)后，一些iNKT细胞显示出一个T滤泡辅助细胞(T)。FH)-样表型，CXCR 5、PD-1和BCL 6表达增加(附图)。4A、b)。这些所谓的NKTFH细胞产生IL-21，并定位于生发中心。27，并可能在早期生发中心的形成中起一定作用。28，但其基因表达程序尚未阐明。假定NKTFH(αGalCer负载CD1d四聚体)+CXCR 5+Pd-1+)及注射抗原小鼠iNKT细胞(CXCR 5)的剩余细胞。−Pd-1–用ATAC-seq和RNA-seq对NKT非FH细胞进行分类分析.值得注意的是，NKT 1、NKT 2和NKT 17细胞的抗原经验版本在αGalCer攻击后6天内无法确定，因此不能单独分析。如图所示。5A，与NKT相比，染色质的可达区域有很大的不同。FH和抗原暴露的非fh细胞，我们称之为iNKT细胞效应因子(Nkt)。EFF)。NKT染色质可达区FH与未注射小鼠脾脏中NKT 1、NKT 2和NKT 17的亚群也有很大差异，与NKT 17细胞差异最大(图1)。5A，左)。NKT染色质可及性增强FH在IL 21轨迹和Pdcd 1NKT基因pd-1位点编码FH细胞(图1.5B)，反射TFH状态。NKT内染色质的可及区EFF与未受攻击小鼠的iNKT细胞亚群相比，也有很大差异，但与NKT 1细胞最为相似(见图)。5A，右)。这些数据表明，大多数脾iNKT细胞暴露在抗原中，包括那些未成为NKT的细胞。FH.

我们在NKT之间划分了所有不同的可访问区域。FH和NKTEFF未免疫小鼠脾iNKT细胞亚群分为10组k-意味着聚类，以确定ATAC-seq信号发生类似变化的区域。如前所述，我们检查了在iNKT细胞群体中，各组区域的差异可达性的程度(如图所示)。5C)及其与DNA结合蛋白基序的关系(见图)。5C)。值得注意的是，来自αGalCer免疫小鼠的两个群体增加了对第7簇的可及性，它们含有T盒蛋白的基序，并在较小程度上增加了NF-κB和IRF蛋白的可及性。在含有家族驱动转录因子rorγt(核受体基序)和GATA 3(锌指基序)的区域，它们在簇1和2中的可达性降低。FHRHD结构域转录因子(NFAT和NF-κB)和bZIP基序(AP-1家族转录因子的特征)在第8和第9簇内的细胞数量增加，提示其具有较强的激活状态。第4组和第5组在NKT中更容易获得EFF也存在于未免疫小鼠的NKT 1细胞中。这些可访问区域对T-bet、ETS和Runt相关域的主题进行了富集.NKTEFF在含有更多锌指转录因子和ETS基序的区域，细胞也有更多的可达性(第6组)。尽管有报道称iNKT细胞是自我反应的，但这些数据表明iNKT细胞在遇到一种强大的外源性糖脂抗原后，会大大改变它们的染色质结构。

我们还对αGalCer处理小鼠的iNKT细胞和未免疫小鼠的iNKT细胞进行了rna-seq检测。NKT基因表达FH与全脾iNKT细胞有很大差异(图1)。5D)或来自未受攻击小鼠的iNKT细胞亚群(如图所示)。5E和补充图。4C)。CD4差异表达基因的比较+ TFH和TH1个细胞29证明NKTFH共享一个与T更相似的表达式配置文件FH，但毫不奇怪，NKT 1细胞与T细胞相似。H1(附图。4D)。NKT的相似之处FH和TFHGSEA分析也显示。5F，顶板)。NKT的GSEAFH与NKT相比EFF显示CD8富集+NKT中T细胞效应相关基因的研究EFF(无花果)5F、底部、左侧和右侧面板)。两种抗原经验的子集都没有显着地丰富记忆细胞相关的特征。

由于NKT 1细胞在未免疫的C57BL/6J小鼠脾脏中的广泛存在6直接评估NKT 1、NKT 2和NKT 17亚群对抗原激活的iNKT细胞群的贡献是不可行的。为了解决它们的起源，我们利用了小鼠，在其中T-bet表达可以映射命运。30。而未免疫小鼠近90%的脾脏NKT 1细胞表达T-bet，而nkt的表达率仅为74%或更低。FH在第6天完成(图1)。5G)。值得注意的是，T-bet在NKT 2细胞中不表达。NKT中以前T-bet表达的降低FH最早于抗原后第3天观察(补充图)。4E)。因为在NKT中选择了以前的T-bet表达式FH这些数据表明NKT 2和/或NKT 17细胞参与了NKT。FH泳池。此外，命运图可能低估NKT 2和/或NKT 17转换为NKT的效率。FH在抗原激活后，一些iNKT细胞中可以诱导T-bet的表达，尽管我们没有证据表明这是发生的。除非少数民族人口大幅度扩大，并迅速、瞬间地转化为T-bet表达，否则，一些NKTFH可能也起源于流行的NKT 1细胞池。此外，我们注意到，尽管NKT 1细胞与NKT 1细胞分离，但我们发现NKT 1表达了一些NKT 1标志基因。FH(补充图。4D).

抗原攻击后效应功能增强

如图所示。5AαGalCer免疫小鼠未成为NKT的iNKT细胞(右柱)FH在未免疫的小鼠中，染色质的形态也与所有的亚群不同，与NKT 17细胞的差异最大。对RNA-seq数据的PCA分析表明，这些iNKT细胞的转录组与未免疫小鼠的iNKT细胞的转录组有很大差异(图1)。5D)。先前的分析表明，在I.V.之后。暴露于负载αGalCer(KLRG 1)的DC+INKT细胞在一个依赖转录因子Eomes表达的过程中发育，特别是在肺中。31,32。这种表型的细胞持续数周，表现出增强的效应功能。NKT富集基因的通路分析EFF在αGalCer之后的脾脏中，使用ConsensusPath数据库33，确定NK细胞介导的细胞毒性是最丰富的途径(补充图)。4F)。这与这些淋巴细胞的基因表达谱是一致的，这表明GSEA发现了一种增强的效应表型(如图所示)。5F)。有趣的是，NKT在某些关键位点的染色质可达性上有相似之处。EFF脾NK细胞，ATAC-seq峰在颗粒酶A、B、KLRG 1、CX3CR1和SPRY 2基因位点内增加，NK细胞也高表达SPRY 2。6A)。在NKT 1细胞中，与NK细胞功能相关的基因也有一些增加染色质可及性的区域，但这些区域在NKT中有更高的信号。EFF以及NK细胞。

验证NKT的存在EFF在人群中，我们评估了NK细胞标志物KLRG 1和CX3CR1在NKT中的表达和染色质的可及性。EFF(无花果)6A)。我们检测到这些标记在NKT上的表达增加。EFF与NKT相比FH以及未注射小鼠的iNKT细胞。6B)。T-bet命运映射分析显示，几乎所有的klrg 1+NKTEFF表达T-bet，表明这些细胞从NKT 1细胞分化而来，或在激活时获得表达T-bet(如图1所示)。5G)。为了确定我们观察到的表型变化是否保持不变，我们还分析了抗原暴露后30天或以后脾脏iNKT细胞的数量。带有NKT的iNKT细胞EFF表型仍然是iNKT细胞的很大一部分(图)。6C)。同样，NKTFH细胞在第30天以后也会在脾脏中持续存在(补充图)。4G)，与一份显示NKT高度的报告一致FHαGalCer和卵清蛋白脂质体治疗60天后34。这些数据表明，抗原攻击引起iNKT细胞表型的动态和长期变化，反映转录和染色质景观的变化。

INKT细胞有功能亚组，类似于CD4 T。H1，TH2，和TH17个细胞，以及其他几个淋巴细胞群体7，并已证实胸腺iNKT细胞亚群的染色质结构和转录结构是不同的。7,8,12。在这里，我们回答了三个问题。首先，基因程序在多大程度上驱动胸腺iNKT细胞亚群存在于外周iNKT细胞中？第二，考虑到iNKT细胞主要是非循环淋巴细胞。11在这些基因程序中，在不同组织中定位的印记是什么？第三，iNKT细胞基因程序在多大程度上受到抗原刺激后动态和长期变化的影响，因为这些变化可能暗示着经过训练的免疫或效应记忆反应？

我们的数据表明，在任何一个子集中染色质可达性和转录组的状态是相对相似的，无论位置如何。虽然这可能表明iNKT细胞已完全成熟，并致力于胸腺中的一个子集，并维持其在周围的地位，但基于诊断表面蛋白的表达，有证据表明iNKT细胞最近的胸腺迁移并不完全成熟。35,36,37。为了使这些事实一致，也许iNKT细胞亚群的表观基因组是在迁移之前在胸腺中建立的，但是成熟的、子集特异性的转录序列是在胸腺迁出后才开始的。对第0期、第1期和成熟NKT 1细胞的Atac-seq分析确定了在成熟NKT 1细胞中可以进入的区域，这些区域已经可在0期细胞中访问，为支持这一假设提供了一些证据38。或者，可能是最近的胸腺外移者没有完全分化，即使他们的染色质景观为功能亚组，而是接受组织特异性的提示，使细胞成熟成为类似于他们的胸腺的相应的效应子亚群。

尽管组织定位的印迹相对有限，但在肺iNKT细胞中，bZIP结构域转录因子(包括AP-1和ATF)和RHD(NF-κB)转录因子在可达染色质区域均表现出基序富集，而与其功能子集无关。这可能与肺iNKT细胞CTLA-4表达增加有关。这些数据与最近的一篇报道一致，该报告描述了类似的基因在肺mait和inkt细胞中的表达特征，尽管它也被认为符合组织居住模式。11。无论如何，肺信号不仅存在于iNKT细胞亚群中，而且还存在于NK细胞和γδT细胞中，甚至在一定程度上甚至在CD4中也存在。+T细胞与脾中相应的细胞类型相比较。肺泡CD8表观基因组的比较研究+常住记忆T细胞(Trm)发现肺间质间隙内的Trm细胞与脾Trm相比，在AP-1、fos和CREM基序中富集。39。在其他研究中，这种肺信号不仅仅是淋巴细胞特有的，与肺泡巨噬细胞的肺表基因组有一些相似之处。40。基于这些发现和目前的研究，肺微环境可能决定表观遗传重塑和随后的转录变化。一个潜在的重要因素是氧气浓度的增加。41,42同时，肺也可能面临更多外界物质和微生物的环境暴露。42。也许肺中的免疫细胞需要做好准备，以快速应对挑战。如果这是正确的，那么我们可以预测，iNKT细胞在皮肤或肠道等部位也可能有与胸腺、脾脏和肝脏不同的基因程序。与这一假设一致，我们发现iNKT细胞从SI-LPL中增加了CTLA-4的表达.此外，还发现来自皮肤和小肠引流淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结的iNKT细胞表达了许多肺信号基因，包括FOS, FosB，和Nr4a1，与胸腺和脾脏的比较37。需要更详细地研究iNKT细胞和不同抗原暴露组织中其他先天群体中所谓的肺激活特征。

在抗原暴露6天后，我们检测到两种不同的iNKT细胞群，一种是NKT。FH类似于TFH。以前，NKTFH本文从bcl-6的表达、几种关键的表面蛋白和T细胞辅助功能检测等方面进行了报道。27。在这里，我们证明了这个NKTFH种群有着截然不同的染色质景观和类似T的转录组。FH。这些细胞可能部分来源于NKT 1，这是脾脏的主要亚群，但也可能来自其他活化的亚群，考虑到先前T-bet表达减少的证据。此外，他们坚持至少30天后，抗原挑战。在以后的时间点，NKTFH维持产生白细胞介素-21的能力，但下调bcl-6的表达，增加CD62L和CCR 7的表达，这与记忆T一致。FH34。免疫检测结果表明，αGalcer复合物在体内表面与cd1d的半衰期小于24 h。43,44。考虑到这种半衰期，这些细胞不太可能最近接触到αGalCer。因此，抗原暴露后iNKT细胞的染色质重构导致iNKT细胞的持续存在，这将增强B细胞的辅助功能。

第二个人口叫NKTEFF更接近NK细胞。具有此表型的iNKT细胞也至少存在30天。以前，在注射抗原负载的dc后，肺部也出现了类似的群体。32，但这里我们展示了NKTEFF可以系统地在相同的抗原挑战下生成，这也会诱导NKT。FH人口。在其他实验中，有报道称iNKT细胞暴露于αGalCer后，在数周内都处于萎靡不振状态。45,46。在先前的工作中，我们没有发现inkt细胞总数中有无过敏的证据，因为在αgcer后30天，再被攻击的inkt细胞仍然是细胞毒性的，通过tcr有效地发出信号，并且与首次对αgalcer反应的inkT细胞相比，它的增殖增强了。47。然而，我们确实发现促炎细胞因子的产生减少了，这可以反映nkt的不同功能。FH可能产生的细胞和少数获得产生IL-10能力的iNKT细胞47。因此，免疫小鼠的iNKT细胞可能没有成为NKT。FH都是异种的，不仅包括NKTEFF但是IL-10的生产者，也许还有一些萎缩性细胞。更进一步，在KLRG 1的研究中+经抗原负载的DC诱导iNKT细胞后，这些细胞具有长期的抗肿瘤作用。32。NKT的大小EFF人口数量难以量化，因为KLRG 1+细胞只占一部分，其他细胞表达大量CX3CR1和颗粒酶(见图)。6B，d)。Tcr信号强度、协同刺激、细胞因子等方面对不同iNKT细胞群产生的贡献仍有待确定，但显然，用αGalcer脉冲dc是一种产生nkt的方法。EFF几乎完全在肺里32.

INKT细胞被归类为连接先天免疫系统和适应性免疫系统的类先天T淋巴细胞，在免疫应答的每个主要分支中共享细胞的组成部分。5。先天样细胞对抗原暴露表现出长期功能变化的能力被称为训练有素的免疫系统。48。INKT细胞是否表现出有效的记忆反应或一种经过训练的免疫？在稳态状态下，iNKT细胞具有组织内记忆细胞的一些特性.其中许多细胞表达典型的驻留记忆T细胞的分子特征，如CD 103和CD 69，并且像效应记忆细胞一样，它们在几小时内以依赖tcr或依赖细胞因子的方式产生细胞因子。9,11。然而，作为对αGalcer的响应，iNKT细胞会发生动态的长期变化，从而产生nkt。FH、NKTEFF群体，可能还有其他，表明一定程度的可塑性和异质性，使这些细胞能够适应其先前抗原刺激的历史，并在不同的环境中作出反应。