HERV在OC细胞株、卵巢肿瘤及周围组织中的表达
在一组OC细胞株和原发肿瘤细胞中，在RNA和蛋白质水平上都检测到了一系列的Herv元素(见图)。1、补充表1和2)。有趣的是，一些Herv包膜蛋白在SKOV 3中的表达超过了基础水平。CP卡铂耐药的OC细胞亚系和OvCa 236腹水来源的原代OC细胞(图1)。1A)。尤其是Herv-V1/V2蛋白的表达主要局限于肿瘤区。1B在健康组织和癌旁基质中检测到的情况要少得多(如图所示)。1B).
图1：HERV蛋白在卵巢癌中的表达。aERVWE1(Syncytin 1)、ERVFRD-1(Syncytin 2)、Herv-V1/V2、ERVMER 34-1和erv 3-1在SKOV 3中表达。威汤哥卵巢癌细胞系值得注意的是，在卡铂耐药的sKOV 3中CP在亚系中，这些包膜蛋白明显过表达，与高耐药的HERV表达密切相关。从高浓度卡铂治疗的卵巢癌中分离出的腹水细胞对Herv-V1/V2包膜蛋白具有高度的阳性表达。b在上皮性卵巢癌组织石蜡切片中，Herv-V1/V2的表达主要局限于肿瘤部位。肿瘤基质组织低，正常卵巢组织几乎不存在(IHC分析，放大倍数×20)。结果代表n=10个分析样本。
这些逆转录病毒元件在可化学耐药癌细胞中被过度表达，这一事实提供了第一个提示，即它们也可能容易受到hdacis的化学激活，hda cis是人类基因组整合的逆转录病毒(如hiv)的lra。27.
HDACis是HDACis的强抑制子。Herv-V1/V2转录
根据上述假设，我们研究了HDACis在驱动Herv转录，特别是编码包膜蛋白的基因转录中的作用。为此，我们试探性地选择了罗必新和伏罗诺特，这两种治疗药物目前正在临床上使用，并且已知是抗艾滋病病毒的抗潜伏期药物。他们的IC50在不同的OC细胞株和从OC腹水中分离出的原代细胞中测定72h以上的值。2A，补充图。1)。在浓度分别为4nm和1.5M的条件下，romidepsin和vorinostat具有较高的细胞毒性。这些值在以后的所有生物实验中都有参考价值。
图2：HDACis和TLR7as对卵巢癌细胞的细胞毒性和相互作用。aHDACisvorinostat和romidepsin在SKOV 3中的细胞毒性威汤哥药物作用72h后，用MTT法检测OvCa 236原发卵巢癌细胞的增殖情况。伏氏菌素和罗米脱素对卵巢癌细胞具有很强的细胞毒作用(IC)。50~4 nm)。b用IC法检测了mimiquimod和vesatolimod的TLR 7as和hdac在这些癌细胞类型中的细胞毒性。50在随后的所有生化实验中，这些值被用作参考值。图是n=5项实验。cSKOV 3中HDACi/TLR7a相互作用的等效学分析威汤哥OvCa 236原发于腹水中的卵巢癌细胞。HDACis和TLR7as的结合会产生协同效应，而不考虑配对(绿色箭头)。结果代表n=5项实验。
使用集成电路的分数50值，我们分析了一组Herv元件的转录激活(补充表)。1)药物暴露24h后。我们的hdac发现一些herv基因被我们的hdac有效地抑制(激活)。Herv-V1/V2暴露后转录活性比其他分析的HERV更强。这一效应在几乎所有癌细胞中都是一致的，我们观察了这些细胞(补充图)。2).
鉴于某些HERV可被HDACi转录激活，我们询问这种效应是否可以与SAK类似，以两种方式诱导选择性癌细胞死亡：迫使HERV包膜蛋白在细胞膜上表达，并以特定的抗体或CART系统作为靶点；第二，通过TLR 7/8受体的放大作用来激发细胞自身的天然免疫应答。TLR 7/8受体识别病毒的特征。因此我们决定50目前临床使用的TLR 7/8AS，imiquimod和vesatolimod(图1)。2B，补充图。3A)。与HDACis相比，两种药物对癌细胞的细胞毒性均较小，且具有IC效应。50每种情况下大约有40毫米。
HDACis和TLR 7/8AS对OC细胞和原代肿瘤细胞的协同杀伤作用
为了初步了解HDACis和TLR 7/8AS对OC细胞和原发肿瘤细胞的双向杀伤活性，我们对两种药物进行了等效学分析(图1)。2C，补充图。3B)。我们的等压线图显示，‘HDACi和TLR7/8a联合治疗’(HTCT)总是产生协同的细胞毒性效应，而不管这两种物质是如何结合的。更重要的是，HTCT对SKOV 3有协同的细胞毒性作用。CP亚系，这是高度耐卡铂(补充图。3C).
Htct是一种有效的、选择性的内源性凋亡诱导剂。
我们对OC细胞凋亡途径的研究表明，hdac与TLR 7/8AS之间的协同细胞毒性作用，特别是通过检测caspase 9的断裂，可以特异性地触发细胞内的凋亡。此外，bcl-xl等抗凋亡执行者在蛋白水平上被下调，从而有利于凋亡过程。28(无花果)3A、补充图。4和5).
图3：HTCT诱导选择性内源性凋亡。aSKOV 3孵育后威汤哥OvCa 236细胞与1×IC50在HDACi、TLR7a及其组合作用24h后，采用Western blotting分析凋亡介导因子，揭示Caspase 3和Caspase 9等中央凋亡途径介导因子的断裂，后者是内源性凋亡途径的决定因素。在一致条件下，HTCT后PARP的特异性断裂强调了两种物质组间相互作用的特异性。抗凋亡蛋白Bcl-XL被HTCT下调，但不受个别药物的抑制.bC-PARP在SKOV 3中主要被检测到(ICC)。威汤哥罗非司酮和维生莫德联合孵育细胞，但不能单独与维萨罗莫(0.5×IC)共同孵育。50)。放大倍数×40cPARP裂解的FACS分析表明，细胞凋亡是由HTCT引起的，而不是由单个药物引起的。等型：灰色，样品：绿色。结果代表n≥3实验。
此外，用ICC、FACS和WB对SKOV 3进行免疫化学分析。威汤哥原代OC细胞显示HTCT可导致广泛的PARP(Poly-ADP核糖聚合酶)裂解。3A-c、补充图。4和5)。在静涡器和imiquimod处理的sKOV 3中观察到caspase 3和prp的剂量依赖性表达。威汤哥细胞(附图)6A)。细胞凋亡水平在细胞群中是相同的，细胞群仍然附着在培养表面上，在分离的流动群体中也是一样的(附图)。6B)。有趣的是，HTCT对正常人外周血单个核细胞的凋亡没有协同作用(补充图)。6C).
HTCT对Herv-V1/V2蛋白合成的影响
HTCT具有很强的协同作用，这与FACS和Westernblot分析显示OC细胞中Herv-V1/V2蛋白的减少有关(附图)。7a，b)。因此，药物组合引起的Herv-V1/V2蛋白水平的降低可能与细胞死亡有关，如果我们假设剩余的附连种群正在向凋亡的方向发展，就像ICC分析所判断的那样(如图所示)。3B)。HDACis对蛋白质合成的影响与该基因在转录水平上的上调无关(补充图)。8).
T LR7和Herv-V1/V2CRISPR/Cas9基因消融显著降低细胞凋亡
为了确定所观察到的促凋亡作用是否是通过tLR 7逆转录病毒RNA信号介导的，我们将两者分别消融。TLR 7和Herv-V1/V2在SKOV 3中威汤哥细胞使用CRISPR/Cas9，不选择烧蚀种群(附图)。9和10)。基因消融以TLR 7为靶点(MN_016562.4，附图)。9A)或Herv-V1(NM_152473.2，附图)。10A)使用IDT工具设计的特定gRNA(Https://eu.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM)并与整个人类基因组对照，使用基本的局部比对搜索工具(BLAST)确定开/非目标。T7消化和qPCR证实消融效果。9B，c和10b，c)。此外，还检测了Herv-V1/V2在野生型细胞和KO细胞中的比较蛋白表达(附图)。10d)。在SKOV 3中Herv-V1/V2KO与野生型细胞相比，HDACis暴露后，HDACI细胞的HDAC 1/V2的表达比野生型细胞低约50%(补充图)。11A).
如上文所示，HTCT可诱导多个细胞系统发生强烈的凋亡反应。相反，SKOV 3细胞凋亡TLR7KO由PARP切割决定的细胞明显不明显(见图)。4A，b)，表明TLR 7是治疗后细胞死亡的关键介质。与TLR 7类似，我们在Herv-V1/V2基因敲除培养中发现凋亡细胞减少了50%，表明这些基因的产物确实是凋亡的媒介。4C-E)。一次微观调查证实了SKOV 3Herv-V1/V2KO亚线对罗必新/维索莫德联合治疗不敏感(补充图)。11B).
图4：TLR 7和Herv-V1/V2是HTCT诱导细胞凋亡的直接介导因子.aCRISPR/Cas9消融TLR 7对HTCT诱导的SKOV 3细胞凋亡有抑制作用，提示TLR 7介导了SKOV 3细胞凋亡(PARP裂解FACS检测)。等型：灰色，样品：绿色。bWesternblot分析c-PARP，显示同样的效果。cHerv-V1/V2消融揭示了Herv-V1/V2作为TLR 7底物的基因产物(流式细胞术测定AnnexinV)；*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 (paired Student’s t试验的；双尾的)d与未烧蚀的亲本细胞相比，Herv-V1/V2-烧蚀的SKOV 3细胞对HTCT诱导的细胞凋亡不太敏感。eSKOV 3细胞凋亡减少约36%。Herv-V1/V2KO细胞(PARP裂解的FACS分析)。等型：灰色，样品：绿色。结果代表n≥3实验。
术后凋亡细胞显著减少TLR 7和Herv-V1/V2基因消融证实了这些元素参与了HTCT介导的细胞死亡，并提出了SAK概念在癌症治疗中的可能外推法。
其他赫夫元素也会加入Sak效应吗？
通过剂量依赖性研究，我们观察到赫夫-V1看起来比截断的HDACis更可激活。赫夫-V2表格(图)5A)。虽然我们已经确定Herv-V1/V2基因产物作为TLR 7的底物，随后的qPCR分析暗示HDACi处理可以进一步抑制OC细胞中的Herv元素(补充图)。2)。为了详细研究这个问题，并找出其他herv的可能贡献，我们在sKOv 3中执行了一个芯片seq。威汤哥细胞暴露于松香素和伏氏剂中。通过对治疗后组蛋白3(H3)乙酰化模式的分析，我们认为H3AcK9是染色质免疫沉淀(补充图)最合适的选择。12和13).
图5：SKOV 3中HDACi处理后的芯片-seq分析威汤哥.a剂量依赖性激活Herv-V1/V2SKOV 3基因威汤哥不同IC暴露细胞50HDACi组分24 h。b这个赫夫-V2位点(chr 19：53044740-53051680)由一个栗色箭头突出显示，以及编码EnvV 2蛋白的mRNA。推测的LTR序列以桃色突出。还显示了EnvV 2编码序列(CDS)，注释了表面(SU)和跨膜(TM)亚基：疏水信号肽(SP)、参与SU和TM相互作用的CWIC基序(Consensus：CXXC)、RKQR呋喃裂解位点(Consension：RXKR)、融合肽(FP)、假定的免疫抑制域(ISD)和跨膜结构域(TMD)。LTR和非LTR反转录转座子二次积分分别用白色箭头和灰色箭头突出显示.给出了HDACi处理前后共定位差异峰的位置.启动子(1145-1434)和近端增强子(1588-1751和2265-2490)类似于ENCODE所预测的候选顺式调控元件的整个染色体区域。
为了检测HDACis处理后HDACis位点的乙酰化水平并评估其变异程度，将3280个HERV基因座的单声带基因组坐标与芯片-seq分析确定的H3AcK9峰的位置进行了比较(补充图)。14，补充数据1)。总体而言，在未经处理的细胞中，约0.7%的峰值对应于1233个单独的Herv位点(占整个数据集的37.6%)，HDACis处理后，共定位峰的数量增加了2.3~2.5倍，从48%到60%映射到HERV基因座的一个百分比(补充图)。14)。第一个分析证实，HDACis能够调节重复元件的乙酰化，包括Herv序列。随后，我们只考虑了差异峰(差异峰)，即在使用VOXINSTAT和(或)ROMIDESIN处理后出现显着变化的峰。有趣的是，即使HDACi治疗后半数以上的herv位点与乙酰化峰共同定位，也只有少数位点(0.9%-1.9%)与不同峰共同定位，主要表现为乙酰化水平的降低(补充图)。14，补充数据1)。此外，不同的HDAC暴露导致不同的Herv基因座乙酰化的不同子集的变化，即使有一定比例的Herv序列(21/82)在两种处理中都是共同的(补充图)。14)。异峰共定位的Herv基因座可分为24个Herv群，其中包括ERV-V2轨迹(附图)14).
然后，我们重点研究了11个hherv基因座，它们与不同的峰共同定位，显示乙酰化水平增加，因此表明hda ci治疗后转录激活增加(表)。1)。值得注意的是，对应于ERV-V2在所有样本中都确定了位点，并且在VOINSTAT和ROMIDESIN治疗中最显著地上调了位点(表)。1，补充图。14)。这在一定程度上得到了不同OC细胞芯片-qPCR的证实(补充图)。15，补充表3)。旁边ERV-V2，只有HML 8位点2q11.2处的序列显示，所有处理样品的乙酰化水平都有所提高，与使用的HDAC无关，但具有较低的统计学意义(表)1，补充数据1)。鉴于ERV-V2位点显示HDACi刺激后乙酰化水平明显升高，我们评估了其逆转录病毒结构中差异峰的位置，并与未处理对照的相应峰进行了比较(图一)。5B)。分析表明，HDACis的治疗不仅可以解释ERV-V2乙酰化，同时也导致乙酰化峰在5‘区的转移和浓缩。这一观察使我们可以假设HDACi治疗不仅可以增加ERV-V2转录激活，但也改变其表达模式，可能有利于herv特异性启动子活动ERV-V2Ltr或上游孤立的LTR 43元件，最终导致选择性剪接(图1)。5B)。这一方案也是支持的存在启动子和近端增强子样签名，是与HDACI相关的差异峰共线。
表1 HERV位点与不同峰共定位，表明HDACi处理后乙酰化程度增加。 TRL 7信号通路研究证实SAK在癌细胞中的作用机制
TLR 7通过募集MyD 88适配蛋白来传递信号，而后者又通过一系列的转导序列与转录因子(TF)NFκB通讯。NFκB有助于启动大量表达在炎症网络、细胞存活和分化中的基因的转录，并且它在癌症中也被发现上调。29。我们观察到HTCT导致了这一通路的功能破坏(如图所示)。6A)。我们用两种药物同时培养不同的癌细胞(0.5×IC)。50研究了关键传感器的RNA和蛋白质水平是如何受到影响的。TLR 7作为该通路的第一分子，其转录不受HTCT的影响(图1)。6B)。相反，MyD 88的蛋白质合成被选择性地削弱，提示这种传感器的下游信号开关被破坏(图1)。6A、c、补充表4).
图6：HDACi和TLR7a对OC细胞TRL 7信号的影响。aHtct影响OC细胞株SKOV 3中TLR 7下游的信号，直到最后的效应因子NFκB。威汤哥和OvCar3威汤哥。MyD 88和NFκB蛋白的合成受到选择性抑制。注意激酶IKBα的低磷化，它负责转录因子NFκB的降解。bHDACis、TLR 7/8AS及其组合对SKOV 3中TLR 7转录本的影响威汤哥细胞(QPCR)。联合治疗可上调TLR 7转录本。cHTCT对SKOV 3 mRNA水平TLR 7信号的影响威汤哥细胞。d药物孵育使NFκB失活后P 105磷酸化降低，用含有NFκB的NanoLuc法测定，并用肿瘤坏死因子α刺激这两种细胞系，扩增系统信号。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 (paired Student’s t试验的；双尾的)e对炎症信号的影响：SKOV 3中一组炎症介质的转录水平威汤哥单药治疗不同，但与HTCT非常相似。而干扰素ɣ和肿瘤坏死因子α均显著升高。结果代表n≥3实验。
考虑到sarm1被认为是TLR 7的一种适配蛋白。30我们研究了其在TLR 7下游信号转导中的作用，以及在HTCT诱导细胞凋亡中的作用。为了解决这个问题，我们在SKOV 3中使用CRISPR/Cas9烧蚀了Sarm1。威汤哥细胞，与罗非司酮和维索莫德同时孵育(1×IC)50用c-PARP作为细胞死亡的前哨，检测细胞凋亡。虽然HTCT后Sarm1蛋白呈下降趋势，但消融细胞与正常细胞凋亡无显着性差异(附图)。16)，表示Sarm1不太可能作为TLR 7适配器在该细胞系中发挥作用。
罗非司酮/维萨托莫联合治疗后，未消化的NFκB1(p 105形式)的蛋白质合成减少，提示I-κBα是低磷化的，NF-κB/I-κBα复合物不解离，NFκB1不转录，免疫技术证实了这一作用(图1)。6A)。这意味着，在治疗后，标准转录因子NFκB1的全长形式不能进入细胞核并发挥其作为TF的作用，这一点得到了荧光素酶系统的证实，该系统含有该TF的一致序列，并与萤火虫荧光素酶作为报告者结合在一起(图1)。6d)。我们的实验证实，NFκB即使在TNFα刺激下也没有功能，因此不能启动部分受其控制的基因的转录，包括NFκB本身的基因。一个关键的NFκB靶基因是bcl-xl。31，在HTCT后的蛋白质水平上有选择性的降低(见图)。3)，证实这种转录因子被破坏。IL8的影响似乎较小，因为在OvaCar3和OvCa 2810的HTCT影响下，其转录受到下调，而在SKOV 3中则较少。威汤哥。我们在OvarCa 3和OvCa 2810中观察到的是轴的一种补偿性的均匀度行为：IL下调与CXCR 1上调(补充图1)。17)。IL 8是一种杂乱无章的白细胞介素，因为它能够连接几种趋化因子受体，其中最突出的是CXCR 1，其次是CXCR 2。IL8在包括OC在内的几种癌症类型中都是上调的，并且受到NFκB和其他TFs的转录调控。32.
我们还研究了htct对sKOV 3中rna水平的炎症信号的影响。威汤哥，它们也依赖于NFκB.如图所示。6E，某些炎症介质的表达谱在这两种组合中非常相似，但在单独使用药物时却有所不同(补充表)4)。而干扰素ɣ和肿瘤坏死因子α在所有病例中均明显升高。这些炎症因子也被分析了部分体外使用PBMC从健康人(补充图)。18).
HTCT干扰其他信号转导途径
为了进一步阐明HTCT诱导凋亡反应的机制，我们研究了Akt/PKB和RAS-MEK-ERK等典型信号转导途径在不同的OC细胞株中的作用。这些通路与NF-κB信号紧密相连，例如，i-κBα被已知是通过Akt/pkb磷酸化的。33,34.
Westernblot分析显示，所有药物组合均在蛋白水平上降低了存活蛋白Akt，并完全抑制其磷酸化形式，而单用亚胺喹莫德诱导其过度磷酸化(图一)。7A、补充图。19和20)。β-catenin和c-Myc的去磷酸化和磷酸化形式在蛋白水平上被下调，类似于Akt。所有分析的HTCT都完全破坏了Akt的激活。
图7：HTCT阻断AKT/PKB和RAS-MEK-ERK信号转导通路.aIKBα(见图1.6)通过Akt/PKB传感器磷酸化，在SKOV 3中被HTCT破坏。威汤哥OvCa 236癌细胞。注意MEK-ERK换能器的选择性低磷化稳态.这两种级联的蛋白合成受单一药物及其组合的影响，特别是Akt/PKB通路的某些元素。这些传感器之间的磷酸盐交换被全球破坏。b概述TLR 7-NFκB、Akt/PKB和RAS-MEK-ERK级联的全球破坏点，用于HDACis、TLR 7/8AS及其在OC细胞中的组合(用BioRender.com创建)。Westernblot结果代表了从腹水中分离出的卵巢癌细胞株和原发细胞的几个实验结果。
正如以前的工作所报告的，一些herv与ras-mek-erk的激活有关。35我们研究了HTCT对这一途径的影响。事实上，在这一梯级中出现了一种破坏。ERK 1/2和MEK 1/2蛋白水平在HDACis处理后均未降低，但磷酸化形式消失，而TLR 7受体激动剂则相反。在癌细胞中，MyD 88构成抑制MEK 1/2上MKP 3磷酸酶的活性，从而导致MEK 1/2的激活。我们发现MKP 3蛋白的表达不受任何药物干预的影响。由于MyD 88被每个HTCT下调，我们预计MEK 1/2将被去磷酸化。然而，HDACi处理下下游转导子的去磷酸化表明，除了MyD 88和MKPs之间的相互作用外，还有其他机制起着作用。图形7b描述了TLR 7-NFκB、Akt/PKB和RAS-MEK-ERK在OC细胞中的整体断裂点.
SKOV 3的协同抗癌活性威汤哥异种移植小鼠模型
SKOV 3细胞株威汤哥和OvCar3威汤哥异种移植nu/nu小鼠产生高分化腺癌。我们研究了罗非司酮和维索莫德单独或联合应用对SKOV 3肿瘤生长和转移的影响。威汤哥异种移植小鼠模型8)。经四轮治疗后观察到明显的抗肿瘤作用。罗非司酮和维索莫德单独使用时会产生抗肿瘤作用，但它们的组合反映了我们在体外实验中看到的协同效应(图一)。8A)。该组合对SKOV 3的定植也有影响。威汤哥肺细胞(图1.8B)，反映了皮下植入肿瘤细胞时所观察到的抗肿瘤作用。
图8：NMRI nu/nu小鼠移植性卵巢癌模型。a荷瘤雌性NMRI裸鼠4次腹腔注射，剂量分别为1mg/kg和5mg/kg，剂量分别为1mg/kg和5mg/kg。计算并绘制肿瘤体积图。罗非司酮和维萨托莫单独显示出温和的抗肿瘤活性，这取决于肿瘤的大小。然而，当它们结合在一起时，其抗肿瘤活性明显增强。b在扩散模型中，细胞接种3d后，按上述方法治疗小鼠，HE染色检测肺组织。在htCT下，与单药治疗相比，肺部定植明显减少.cOvCar3威汤哥用亚治疗剂量(分别为0.5 mg/kg和2.5mg/kg)处理异种移植瘤模型，用qPCR方法检测残余肿瘤中Herv-V1/V2的表达，并将结果与体外研究结果进行比较。dOvCar3中Herv-V1/V2的民建联染色IHC威汤哥残余肿瘤。观察到这些逆转录病毒蛋白的表达减少。图是n=3项实验。
我们还观察了htct对ovcar3细胞的htct对herv-v2 mRNA和蛋白水平的影响。威汤哥并将剩余的肿瘤块置于qPCR和IHC：Herv-V2 mRNA和蛋白水平上，反映了罗非司-维萨莫德联合治疗后的体外效应(图一)。8C)，而单用Vasatolimod有明显的减少作用(图1)。8D).
