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体细胞突变和单细胞转录谱揭示了恶性横纹肌样肿瘤的根源。

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发表时间:2021-03-08 11:54作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

恶性横纹肌样瘤(MRT)是一种常致死性的儿童癌症,与许多儿科肿瘤一样,被认为是由异常的胎儿发育引起的。MRT的胚胎根和分化途径尚未确定。在此,我们结合系统发育分析和单细胞mRNA研究,研究了MRT的起源。比较肿瘤与周围正常组织之间的体细胞突变,MRT与神经嵴来源的雪旺细胞成线性关系。我们通过逆转MRT的基因驱动突变来检测MRT分化的单细胞mRNA读数,SMARCB 1细胞丢失,提示细胞在向间充质分化的过程中被阻断。定量转录预测表明,HDAC和mTOR的联合抑制模拟MRT的分化,我们实验证实了这一点。我们的研究定义了MRT的发育障碍,并揭示了潜在的分化疗法。

导言

恶性横纹肌样肿瘤(MRT)是一种主要影响婴儿的软组织肿瘤。尽管MRT可能出现在身体的任何部分,但MRT通常在肾脏和大脑中单独或同步形成(在那里被称为非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤(AT/RT))。MRT,尤其是转移性MRT,仍然是儿童最致命的癌症之一,即使经过密集的多式治疗也是如此。MRT的唯一驱动因素是编码基因发生双等位突变。SMARCB 1(INI 1,95%的案件)或SMARCA 4(BRG 1,5%病例),开关/蔗糖非发酵(SWI/snf)染色质重塑复合物的核心亚基。1,2,3。在大约三分之一的病例中,其中一种变体存在于生殖细胞株中,从而导致了儿童MRT的发展。4.

像大多数儿童癌症一样5,mrt被认为是在胚胎发生过程中出现的,这一概念最近在小鼠模型的研究中得到证实。SMARCB 1损失。横纹肌样肿瘤,尽管大多数是AT/RT,但只有在以下情况下才发生。SMARCB 1在早期胚胎发生过程中被灭活,但在胎儿后期或成年动物中没有激活。肾MRT从未被观察到。6。对大量和最近的单细胞转录体的分析表明,mrt保留了具有神经和间充质信号的整个胎儿转录体。7,8,9,10。这些发现表明,横纹肌样肿瘤的一个合理来源是外胚层衍生的神经嵴,它独特地能够产生跨越胚层、中胚层和外胚层边界的细胞类型。

MRT的胎儿起源可能通过促进MRT沿发育途径的分化而被利用。随着高通量单细胞检测的出现,设计儿童癌症的分化治疗方法的可能性最近得到了重视。5,10,11,12。单细胞转录读数能够精确、全面和定量地比较癌细胞与支持正常细胞发育的转录变化,从而潜在地揭示促进细胞成熟的治疗途径。

在这里,我们定义了MRT的发展根源,揭示了分化治疗的机会,结合肿瘤及其周围正常组织的系统发育分析,单细胞mRNA读数,以及在患者来源的MRT器官中的微扰实验。

结果

恶性横纹肌样肿瘤与神经嵴来源组织有系统关系。

我们研究的出发点是MRT的系统发育分析,以确定MRT的起源是否在人类的神经嵴。我们以前已经证明,通过体细胞突变在不同组织间的分布来重建儿童肿瘤和正常组织之间的发育关系是可行的。13。将这些原则应用于MRT,我们用DNA全基因组测序(WGS)研究了两例MRT及相应的正常组织。

首先,我们检查了一个儿童的组织表现,最常见的颅外横纹肌样肿瘤,肾MRT。这孩子携带了一种致病性细菌。SMARCB 1突变。我们做了肿瘤WGS手术(n(2)血细胞、肾实质和肾门组织(n=2)(图2。1A,补充表1)。使用已建立的变量调用管道13,14,15,16我们测定了每一组织中的体细胞变异,由此我们得出了肿瘤与正常组织之间的系统发育关系。通过组织学检查和通过混合模型(“方法”切片)进行定量评估,探讨了观察肿瘤污染所致共同突变的可能性。在第一个病例中的关键发现是肿瘤的一些,但不是所有的体细胞突变,存在于肝门组织,被神经节细胞和雪旺细胞所占据。1A,b,补充图。1)。这两种细胞类型都来源于神经嵴。然而,肿瘤与血液或肾实质之间没有共同的体细胞突变,这是普遍存在的早期胚胎突变(图一)。1A,补充图。1)。这些发现使MRT与雪旺细胞(远离中胚层血和肾实质系)形成了一个外胚层,神经嵴来源的谱系。

图1:MRT与神经嵴来源的雪旺细胞密切相关.

A代表肾脏MRT与正常组织的体细胞遗传关系的系统发育树。百分比:组织中克隆体的大小。圈内数字:簇内突变负担。红色或白色矩形:SMARCB 1突变状态(红色=突变型;白色=野生型)。陆恭蕙:杂合性丧失。H&E(B)活组织检查和INI 1染色(C)免疫染色,显示肺门组织INI 1阴性雪旺细胞2.鳞条=100 m。D两个独立供体正常神经鞘雪旺细胞INI 1阳性染色模式。标尺=100公厘。E系统发育树,代表硬膜外(脊髓)MRT与正常组织的体细胞遗传关系。突变的胚胎簇表示(a-d)。否则注释如下A。H&E染色(F),不同突变簇的克隆大小(a-d,G)和INI 1免疫染色(H)背神经根、腹神经根、肿瘤和(I)同一供体的骨髓。后者显示INI 1染色阳性。标尺=100公厘。

我们更仔细地检查肿瘤和肝门组织之间的共同突变,发现一个主要由神经节细胞占据的肝门活检组织只分享了少数(n第二个变异体由雪旺细胞组成,与肿瘤共有175个突变(图1)。1A,b,补充数据1)包括拷贝数-中性杂合性损失SMARCB 1(补充图。2)。为了验证这一发现,我们对SMARCB 1蛋白质,INI 1(图1)。1C)。根据突变分布的预测,第一次肝门活检仅显示间断性的INI 1阴性细胞,与杂合子生殖系突变一致。SMARCB 1。相反,第二次肝门活检的雪旺细胞,其INI 1的染色应该是广泛而强烈的(图一)。1D),未见INI 1染色。1C),与…的双等位基因丢失相一致。SMARCB 1从这个组织的体细胞基因组中预测。

接下来,我们检查了一名死于颈椎MRT的儿童死后的组织。肿瘤体积位于硬膜外间隙腹侧。这孩子没有带病菌。SMARCB 1突变。无早期马赛克(即血液中)变异影响SMARCB 1是在这个病人身上发现的。我们研究了肿瘤组织和9种正常组织:皮肤(n=2),脂肪(n=2),肌肉(n血、背根和腹神经根(图2)。1E,补充表1)。通过和以前一样的分析,我们发现肿瘤在躯体上与神经根部的雪旺细胞有关(如图所示)。1E,f,补充图。1,补充数据1),但不适用于任何其他正常组织。这种系统发育关系的克隆组成是复杂的。根据变异的等位基因频率和突变的分布,我们能够识别四个克隆(图)。1g),其中两个在雪旺细胞和肿瘤之间共有。此外,肿瘤和雪旺细胞各有一个单独的克隆体,暗示了肿瘤和雪旺细胞在亚克隆多样化方面的持续潜力。对拷贝数变异体(CNVS)的分析显示,SMARCB 1肿瘤和神经根。1E,补充图。2,补充数据1),再一次通过INI 1染色进行验证。INI 1阴性雪旺细胞较多见于腹根,与此组织中较大的克隆大小一致(~40%比20%)。1H,I)。综上所述,这些观察提供了迄今为止最直接的证据,证明人类MRT与神经嵴谱系密切相关,并坚定地将其起源于胎儿生命。

SMARCB 1重建驱动MRT分化

为了建立MRT在神经嵴发育过程中的分化阶段,我们研究了扭转MRT丧失的后果。SMARCB 1,MRT的主要遗传驱动因子。作为MRT的模型,我们利用病人源性的mrt细胞器,这些细胞器被证明忠实地再现了原发性mrt组织的遗传、转录和表观遗传特征。17。我们重组SMARCB 1三种MRT类细胞器培养物的表达17(60T、78T和103 T;补充表2)通过慢病毒转导与对照或SMARCB 1表达质粒2A,补充图。3A)。MRT细胞器DNA甲基化谱与原发MRT组织相似,与SMARCB 1现况(附图3B)。重建SMARCB 1在所有MRT培养中,表达均导致增殖停止(附图)。3C)细胞的形态转化(图1。2B,补充图。4A,c)。60T和103 T均由葡萄样向神经样或成纤维细胞样形态转变,细胞体突起较长,78T细胞停止增殖,形态无明显变化。为了评估这些表型变化所依据的转录特征,我们进行了器官培养,包括不培养和不培养。SMARCB 1重新表达,到单细胞mRNA测序(10×基因组铬平台,n=16,133个细胞过滤后)。单细胞转录产物产生的细胞周期图谱证实了SMARCB 1,78T显示出最小的渗透效应(附图)。三维空间)。UMAP聚类显示,正如预期的那样,MRT单个细胞的大多数转录变异可以由供体解释,因为细胞首先由病人分离(补充图)。3E)。经转导后,大多数细胞表达SMARCB 1分离成独立的细胞簇为每个病人线(图)。2C,补充图。5A-C)。这种分离不能用单个培养物的批处理效应来解释,因为未成功的转导细胞与来自于对照质粒的细胞共聚在一起(补充图)。3F)。我们的系统发育分析显示,MRT是由神经嵴衍生的。1),我们随后评估了MRT细胞与非MRT细胞的相似性。SMARCB 1小鼠神经嵴发育中单细胞信号的再表达18Logistic回归12(无花果)2A)。在基线(即否)SMARCB 1MRT类细胞器转录序列主要类似间充质细胞和神经细胞。二维,补充图第三代),如先前所示7,8,10。此外,每个患者线显示不同的神经嵴分化阶段的信号(图)。二维空间,补充图。第三代)。患者细胞系60T和103 T主要类似间充质细胞,而78T表现出更多的神经信号。检查细胞mRNA谱SMARCB 1重组后,MRT细胞始终表现出较高分化。也就是说,随着与大多数神经嵴细胞类型的相似性增加,它们更像正常的同类细胞(图1)。二维空间,补充图。第三代)。对细胞类型相似性的进一步评估表明:SMARCB 1重组促进神经向间质的转换,这是一致的三种MRT类培养(图一)。2E)。这些结果用第二个独立的小鼠早期神经和间充质细胞类型的单细胞mrna参考值进行了验证。19(补充图。3H)。神经嵴分化基因分析显示间充质标记显著上调。2B,f,g,补充图。4B-d,补充数据2)。对每个单细胞簇分别进行额外的细胞分型,以评估细胞器内异质性(补充图)。5A-f,补充数据2),表明单细胞簇表现出可变的神经嵴分化信号。然而,SMARCB 1+簇持续诱导间充质分化信号的相对增益,除较小的团簇60T_S2外,后者保留了较多的神经同一性。总之,我们的发现将MRT置于神经嵴向主要间充质转化的发展轨迹上,这是由SMARCB 1重建。

图2:SMARCB 1重建推动MRT分化。

A示意图表示法SMARCB 1与胎鼠神经管和神经嵴细胞类型比较,患者来源的MRT细胞器的重建和随后的单细胞转录组比较。分枝树代表小鼠神经嵴的分化轨迹。表示缩写。BMRT对照(C)和SMARCB1+(S)类有机物白色:DAPI(细胞核),红色:phalloidin(膜),绿色:MMP 2(间充质标记)。标尺等于50m。CMRT控制单细胞的UMAP表示(灰色)或SMARCB 1+(绿色)细胞器线(60T控制/SMARCB 1+:8059/425细胞,78T控制SMARCB 1+:3195/806细胞,103 T控制SMARCB1+:2694/953细胞)。D点图表示MRT控制(圆圈)或SMARCB 1+(正方形)细胞至神经嵴分化轨迹。颜色表示MRT细胞与所指示的神经嵴细胞类型相似的平均概率(用Logistic回归估计的预测相似性评分)。12)。控制和控制之间相似性评分的变化SMARCB 1+细胞被评估为细胞类型,平均相似性评分>0.5。P值是使用未配对学生的t测试(双尾):*<1e−3,**<1e−9,*<1e−15(−log 10)p值:60TD=45,S=27,M2=66,ME=3.7;78Tnt=9,D=54,M1=14,S=22,M2=4.4;103 TD=198,EM=40,S=7.8,M2=314,ME=3.2)。E叠加条形图表示mrt控件(−)和SMARCB1+(+)细胞器,显示神经向间充质信号的一致转换。每个单元格的类型注释都是根据最高的相似性评分分配的。颜色表示神经嵴细胞类型,如图所示。2A。细胞型迁移因子2(M2)根据相似度最高分为迁移间充质(ME(M2))或迁移自主神经(A(M2))。比较对照组与对照组间充质/自主神经(ME/A)分支的相对频率。SMARCB 1+每条病人线的器官。P值用卡方检验计算:*<0.01,*<1e−15(p值:60T=0.0048;78T=4.9e−48;103 T=1.0E−32)。F点图显示间充质标记的表达水平(Exp)。MMP 2用于MRT控制(−)和SMARCB1+(+)器官,每条病人线。从灰色到红色的颜色代码是指平均颜色。MMP 2转录水平(唯一的分子标识符(UMI))。点大小是指显示的单元格百分比(Pct)。MMP 2表情。GMRT控制基因模块分数的方格图表示(灰色)和SMARCB 1+(绿色)单细胞(n=60T控制/SMARCB 1+:8059/425细胞;78T控制细胞/SMARCB 1+:3195/806细胞;103 T控制细胞/SMARCB 1+:2694/953细胞),显示间充质/自主神经分化基因持续上调SMARCB1+细胞。方框图表示中间线(中线)、25百分位数和75百分位数(方框)。晶须代表的范围,不包括离群点(点)。模块评分由平均每组基因的基因表达水平产生。基因集包括感官(S)或间充质/自主神经(ME/A)分化分支的标记基因,区分早期和晚期分化基因。通过对照和对照评估模块得分。SMARCB1+细胞。P值是使用未配对学生的t测试(双尾):*<1e−3,**<1e−9,*<1e−15(−log 10)pME/A晚期60T=28,78T=64,103 T=inf;ME/A早期60T=77,78T=134,103 T=inf;S早期60T=5.6,78T=72,103 T=54;S晚期60T=28,78T=16,103 T=11)。

模仿SMARCB 1药理学重建

重建SMARCB 1促进MRT的分化似乎是一种吸引人的、无细胞毒性的治疗策略。但是,恢复SMARCB 1目前,基因在儿童中的表达是不可行的。另一种策略是寻找模仿SMARCB 1重新表达。使用大容量的mrna-seq,我们定义了一个SMARCB 1+基于上调基因的转录程序SMARCB 1在我们的三种MRT类细胞器培养中的重新表达(附图)。6A,补充数据3)。我们可以验证SMARCB1+MRT组织中的程序,并发现与SMARCB 1正常组织中的表达水平(附图)。6B)。为了探索治疗途径,我们搜索了一个公开可用的微扰数据库。20对于诱导表达改变的药物SMARCB 1重建(图)3A)。这项分析确定了多种HDAC和mTOR抑制剂(补充图)。6C)是最受欢迎的。有趣的是,hdac抑制剂此前已被确定用于通过正交方法治疗横纹肌样肿瘤。21。我们测试了这些药物的表型和转录效应,单独或联合,跨越三种MRT类细胞器培养。单用HDAC抑制引起的形态转变类似于SMARCB 1重建(图)3B,补充图。7A)。此外,大面积培养转录因子的基因表达变化之间也存在显著的相关性。SMARCB 1重新表达和HDAC抑制。3C,补充图。6d)。抑制mTOR信号主要限制了器官的生长,然而,药物的冲刷是很容易逆转的(如图所示)。3F,g)。HDAC和mTOR抑制联合诱导大鼠的表型和转录改变SMARCB 1重组/HDAC抑制以及明显的增殖停止(图1)。3B,c,补充图。7A)。HDAC和mTOR的抑制作用是协同的,两种药物在剂量反应矩阵中的评估证实了这一点(图1)。3D,e,补充图。8A)。此外,与单一药物治疗相比,这些药物对生存能力的联合作用更持久.每种药物本身的抗增殖作用在冲洗后都是容易逆转的(MRT类细胞器103 T中的BAR HDAC抑制作用)。相反,联合处理对所有被测MRT类细胞器培养物的增殖有更持久的影响(如图所示)。3F,g,补充图。7b)。给药后60T和103 T的再生完全减弱,而78T则有较小的再生,这可能与观察到的残余增殖细胞有关。SMARCB 1重组(附图)三维空间)。为了确定MRT对HDACi和mTOR抑制是否特别敏感,我们测试了正常肾脏器官的敏感性。22这两种药物。正常肾脏器官对单一药物和联合治疗的抗药性明显增强,与MRT相比,联合用药后出现明显的再生(图一)。3F,g、补充图7b, 8B-d)。机械地说,hdac和mtor联合抑制作用的长寿可能是通过干扰myc介导的,因为myc驱动的癌细胞株似乎对这种药物组合特别敏感。23。在我们的实验中,我们询问了标记通路和微扰基因集。24,从而验证了我们的MRTSMARCB1+模型,因为我们发现SWI/snf相关的微扰基因集在SMARCB 1重组(例如SNF5)(SMARCB 1)和多梳抑制复合物的亚基25)(附图。6E,f)。此外,我们发现MYC靶基因受到强烈的下调。SMARCB 1再表达(附图)6E,h)。这是模仿HDAC/mTOR联合抑制,明显强于单剂治疗(补充图)。6I)。对差异表达基因的进一步研究表明,所识别的通路在很大程度上是在SMARCB 1重组与联合治疗(附图)。6g,补充数据3)。这些分析共同确认HDAC/mTOR联合抑制是药物模拟的。SMARCB 1在MRT中抑制增殖和诱导分化的重组。

图3:HDAC/mTOR复合抑制镜SMARCB 1重建。

A用于发现潜在的分化疗法的方法综述。BDMSO对照或涡旋体(HDACi,1M)和西罗莫司(mTORi,2NM)联合处理的MRT器官的典型免疫荧光图像。白色:DAPI(细胞核),红色:phalloidin(膜),绿色:MMP 2(间充质标记)。标尺等于50m。C热图表示基因表达值(n=两个独立的MRT控制实验SMARCB1+细胞器,或MRT类细胞器,用涡旋器(HDACi,1M)或涡旋器和西罗莫司(联合,1M/2NM)处理。热图是基因差异表达的子集。SMARCB 1重新表达(补充数据)3)。基因是由平均mRNA变化引起的。SMARCB 1再表达和治疗。颜色代码代表基因的表达值。Pearson相关系数(corr.)通过比较SMARCB 1再表达或HDACi/联合治疗。P皮尔逊相关检验(双尾)的数值为:*<1e−15(−log 10)(p值):COMI 60T=217,78T=inf,103 T=221;HDACi 60T=268,78T=306,103 T=192)。D关于剂量-反应矩阵设置的原理图概述,以寻找MRTS中HDAC(Vorinostat)和mTOR(西罗莫司)抑制剂之间的协同作用。E图显示零交互效能(ZIP)分数,表明协同(红色)或拮抗(蓝色)的联合治疗效果。ZIP分数是通过计算与假定药物不相互作用的参考模型的偏差来产生的(当ZIP>10%时协同作用)。51)。虚线矩形突出了药物浓度范围,两种药物之间的协同作用最强。源数据作为源数据文件提供。F再生试验的原理图概述。G条形图表示每个MRT或正常肾细胞器系的细胞活力值,正常值为时间点1(T1)DMSO对照。指出了独立实验(点)的均值和误差条(SD)。n=60T/103 T:3,78T mTOR/HDAC 1/COMB2NM1 M:6,78T HDAC 3M/COMB2NM3M:4正常肾:7)。每个独立实验平均有四个技术复制。源数据作为源数据档案。通过比较联合(T2)和HDACi(T2)处理,确定联合处理对细胞存活率的附加影响。比较T2与T1的再生能力。P值是使用配对比率学生的t测试(双尾):*<0.001.0 5,**<0.0 1,*<0.001.p值:Comi 1MT1 vs HDAC1MT1 60T=0.020,78T=0.012;COMB3MT2 vs COMB3MT1 78T=0.013,正常肾供体1=2.5e−5,供体2=1.8e−5)。

讨论

我们将系统发育和转录分析与模型系统中的实验相结合,研究了MRT的起源。我们的研究结果表明,MRT起源于神经嵴,向间质分化,并建议将mTOR/HDAC联合抑制作为一种治疗假说。

以往对MRT起源的研究建立在MRT的转录和表观遗传学分析基础上。尽管基因一致性内(AT/RT)和颅外横纹肌样肿瘤,与SMARCB 1缺失是唯一的复发遗传驱动因素,这些分析揭示了横纹肌样肿瘤的表型、转录和表观遗传变异,共同显示了MRT的神经和/或间充质分化。7,8,26,27。我们的系统发育分析现在坚定地将MRT的根与神经嵴来源的雪旺细胞联系在一起。因此,MRT的不同表型可以解释为神经嵴系跨越中胚层和外胚层边界产生细胞的能力。小鼠横纹肌样肿瘤的模拟实验表明SMARCB 1发育过程中的损失对肿瘤的形成至关重要。6,28。有趣的是,在我们的研究中,一些形态正常的雪旺细胞部分携带了MRT的体细胞基因组,包括SMARCB 1在一些牢房里。这表明SMARCB 1它本身的缺失可能不足以产生肿瘤,也不足以阻止正常的细胞分化。这一观点得到了广泛的肿瘤的进一步证实,其中包括更多的良性实体,如Schwannoma,即致病生殖细胞的突变。SMARCB 1(及相关基因)29。因此,除胚胎学中断的时间外,其他因素加在一起SMARCB 1似乎会影响人类肿瘤的形成。

区分儿童和成人癌症的一个独特特征是儿童肿瘤的胎儿起源。作为癌细胞异常分化基础的发育计划可能成为治疗的靶点。5。这一概念的一个先例是临床上使用维甲酸衍生物作为神经母细胞瘤的成熟治疗(Https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01704716)。然而,设计成熟的治疗方法是很有挑战性的,因为在高通量基因或药物筛选中使用的常规读数,如活力或增殖,可能不一定能捕捉分化状态。我们在这里采用了一种新的策略,用定量的分子术语来定义MRT分化的目标状态。SMARCB 1重建。然后,我们利用靶状态和药物效应的硅匹配来寻找模拟遗传的药物。SMARCB 1重建。我们的方法代表了一种特定的(有偏见的)寻找能产生预先定义的转录效应(在我们的例子中是MRT成熟)的药物。因此,虽然它缺乏无偏见药物筛选的能力来发现未知,但我们的方法可以成为药物发现的一条集中途径,当目标状态可以用定量的、分子的术语来定义时。

对像MRT这样依赖于获取新鲜材料和详细取样的罕见肿瘤的研究总是很少,即使是在我们这样的大财团进行时也是如此。因此,由于MRT细胞器的生物基底的大小随着时间的增长,我们将不得不重新检查我们在更大的队列中的观测结果。此外,重要的是要检查我们的发现对其他肿瘤的普遍性,这是由双等位基因丢失引起的。SMARCB 1BAF染色质重塑复合体的其他成员,特别是AT/RT,被认为是MRT的颅内对应物。

MRT仍然是最具侵袭性的儿童癌症之一,尽管有强烈的细胞毒性治疗,但MRT进展很快。因此,在MRT治疗中立即尝试mTOR/HDAC联合抑制似乎很有吸引力。然而,似乎是一种无害的体外分化剂,可能会对儿童的出生后发育产生严重的不良影响。5。例如,一项关于在患有SHH髓母细胞瘤的儿童中使用声刺猬(Shh)抑制剂的第二阶段试验因广泛的生长板融合而终止。30。尽管如此,我们还是认为,我们的研究结果所提出的治疗假设值得进一步评估。更广泛地说,我们的研究为发现成熟目标的定量方法确定了一个灵活的蓝图,适用于儿童癌症。


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