有效的ICI治疗与CX3CR1循环频率的增加相关 + CD8 + T细胞 而ICI可以恢复细胞因子的产生和效应T细胞的增殖。 34 最近对小鼠感染模型的研究表明，ICI也促进T细胞的效应分化。 35 。为了进一步阐明这一机制，我们评估了cx3cr1的表达，它是T细胞分化的标志，并与CD 27结合。 29 ,30 ,31 ，关于PB CD8 + 抗Pd-L1和抗CTLA-4Ab或同型抗CTLA-4Ab(NT：NO)治疗小鼠MC 38和CT26结肠腺癌模型前后的T细胞。 1A 和补充图。 1 )。明显改善肿瘤的控制和生存(见图)。 1B )随着CX3CR1频率的增加 + CD8 + T细胞(图1. 1C C_(38)和T_(26)荷瘤小鼠经ICI治疗后，与接受抗肿瘤同型抗体的小鼠比较。接下来，我们用四聚体(Tet)来检测CD8。 + 突变型Adpgk蛋白特异性T细胞(Adpgk) 穆特 )与肿瘤相关抗原(Taa)、gp 70在ct 26肿瘤中的表达。 36 ,37 ，并发现CX3CR1的频率显著增加。 + 泰特 + CD8 + 两种肿瘤模型中的T细胞。 1D )，提示ICI治疗后T细胞分化为肿瘤特异性CD8。 + T细胞我们还测试了PBCX3CR1的增加情况。 + CD8 + 对ctla-4或pd-1/pd-l1阻断剂有原发耐药性的小鼠可见T细胞。 38 ,39 。Pbcx3cr1增加的趋势不明显。 + CD8 + 联合CTLA-4/Pd-L1阻断治疗对B16荷瘤小鼠T细胞无改善作用(补充图)。 2 ).
图1：有效的免疫检查点抑制剂治疗与循环CX3CR1的频率增加有关。 + CD8 + T细胞 a 免疫检查点抑制剂(ICI)治疗的实验方案。 b 异型抗体(NT)、抗PD-L1抗体和抗CTLA-4抗体(ICI)对MC 38和CT 26荷瘤小鼠个体肿瘤生长和存活曲线的影响。c , d 显示CX3CR1频率的有代表性的流式细胞术图和数据面板 + CD8细胞 + T细胞( c )和四聚体(TET) + CD8 + T细胞( d )对MC 38和CT 26荷瘤小鼠外周血(PB)进行了不同的治疗。数字表示百分比CX3CR1 + 细胞。门控策略在附图中给出了。 1 。处理2周后收获PB。 n =5只小鼠(每组5只) b –d ). e , f PBCX3CR1频率 + CD8子集 + T细胞( e )、肿瘤生长曲线(平均)和生存曲线( f )在CT26荷瘤小鼠中，各治疗组均呈阳性反应。 n =9只小鼠(NT)、6只小鼠(抗CTLA-4Ab)、6只小鼠(抗PD-L1 Ab)和5只小鼠(COMO)。 g PBCX3CR1频率 + CD8子集 + 异型对照抗体(NT)或抗PD-L1抗体对MC 38荷瘤小鼠T细胞的影响。 n =7只小鼠(NT)和6只小鼠(抗PD-L1 Ab)。 h MC 38荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线(平均值)和存活曲线均符合上述指标。 n =5只小鼠。数据显示在 b –h 是两个独立实验的代表。处理开始后1周收获PB( e , g )。箭头表示开始治疗( b , f , h ). P- 数值由对数等级(Mantel-Cox)检验( b , f , h )，一个双尾曼恩-惠特尼 U -测试( c , d , g )或Kruskal-Wallis与Dunn的多重比较( e )。数据 f , h 均为平均±扫描电镜。方格图：点，单PB；铰链，25和75百分位数；中线，中位数；胡须，最小到最大值( c –e , g )。源数据作为源数据文件提供。
虽然抗pd-l1Ab和抗ct-la-4Ab的靶细胞亚群都是精疲力竭的CD8。 + T细胞，它们通过不同的细胞机制来做到这一点。 40 。因此，我们评估了pBCD8的CX3CR1表达。 + 用抗Pd-L1抗体、抗CTLA-4Ab或两者联合作用于CT26荷瘤小鼠的T细胞。增加PB CX3CR1的频率 + CD8 + T细胞在单次治疗或联合ICI治疗后与未治疗相比均有不同程度的变化(图二)。 1E )。值得注意的是，单一治疗与联合治疗在抗肿瘤效果上没有明显差异(图一)。 1F )，与PB CX3CR1的频率一致。 + CD8 + T细胞循环CX3CR1的增加 + CD8 + T细胞在MC 38荷瘤小鼠中也被观察到，单用抗PD-L1治疗，可以改善肿瘤的控制和生存(图一)。 1g，h )。这些发现表明，有效的ICI治疗与PBCX3CR1的频率增加有关。 + CD8 + 和CX3CR1 + 泰特 + CD8 + 小鼠T细胞。
外周CX3CR1 + CD8 + T细胞显示最近激活的效应细胞的特性，降低了肿瘤血管的转运能力。 其次，我们采用基于CD 27和CX3CR1表达的门控策略，对CD8的三个亚群进行了表征。 + T细胞(CD 27) 罗氏 CX3CR1 − 、CD 27 嗨 CX3CR1 − 和CX3CR1 + )用ICI治疗小鼠。 2A )。CTLA-4和pd-L1阻断治疗CT26荷瘤小鼠PBCX3CR1 + CD8 + T细胞低表达L-选择素(CD62L)和CXCR 3，这是血液传播的T细胞穿过淋巴器官高内皮静脉(HEV)和肿瘤微血管所需的转运受体(图)。 2B )41 ,42 。这些发现与我们最近的研究以及其他研究结果是平行的，这些研究表明外周病毒和肿瘤特异性的CD8。 + 高表达CX3CR1的T细胞CD62L和CXCR 3表达降低，且主要分布在循环中。 30 ,43 。值得注意的是，CX3CR1 + Pd-1大部分呈阳性，pd-1在pb新抗原特异性CD8中表达。 + 患者T细胞 44 。CD8三个亚群的进一步分析 + 抗ctla-4/pd-l1抗CTLA-4/pd-L1治疗和抗pd-l1单抗治疗MC 38荷瘤小鼠的T细胞显示，cx3cr1。 + 无论小鼠株、肿瘤类型、单药或联合ICI治疗，颗粒酶A、4-1BB、TIM3和KLRG 1的表达均明显增加。 2C 和补充图3)，以及CX3CR1 + CD8 + T细胞代表最近激活的效应细胞的子集，与先前的研究一致。 29 ,30 ,31 ,33
图2：外周血CD8表型分析 + 免疫检查点抑制剂(ICI)治疗小鼠T细胞。 a 三个亚群表型分析的选通策略(CD 27) 罗氏 CX3CR1 − 、CD 27 嗨 CX3CR1 − ，以及CX3CR1 + )外周血CD8 + 小鼠T细胞。 b , c 建立CT26荷瘤小鼠，每3天分别用抗pd-L1抗体(Ab)和抗CTLA-4Ab治疗一次，隔日一次。外周血(PB) b )和脾脏( c )在开始处理后2周收获。具有代表性的三组流式细胞术图(CD 27) 罗氏 CX3CR1 − 、CD 27 嗨 CX3CR1 − ，以及CX3CR1 + )( b )和脾( c )CD8 + T细胞显示。数据面板显示CD8之间的频率 + T细胞NS，没有意义，* P < 0.05, **P < 0.005, ***P < 0.0001, by one-way repeated measures ANOVA with Tukey’s multiple comparisons (b , c ). n =9只小鼠 b , c )。所示数据 b , c 是两个独立实验的代表。源数据作为源数据文件提供。
Cx3cr1而不是ki-67在pb CD8中稳定上调。 + ICI治疗过程中的T细胞 进一步了解PB CX3CR1 + CD8 + T细胞，我们检测核蛋白Ki-67的表达，这是一种在pb CD8亚群中被上调的增殖标记物。 + T细胞对ICI的反应 8 ,9 ,24 ,25 ,26 ,27 。Ki-67在CX3CR1中的表达 + CD8 + T细胞显著高于CX3CR1细胞。 − (CD 27) 罗氏 CX3CR1 − 和CD 27 嗨 CX3CR1 − 抗CTLA-4/PD-L1治疗CT26荷瘤小鼠2周后的细胞亚群(图1)。 3A )。接下来我们将检查PBCD8中CX3CR1的表达是否增加。 + T细胞在抗CTLA-4/PD-L1治疗过程中是短暂的或持续的.CX3CR1频率增加 + 在两种CD8中都有子集。 + 和泰特 + CD8 + T细胞从第7天开始，在治疗期间保持较高水平(见图)。 3B )。相反，Ki-67的表达在第14天达到高峰，在第21天恢复到基线水平(如图所示)。 3B ).
图3：PBCX3CR1的表型分析 + CD8 + T细胞在ICI治疗前和治疗过程中。 a –c 第26号( a –c )或MC 38( c )荷瘤小鼠分别每3天和2天分别用抗PD-L1抗体和抗CTLA-4抗体(Ab)治疗一次.治疗前、治疗后1、2、3周取外周血(PB)。门控策略：全细胞>大小淋巴细胞>单细胞>活>CD3 + CD8 + >CD 27，CX3CR1。 a CD 27的Ki-67表达 罗氏 CX3CR1 − (绿色)，CD 27 嗨 CX3CR1 − (蓝色)和CX3CR1 + (红色)CD8 + ICI治疗2周后外周血T细胞在PB中表达。数字表示百分ki-67。 + 细胞。数据面板显示Ki-67的中位荧光强度(MFI)。 + 每个子集中的细胞。 n =4只小鼠。 b 盒子和晶须图显示Ki-67的MFI + CX3CR1的(蓝色)和频率(红色) + CD8子集 + T细胞(上)和Tet + CD8 + 在第0、7、14和21天，T细胞(较低)在PB。 n =3只小鼠(第0天)和 n =4只小鼠(第7、14和21天)。 a , b 所显示的数据代表了两个独立的实验。 c PB TET频率 + CD8 + CD 27中的T细胞 罗氏 CX3CR1 − (绿色)，CD 27 嗨 CX3CR1 − (蓝色)和CX3CR1 + CT26(上)和MC 38(下)荷瘤小鼠治疗前、治疗后1、2、3周(红)亚群。对于CT26荷瘤小鼠来说， n =31(第0天)， n =18(第7天)， n =9(第14天)，及 n =9(21天)来自三个独立实验。对于MC 38荷瘤小鼠， n =14(第0天)， n =29(第7天)， n =19(第14天)，及 n =8(21天)来自三个独立实验。 P -数值由单向重复测量方差与图基的多重比较( a , c )。方格图：点，单PB；铰链，25和75百分位数；中线，中位数；胡须，最小到最大值( a –c )。源数据作为源数据文件提供。
肿瘤特异性CD8 + T细胞在CX3CR1中富集 + PB中的子集 发现循环T细胞生物标记物可以丰富肿瘤反应性T细胞，有助于发现对ICI反应的动态预测标记物。首先，我们评估了tet的频率。 + CD8 + PBCX3CR1中的T细胞 + 和CX3CR1 − MC 38和CT 26荷瘤小鼠的亚群(附图)。 4 )。我们找到了更多的泰特 + CD8 + CX3CR1中的T细胞 + 比CX3CR1中的子集 − 即使在治疗之前，也有不同的亚群，尽管个体小鼠的频率不同(如图所示)。3C )。此外，TET的频率 + CD8 + T细胞在CX3CR1中保持较高水平 + 比CX3CR1中的子集 − 两种肿瘤模型中的亚组(图1)。 3C )，建议PB CX3CR1 + 细胞亚群富集肿瘤特异性CD8 + T细胞
CD8克隆扩张TCR循环 + TIL在周边CX3CR1中富集 + ICI治疗中的子集 肿瘤特异性CD8的高频率 + CX3CR1中的T细胞 + ICI治疗前后的子集提示异质性肿瘤浸润CD8。 + T细胞也在CX3CR1中富集。 + 子集。为此，我们对分离的CD8进行了tcr测序。 + TILs与脾CD 27 罗氏 CX3CR1 − 、CD 27 嗨 CX3CR1 − ，以及CX3CR1 + CD8 + 抗CTLA-4/PD-L1联合治疗MC 38荷瘤小鼠T细胞(补充图)。 5A，b )。CD8型TCR的比较 + TILs与脾CD8的三个亚群 + T细胞显示tcr在CD8之间的使用重叠程度很高。 + TILs与脾CX3CR1 + CD8 + T细胞(图1. 4A 和补充图。 6 )由森田的重叠指数决定 45
图4：有效的ici治疗导致肿瘤浸润的CD8之间存在高度的tcr序列相似性和克隆性。 + T细胞与外周血CX3CR1 + CD8 + T细胞 a –d 用抗CTLA-4抗体(Ab)和抗PD-L1抗体治疗MC 38荷瘤小鼠.脾CD8的三个亚群 + CD 27和CX3CR1表达(CD 27)检测T细胞 罗氏 CX3CR1 − 、CD 27 嗨 CX3CR1 − ，以及CX3CR1 + )，和CD8 + TCR治疗2周后分离肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，并进行克隆性分析。 a 由Morisita指数(左)和典型的脾CD8各子集间TCRβCDR 3氨基酸(AA)频率的代表性成对散点图重叠 + T细胞和CD8 + TILs(右)。 n =3项独立实验。 b 脾CD8三种亚群TCR克隆性分析 + T细胞和CD8 + 第一序列图(左)、基尼指数(中心)和洛伦兹曲线(右)。最丰富的100个AA序列是着色的，而其他频率较低的克隆在顶部序列图中是紫色的。 n =3个关于基尼指数的独立实验。顶层序列图和Lorenz曲线是三个独立实验的代表。 c 用免疫图谱分析脾CD8三个亚组间的代表重叠加权TCR序列树状图 + T细胞(蓝)和CD8 + TILs(红色)分支端的距离表示序列距离，圆的大小表示序列的频率。所显示的数据代表了三个独立的实验。 d 三个脾CD8亚群共享的前100个生产序列中的优势基序数目 + T细胞(蓝)和CD8 + TILs(红色) c )。数据表显示脾脏CD8的三个亚群之间共有的优势基序数目。 + T细胞和CD8 + 三个独立实验的TIL。单向重复测量与图基多重比较的方差分析( a , b )。平均值为±SEM。源数据作为源数据文件提供。
接下来，我们用CD8来评估TCR的克隆性。 + TILs与脾CD8的三个亚群 + 抗CTLA-4/PD-L1治疗后2周T细胞(图1)。 4B )。100个最丰富的TCR克隆(着色)在脾CX3CR1中占TCR序列的50%以上。 + 子集和CD8 + 脾CX3CR1中大部分TCR序列的TILs − 亚组由频率较低的无性系(紫色)组成。为了量化克隆分布的偏斜性，我们测量了Gini指数，并在脾CX3CR1中发现了同样较高的克隆性。 + 子集和CD8 + TIL与脾CX3CR1比较 − 子集。脾CX3CR1的Lorenz曲线 + 子集和CD8 + TILs远离等分线，这表明TCR曲目的分布和倾斜是不平等的。
ICI治疗诱导CD8高度TCR序列相似性和克隆性 + TILs与周边CX3CR1 + CD8 + T细胞 识别同一抗原的tcrs可能不是tcr的确切克隆类型，但具有高度同源的序列和相似的序列特征。 46 ,47 。不像森田的重叠指数，生物信息学程序，免疫地图 48 ，使我们能够分析周围和瘤内CD8之间的生物序列相似性。 + T细胞在脾CX3CR1中扩增的结构克隆 + CD8 + T细胞亚群和CD8 + 与CX3CR1相比，TILs通常是共享的。 − 亚群和CD8 + 由树状图显示的TILs(如图所示)。 4C 和补充图。 7a，b )和通过跟踪优势的主题(图。 4D )抗CTLA-4/PD-L1治疗后2周。
脾CX3CR1前6个显性CDR 3β氨基酸(AA)序列分析 + CD8 + T细胞和CD8 + TILs显示，他们在所有三个独立实验(补充表)中都有一个非常频繁的AA序列(CASSLVGNQDTQYF)。 1 、黄色高亮显示和补充数据 1 )。尽管最频繁的AA序列， CASSP RLGDN YAEQFF ，在脾CX3CR1中 + CD8 + T细胞在CD8中未检出。 + 同一实验中的TILs(Exp.1在补充表中 1A )，这个AA序列与显性AA序列有高度的同源性， CASSP YAEQFF 和 CASSP GQG YAEQFF 在CD8中 + TILs，位于树状图的同一分支(补充表) 1B ，蓝色突出显示和补充图。 7A )。同样，丰富的AA序列， 卡斯 PGRG YEQYF 脾脏CX3CR1 + CD8 + T细胞和 卡斯 中士 YEQYF 在CD8中 + TILs主要集中在同一个分支中，表明它们具有高度的相似性(Exp)。2在补充表中 1 、绿色突出显示和补充图。 7b )。综上所述，这些发现提示了TCR在外周CX3CR1中的应用。 + CD8 + T细胞克隆在CD8中反映TCR序列 + PBCD8上的TIL和CX3CR1 + T细胞在有效的抗CTLA-4/PD-L1治疗过程中可能是一个动态的生物标志物。
CX3CR1的扩展 + PBCD8的子集 + T细胞与非小细胞肺癌抗pd-1治疗疗效及生存期的关系 接下来，我们将探讨CX3CR1的频率是否发生了变化。 + PBCD8的子集 + T细胞与ICI反应相关。我们评价了36例非小细胞肺癌患者应用抗Pd-1Ab(pbrobrolizumab或nivolumab)治疗的疗效.在基线(治疗开始前)和治疗12周期间每3~6周一次，前瞻性地获得PB。所有患者均有预处理肿瘤组织，以评估PD-L1的表达。当有额外的肿瘤组织时，也会分析TILs和TMB的频率。 49 。补充表描述36例非小细胞肺癌患者的基线特征 2 。个别病人的临床反应是根据研究人员报告的数据根据iRECIST标准得出的。50 在12周的时间点。对于pd-l1肿瘤比例评分(Tps)为50%以上和1-49%的患者，包括完全缓解(CR)和部分反应(PR)的总有效率分别为36.7%和20%。 51 ,52
我们分析了CX3CR1的频率。 + PBCD8的子集 + 36例非小细胞肺癌患者用抗Pd-1Ab治疗T细胞(见图)。 5A )。CX3CR1的中位基线频率 + CD8子集 + T细胞占32.3%(6.1%~76.3%)，高、低频两组间总存活率(OS)无显着性差异(图6.1~76.3%)。 5B )。因为CX3CR1的预处理频率 + CD8 + T细胞在非小细胞肺癌患者中的变化，以评价抗pd-1治疗对非小细胞肺癌患者CD8的影响。 + T细胞，我们计算出CX3CR1的频率从基线上变化的百分比。 + PBCD8的子集 + T细胞可在所有治疗后的时间点(3-12周后开始)。我们评估了CX3CR1的最大变化(最大百分比变化)。 + PBCD8的子集 + 在应答者和非应答者中，从基线到给定时间点的T细胞。CX3CR1的最大百分比变化 + 自治疗开始后3周，应答者的子集明显高于无反应者(见图)。 5C )。其次，利用Logistic回归模型得到了曲线下面积(AUC)和相应95%置信区间(CI)的估计值，并利用Youden指数准则确定了群间判别的最优分界点。 53 。这些分析表明，CX3CR1的增加 + CD8 + 在3至12周时，T细胞亚群比基线分离的应答者和非应答者高出15.5%至21.2%，与较高的优势比、敏感性、特异性、阳性预测值(Ppv)和阴性预测值(NPV)有关(补充表)。 3 和补充图。 8 )。此后CX3CR1的百分比变化 + PBCD8的子集 + 基线T细胞被指定为“CX3CR1评分”。图形 5D 显示单个患者的CD8-T细胞纵向反应。我们发现，在92.3%(12/13)的应答者中，CX3CR1评分至少增加了20%，而非应答者仅为13.0%(3/23)。
图5：CX3CR1的扩展 + PBCD8的子集 + 非小细胞肺癌患者T细胞与抗PD-1治疗反应及存活密切相关. a CX3CR1的选通策略 + CD8 + 外周血T细胞。细胞首先为淋巴细胞(SSC-A与FSC-A)和单细胞(FSC-H vs FSC-A)。 b 高发患者的总体生存率(OS) n =18)和低( n =18)CX3CR1的预处理频率 + PBCD8的子集 + T细胞CX3CR1的中位基线频率切点 + PBCD8的子集 + T细胞 c CX3CR1的最大变化率 + PBCD8的子集 + 响应者按给定时间点从基线产生的T细胞(CR/PR： n =13)和无反应者(SD/PD： n 36例非小细胞肺癌患者中，23例采用抗PD-1治疗。CR/PR：完全和部分反应，SD/PD：稳定和进展性疾病。 P- 数值由一个双尾的Mann-Whitney计算。 U -测试。数值为中位数±扫描电镜。 d CX3CR1的百分比变化 + PBCD8的子集 + 在应答者和非应答者中来自基线的T细胞(CX3CR1评分)。 e 目的对Pd-L1肿瘤比例评分(TPS)和PBCX3CR1评分在3、6、9和12周时的有效率(ORR)进行比较。ORR用Fisher‘s精确检验进行分析。 f 无进展生存(PFS)和操作系统为高和低CX3CR1评分。 P- 数值用对数秩(Mantel-Cox)检验( B，f )。NS，没什么意义。源数据作为源数据文件提供。
基于这些结果，我们假设CX3CR1评分至少增加20%将与抗PD-1治疗的反应相关，并评估CX3CR1评分与客观反应之间的关系。最大CX3CR1评分至少为20分，3周时开始与ORR相关( P =0.0152)(优势比16.0；95%CI：1.5~171.2)，并在9周时与反应密切相关(P<0.01)。 P < 0.0001) (odds ratio: 36.7; 95% CI: 5.3–253.8) (Fig. 5E )。其次，我们分析了CX3CR1评分和PD-L1 TPS相应的敏感性、特异性、PPV和NPV。最大CX3CR1评分在3、6、9和12周分别有21/27(77.8%)、28/36(77.8%)、31/36(86.1%)和32/36(88.9%)的PPV、NPV、敏感性和特异性显著高于PPV，28/36(77.8%)、31/36(86.1%)和32/36(88.9%)，而PD-L1 TPS至少50%的PPV和特异性较差，只有16/36(44.4%)才能正确识别反应。 1 )。值得注意的是，只有66.6%(24/36)和61.1%(22/36)的非小细胞肺癌患者可利用肿瘤组织评估TIL和TMB的频率(补充表) 4 )，建议对这些分析进行限制，以便与以前的报告保持一致。 54 ,55 。最后，我们评估了CX3CR1评分与生存期的相关性。随访时间中位数为22.3个月(3.3~35.5)。我们发现，CX3CR1评分在12周内至少增加20%与无进展生存率(PFS)有关(死亡或疾病进展的危险比：0.28；95%CI：0.13-0.62； P (死亡率0.24；95%CI：0.09-0.61； P =0.0136)(图1。 5F )。CX3CR1评分<20%的患者的PFS和OS中位数分别为5.7和8.6个月，而CX3CR1评分在12周前至少20%的患者的PFS和OS中位数为19.5个月，未达到。
表1 Pd-L1 TPS与CX3CR1评分的生物标志物性能比较。 我们组的大多数患者(86.1%：31/36)患有非小细胞肺癌，其PD-L1 TPS值至少为50%，并经美国食品和药物管理局(FDA)于2016年批准使用彭布鲁克利祖马(Pbrobrolizumab)治疗。因此，我们评估了CX3CR1评分与该人群抗PD-1治疗反应之间的关系。CX3CR1评分与疗效相关，12周时CX3CR1评分增加至少20%，ORR、PFS和OS(补充图)与临床疗效相关。 9A-c )。虽然CX3CR1评分较小，但在PD-L1 TPS<50%的患者中，CX3CR1评分与疗效相关(补充图5)。 9d )。我们还评估了化疗或放射治疗是否会影响CX3CR1评分的效用，但没有观察到先前化疗或放疗对生物标志物性能的影响(补充图1)。 9E )。加在一起，CX3CR1评分与患者的临床反应和早期治疗的生存密切相关。
值得注意的是，CD8的最大变化百分比没有显着性差异。 + PBCD3中的T细胞 + 在任何时间点，响应者与非应答者之间来自基线的T细胞(补充表) 5 和补充图。 10A )。因此，CD8的变化 + PBCD3中的T细胞 + T细胞与OS和PFS无关(补充图)。 10b )和非小细胞肺癌患者，其PD-L1 TPS值至少为50%，并接受了彭布鲁克利祖马(补充图)治疗。 10C ).
