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基于结构可切换dna连接剂的糖聚糖芯片用于癌症相关复合糖聚糖的芯片生物合成

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发表时间:2021-03-08 11:47作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

芯片上的糖基生物合成是制备有用的复合糖基源和同时制备涉及到糖基的应用的有效策略。然而,现有的分析方法在分析生物合成的聚糖和优化酶反应时都存在一定的局限性,可能导致表面糖聚糖结构的不确定,导致结果的不均匀和不可靠。在本工作中,通过引入pH响应的I-基序DNA连接剂来控制糖聚糖在芯片表面的固定和分离,研制出了一种基于pH的糖聚糖芯片。通过对表面分离产物的逐步定量分析,优化了芯片上酶糖合成方法,用于肿瘤相关的Globo H六糖及其相关复合糖的均匀生物合成。成功地将抗Globo H抗体和MCF-7乳腺癌细胞与芯片上生物合成的Globo H相关糖聚糖进行了相互作用分析,证明了基于结构可切换的dna连接芯片平台的可行性,可用于芯片上复杂的糖聚糖生物合成和糖聚糖的应用。

导言

糖基蛋白相互作用在多种生物过程中起着重要作用,包括血管生成、干细胞发育、免疫反应和神经元发育。1,2。糖基化模式的改变也被证明可以调节癌症的发展和进展。3。因此,了解这些相互作用对于分析糖基聚糖介导的生物学过程的机制和开发治疗药物来治疗糖基相关疾病具有重要意义。

甘露聚糖芯片是针对高通量分析中涉及到的糖链相互作用的基本需求而开发的。目前,糖聚糖芯片已被用于筛选治疗药物和分析与糖聚糖相关的相互作用,包括糖胶凝集素、糖聚糖-细胞因子、糖胶抗体和甘露聚糖病毒/细菌相互作用。4,5,6,7,8。然而,相对于我们对蛋白质和基因的生物学功能的了解,有关糖聚糖芯片的生物过程的研究还处于起步阶段。为了构建糖聚糖芯片,大多数均质糖聚糖通常是通过化学合成或多相色谱天然纯化来提供的。这些方法具有劳动强度大、成本高、耗时长、对保护和脱保护步骤的要求、糖苷键立体化学控制困难等缺点,导致纯度低,步进收率低。9,10,11。对具有不同结构的糖聚糖库的有限访问限制了对其在体内作用的广泛研究。此外,目前的糖聚糖芯片平台使用了一种将化学酶法合成的糖聚糖与连接物结合的方法,将它们固定在表面。4,5,6,7,8。这种方法不适用于复杂的糖聚糖,因为这些化合物比简单的糖聚糖合成率低得多,而且与连接剂的结合也有消除不稳定唾液酸的局限性,从而造成严重的损失。12,13,14.

考虑到芯片上合成的寡核苷酸和多肽已被成功地用于基因组学和蛋白质组学。15,16,17芯片上酶糖聚糖的合成是一种很有吸引力的糖基化合物合成工具。该方法与传统方法相比,具有成本低、工艺简单等优点,无需额外的保护/去保护、纯化和固定化步骤,使用少量昂贵的糖加工酶和核苷酸糖供体,直接合成糖苷键,直接应用于糖基化合物。然而,只有少数几个糖聚糖芯片是由芯片上的酶合成而来的。18,19,20。在此之前,我们演示了GM1五糖相关复合物的芯片上酶合成。19。虽然芯片上复合糖聚糖生物合成的可行性得到了证实,但目前的平台存在着一个关键的技术障碍.由于无法在现有平台上分离和分析固定化糖聚糖,因此无法获得表面生物合成复合糖聚糖的定量信息。此外,这些研究仅通过与荧光染料标记的凝集素相互作用来分析芯片上的酶糖基化反应.用芯片上凝集素的荧光强度值计算酶的糖基化效率是不可能的。这些缺点使得使用现有的平台难以控制和优化逐步糖基化反应,导致芯片上结构不明确的糖基化反应,从而导致不平等和不可靠的结果。因此,芯片上酶糖基糖基化糖基芯片需要一种先进的策略.

摘要以DNA杂交为基础的固定化方法已被用于制备糖聚糖芯片。21,22,23,24,25,26。双链dna(Dsdna)连接剂充当硬臂,使表面能更好地呈现糖聚糖和糖簇。21,22,23,27。它们还允许对空间安排进行裁剪。21,22,27。这种性能导致了糖苷团簇效应。21,22,23,25,27,28,这是糖基蛋白相互作用的关键因素。24,26,29,30。此外,dna连接物还被用作标识符,通过将单个寡核苷酸与糖聚糖结合的蛋白质和细胞结合在一起,来编码单个的甘氨酸结合蛋白和细胞。31。利用这些优点,基于dna的糖聚糖芯片与质谱联用,通过对芯片上糖基加工酶活性的分析,证明了在芯片上进行糖基生物合成的可能性。24.

在本工作中,我们开发了一个基于pH响应的I-motifDNA芯片上合成复合糖聚糖的糖聚糖芯片平台,作为将糖聚糖固定在固体载体上的连接材料。含有胞嘧啶残基片段的I-基序dna在酸性pH条件下形成稳定的四股螺旋二级结构。32,33,34,35。PH响应的结构开关使得在固体表面可逆地固定和分离糖聚糖成为可能。如图所示。1A糖聚糖和互补单链寡核苷酸的结合可以与固定在芯片表面的I-基序DNA杂交,这种DNA在稍基本的条件下被固定在芯片表面。随着pH值的降低,I-基序DNA趋向于形成四重链结构,导致DNA双螺旋变性,从而使糖基寡核苷酸结合物从表面分离出来。这一性质使得利用液相色谱法分析分离的糖基寡核苷酸结合物来优化芯片上的酶糖基化反应成为可能,从而在芯片上合成了结构明确的复合糖基。因此,我们提出的糖聚糖芯片平台可以通过固定结构简单、合成率高的二糖,然后在优化的条件下利用糖基转移酶在芯片上合成复杂的糖基聚糖,从而改善现有平台的局限性。

图1:结构可切换的基于DNA的糖胶芯片平台。
figure1

a使用pH响应的I-motif dna链接器的结构可切换的基于dna芯片平台的原理图。b在基本条件下(pH 9.0),用示意图和扫描原始图像进行互补单链寡核苷酸与表面固定化I基序DNA的杂交。cg通过表面固定化I-基序DNA的pH响应结构变化对乳糖-寡核苷酸结合物进行杂交和变性的原理图和扫描原始图像。c在碱性条件(pH9.0)下,乳糖寡核苷酸与表面固定化I-基序DNA的第一轮杂交。d表面固定化I-基序DNA在酸性条件下(pH 4.5)对乳糖-寡核苷酸结合物的第一轮变性。e基础条件下乳糖寡核苷酸与表面固定化I-基序DNA的第二轮杂交。f表面固定化I-基序DNA在酸性条件下乳糖-寡核苷酸结合物的第二轮变性。g在基本条件下,用表面固定的I-基序DNA与分离的乳糖-寡核苷酸结合物进行第三轮杂交。用生物素化rca法检测杂交乳糖寡核苷酸偶联物120凝集素与Alexa Fluor®647-结合链霉亲和素。标尺为800μm。符号:蓝色圆圈,GLC;黄色圆圈,GAL。

用基于结构可切换的dna糖基芯片平台Globo H系列确定芯片上酶糖基化的可行性(表)1)被选为目标复合物,在人肿瘤细胞上异常地过表达,并且已知参与肿瘤的进展。36,37。以芯片表面固定化乳糖(二糖)为原料,在逐步酶促糖化反应的优化条件下,利用pH响应的I-基序DNA连接剂,成功合成了5种与Globo H相关的复合糖(从三糖到六糖)。我们假设,当考虑到珠菌糖脂GB5、SSEA-4和Globo H在癌细胞上过度表达时,糖聚糖的特异性结合蛋白可能存在于乳腺癌细胞上,从而促进肿瘤的进展和转移。38,39,40。我们分析乳腺癌细胞和芯片上生物合成的Globo H相关的复合糖聚糖之间的相互作用,以检测糖基结合的特异性。这一分析可以展示我们的基于DNA的糖基芯片平台与芯片上酶糖基化相结合的潜力,以制备复杂的糖能源,并同时分析糖基相关的生物相互作用。

表1.本工作中使用的糖聚糖及其序列。

结果

糖链芯片DNA连接剂的制备

在5‘处用硫醇化的T10修饰含有四段连续胞嘧啶(CCCS)序列的I-motif dna,将其固定在镀金玻璃玻片上(补充表)。1)。引入T10序列,提高了I-基序DNA的结构稳定性,并通过与金表面保持一定距离来防止荧光猝灭。摘要设计了三种错配的单链互补dna(Ssdna)用于糖基寡核苷酸偶联物(补充表)。1)。这三种不匹配可以防止ssDNA本身G-四链结构的形成,并促进杂交dsDNA的变性。41。用硫醇-烯光化学反应合成了乳糖-寡核苷酸偶联物,其中5‘-巯基修饰互补ssDNA在紫外光下与烯丙基乳糖共价连接(附图)。1)。用高压液相色谱法纯化合成的乳糖-寡核苷酸偶联物(附图).2),并经1H核磁共振(NMR)和质谱(MS)分析(附图)。39).

基于pH响应的DNA连接芯片平台的研制

在酸性条件下,通过胞嘧啶(C)和质子化胞嘧啶(C+)之间的分子内碱基配对,i-基序DNA以四股四链结构存在。42。折叠结构可以防止I-基序DNA在表面的紧密固定,为I-模体DNA的可逆结构变化提供足够的表面空间。首先,将70种溶解在磷酸盐缓冲溶液(pH4.5)中的μMI-MotifDNA机器人定位到一个金芯片上,并在一个加湿室中孵育一夜。I-motif dna通过金-硫醇相互作用连接到金表面。43。经I-基序DNA固定后,用聚乙二醇甲醚硫醇在PBS(pH4.5)中阻断芯片。用PBS缓冲液(pH9.0)将乳糖-寡核苷酸结合物孵育到I-基序DNA固定化表面。以DNA杂交为基础的乳糖固定化研究蓖麻凝集素I(RCA)120)凝集素,与末端半乳糖(GAL)特异结合。而互补的ssDNA处理表面没有显示出较强的荧光强度。1B),乳糖-寡核苷酸共轭表面处理。1C)。为了验证表面I-基序DNA的可逆结构变化是否可以控制乳糖-寡核苷酸结合物的固定和分离,对该芯片进行了pH4.5和pH9.0PBS缓冲液的连续处理。当芯片与RCA一起孵育时120用pH4.5的溶液处理后,未见荧光。1D,f)。为进一步验证酸性pH条件下寡糖结合物的分离,将单链寡核苷酸与alexa荧光结合在一起。®以5‘端的647为模型。当酸性溶液(pH4.5)孵育Alexa Fluor后,即使在高浓度的I-motif dna中,也几乎没有荧光。®647-芯片上的共轭互补寡核苷酸(补充图。10)。因为亚历克莎·弗罗尔®647染料从pH 4到pH 10是耐pH的。44荧光变化的原因似乎是染料共轭寡核苷酸的分离,而不是酸性条件下染料的失活。这些结果表明,在酸性条件下,通过形成I-基序DNA的四重链形式,乳糖-寡核苷酸结合物与芯片表面完全分离。将溶解在pH9.0缓冲液中的乳糖-寡核苷酸偶联物再加入I-基序DNA固定的芯片上,成功地实现了乳糖-寡核苷酸结合物的再杂交。1E,g)。这些结果表明,I-基序DNA的pH依赖性结构改变使糖基寡核苷酸结合物从表面分离并重新动员到表面。因此,基于I-基序DNA可逆结构变化的糖聚糖芯片平台被成功地开发出来,用于定量分析表面上的复合糖聚糖生物合成,并直接为糖聚糖相关应用提供复杂的糖聚糖。

芯片上酶法合成癌症相关复合物糖聚糖

在中性pH条件下,在芯片上进行酶糖基化反应时,杂交形式应是结构稳定的。因此,在芯片上进行糖基聚糖生物合成之前,我们根据培养时间在pH7.0的溶液中检测了杂交形式的稳定性。该芯片经互补ssDNA处理后,在pH7.0溶液中孵育24~72h,然后加入具有内禀荧光的阿霉素。培养72h后荧光强度无明显变化(附图)。11),表明杂交在片上酶糖基化条件下是结构稳定的,这得到了先前的研究的支持,表明i-motif dna在pH 6.4以上的溶液中具有线性结构。32.

为了验证基于DNA的糖基芯片平台用于复合糖聚糖芯片上生物合成的可行性,利用几种糖基转移酶在芯片表面进行了酶促糖基化。用荧光染料标记凝集素对各糖基化产物进行分析。所有酶反应在37°C下进行48 h。首先,用含有α-1,4-半乳糖基转移酶(LgtC),UDP-Gal和MgCl的Tris-HCl(pH7.0)溶液。2将其应用于乳糖二糖固定化表面。α-Gal-特异性[医]单叶狮鹫异链菌素B4(GS-IB)4)与LgtC酶处理表面的糖基化产物结合,表明Gb3三糖被成功地生物合成。2A)。其次,用含β-1,3-的Tris-HCl(pH7.0)溶液对合成的Gb3三糖固定化表面进行了处理。N-乙酰半乳糖氨基转移酶(LgtD),UDP-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GalNAc)和MgCl2。大豆凝集素(SBA)凝集素与芯片表面LgtD酶合成的产物相互作用,而LgtD未处理的表面无荧光。2B)。结果表明,用LgtD成功地将GalNAc残基转移到固定化Gb3三糖上。含有UDP-Gal、LgtD和MgCl的Tris-HCl(pH7.0)溶液2在Gb4四糖固定化表面上孵育。RCA120凝集素结合在Gb4四糖表面与LgtD反应的微点上,表明GB5五糖是由Gb4四糖酶法合成的。2C)。然后,将α-2,3-唾液酸转移酶(α2,3-SialT)溶液添加到GB5五糖固定化表面,合成SSEA-4六糖.α2,3-链接N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)-特异性山楂凝集素Ⅱ(MALⅡ)与表面合成的SSEA-4六糖相互作用,而α2,3-SialT未处理表面则不起作用。二维空间)。结果表明,α2,3-SialT可将Neu5Ac转移到固定化GB5五糖中。最后,将含有α-1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-Fuct),聚岩藻糖(gdp-fuc)和MgCl的Tris-HCl(pH7.0)溶液孵育成球形H六糖。2在GB5五糖固定的表面上。然而,α-L-Fuc-特异性莲藕(LTL)凝集素与表面合成的Globo H六糖反应不佳。2E)。这一结果可能是由于ltl与含有fUCα1-2 galβ1-3(4)glcnac(Galnac)的大糖聚糖的结合能力较差。45.

图2:结构可切换的基于DNA的糖基芯片上的酶糖基化.

扫描原始图像和芯片上生物合成的定量强度图(a)Gb3三糖,(b)Gb4四糖,(c)GB5五糖,(d)SSEA-4六糖,和(e)Globo H六糖。用生物素化凝集素和Alexa荧光法检测合成的复合糖聚糖®647-结合链霉亲和素。每个值显示除最高信号和最低信号以外的49个独立点的平均±扫描电镜.统计学意义用学生未配对评估t试验(*)p < 0.0001). GS-IB4 [医]单叶狮鹫异链菌素B4、SBA大豆凝集素、RCA120 蓖麻凝集素I-凝集素,“仲裁示范法”第二条山楂凝集素II莲藕凝集素,LgtCα-1,4-半乳糖基转移酶,LgtDβ-1,3-N-acetylgalactosaminyltransferase/β-1,3-galactosyltransferase,α2,3-SialTα-2,3-唾液酸转移酶,α1,2-Fuctα-1,2-岩藻糖基转移酶.符号:蓝色圆圈,GLC;黄色圆圈,Gal;黄色方形,GalNAc;红色三角形,Fuc;紫色方形,Neu5Ac。标尺为800μm。源数据作为源数据文件.

片状糖基生物合成反应的优化

为了优化芯片上酶的糖化,每个反应都是在有足够数量的糖基转移酶和糖聚糖供体的情况下,通过改变反应时间来进行的。通过DNA变性从芯片表面回收生物合成产物,通过I-基序DNA的pH依赖性结构变化,用液相色谱法定量分析生物合成糖聚糖的转化效率。3A)。LgtC酶在37℃下在乳糖二糖固定化表面处理12、24和48h,酶解Gb3三糖的反应速度较慢,转化率为14%,但48h后,所有乳糖二糖在表面均转化为Gb3三糖(如图所示)。3B和补充图。12)。对于Gb4四糖的合成,将Gb3三糖固定化表面(37℃下LgtC反应48h)与LgtD酶反应。在LgtD反应中,约80%的Gb3三糖在12h内迅速转化为Gb4四糖,并在24 h内几乎完全转化成Gb4。3B和补充图。13)。与Gb3三糖相比,由于LgtD的催化活性高于LgtC,Gb4四糖在表面的合成速度更快。46。在制备的Gb4四糖固定化表面加入含UDP-Gal的LgtD溶液,合成GB5五糖。LgtD酶表现为β-1,3-N-Gb3三糖和UDP-GalNAc分别作为受体和供体时的乙酰半乳糖氨基转移酶活性44。当我们以gb4四糖为受体,udp-gal作为供体时,该酶还显示出β-1,3-半乳糖基转移酶的活性。47。不像用LgtD酶生物合成Gb4四糖,GB5五糖是在表面缓慢合成的,转化率为43%,反应时间为12h。3B和补充图。14)。即使在48h后,Gb4四糖合成GB5五糖的转化率为80%。因此,用相同量的LgtD从Gb4四糖中完全生物合成GB5五糖需要72h的时间。这可能是因为LgtD以Gb4四糖为受体的活性比Gb3三糖低得多。43。最后,利用α1,2-Fuct和α2,3-SialT在GB5五糖固定化表面上进行了Globo H六糖和SSEA-4六糖的生物合成.在优化的条件下,采用连续酶法制备了GB5五糖固定化表面。结果表明,在芯片表面24 h内,GB5五糖几乎完全转化为Globo H和SSEA-4六糖,这可能是由于这两种酶具有较高的催化活性。3B和附图。15, 16)48,49,50。为了检查在优化的条件下酶反应后芯片上是否有少量未反应的启动糖聚糖,我们分析了抗体结合到固定化糖聚糖与糖基转移酶反应的部位。3A)。由于缺乏商业上可用的抗乳糖和抗Gb4抗体,无法确定所有糖基化过程都已完成。然而,使用抗GB5、抗SSEA-4和抗Globo H抗体,我们证实在芯片上酶切合成Gb4四糖、SSEA-4六糖和Globo H六糖后,针对启动糖的抗体在芯片上处理时没有荧光(见图)。3C,d和补充图。17)。这些结果表明,片上酶糖化完全在所用条件下进行,重现性高(相对标准偏差0.9~3.4%)。

图3:结构可切换的基于DNA的糖聚糖芯片与芯片上的糖基生物合成相结合。

a在优化条件下,通过芯片上复杂的糖基生物合成构建了一种结构可切换的基于DNA的糖聚糖芯片的工作流程。通过对在酸性pH(4.5)条件下从芯片中分离得到的生物合成糖基聚糖进行生物LC分析,优化了芯片上酶糖基化条件。为了制备由Globo H及其相关结构组成的DNA糖基芯片,将乳糖-寡核苷酸共轭固定化表面划分为五个块,然后在优化的条件下用糖基转移酶进行处理。为了进行质量控制,以DNA为基础的糖聚糖芯片与针对起始材料和产品的抗体一起孵育。b辅料中六糖六糖的片上酶合成及相关结构的相对转化率定量分析。610。每个值显示除最高信号和最低信号以外的49个独立点的平均±扫描电镜.统计学意义用学生未配对评估t试验(*)p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001). Schematic illustrations and scanned raw images for on-chip enzymatic glycosylation of (c)SSEA-4六糖和(d在优化条件下(鳞片条:800μm)。用Dylight 650结合单克隆抗体或具有Alexa荧光的单克隆抗体检测合成的复合糖聚糖。®647-共轭多克隆次级抗体。抗GB5 Ab Dylight 650-结合抗GB5单克隆抗体,抗SSEA-4 Ab Dylight 650-结合抗SSEA-4单克隆抗体,抗Globo H Ab抗Globo H单克隆抗体(VK 9),α2,3-SialTα-2,3-唾液酸转移酶,α1,2-Fuctα-1,2-岩藻糖基转移酶。符号:蓝色圆圈,GLC;黄色圆圈,Gal;黄色方形,GalNAc;红色三角形,Fuc;紫色方形,Neu5Ac。源数据作为源数据文件.

抗Globo H抗体与芯片上生物合成Globo H相关复合物糖聚糖的相互作用分析

为了制备Gb3三糖、Gb4四糖、GB5五糖、Globo H六糖和SSEA-4六糖在乳糖二糖固定化芯片上的序列合成,并将其应用于抗体的相互作用分析,制备了Gb3三糖、Gb4四糖、GB5五糖、Globo H六糖和SSEA-4六糖。简单地说,将乳糖二糖固定的表面分为五个块,用糖基转移酶(S)和糖核苷酸(S)处理,分别合成Globo H六糖及其相关糖聚糖(图1)。3A)。研究了小鼠IgG抗Globo H单克隆抗体(VK9)对芯片上生物合成的Globo H相关复合物糖聚糖的相对结合特异性.已证实vk 9抗体与Globo H六糖有较高的结合亲和力,与其他Globo H类似物无交叉反应。51,52。扫描荧光成像显示,VK9与生物合成的Globo H六糖的结合亲和力比其他合成的糖聚糖高得多。4A,b),与先前报道的VK9的结合特异性一致。52。Globo H和SSEA-4六糖的荧光强度差异表明,Fuc结构在vk 9结合中起着重要作用,这一点得到了以往报道的支持。51,52。这些结果证实了在乳糖二糖固定化表面上成功地合成了Globo H六糖系列。

图4:结构可切换的基于DNA的糖聚糖芯片的应用。

a, b糖胶芯片上VK 9抗体结合糖胶的特异性分析。a扫描原始图像和(bVK9与生物合成Gb3三糖、Gb4四糖、GB5五糖、SSEA-4六糖和GloboH六糖结合的荧光强度图(标度:800μm)。c, dMCF-7乳腺癌细胞糖胶结合特异性分析。c扫描原始图像和(dMCF-7乳腺癌和MCF-10A正常乳腺细胞与芯片内生物合成Gb3三糖、Gb4四糖、GB5五糖、SSEA-4六糖和GloboH六糖结合的荧光强度图(标度:800μm)。每个值显示除最高信号和最低信号以外的49个独立点的平均±扫描电镜.统计学意义用学生未配对评估t试验(*)p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001). e用流式细胞术分析MCF-7乳腺癌和MCF-10A正常乳腺细胞与Globo H六糖结合的原理图。FACS分析(f)MCF-7乳腺癌和(g)MCF-10A正常乳腺细胞含六糖球状H。源数据作为源数据文件.

霍乱毒素B亚基与芯片上生物合成GM1相关复合物糖聚糖的相互作用分析

为了进一步验证基于dna结构的糖聚糖芯片用于芯片上复合糖聚糖生物合成的可行性,在优化的条件下,利用糖基转移酶在乳糖二糖固定化表面合成了gm1五糖及其相关的聚糖(补充表)。2和附图。1820)。与GM3三糖和GM2四糖不同,GM1五糖是以低效率合成的。这一结果是由于CgtB酶(17U/L)的催化活性较低,这与以前的研究一致。53。我们分析了霍乱毒素B亚基与GM1五糖相关复合物糖基生物合成在芯片表面的相互作用(附图)。21)。这一结果表明霍乱毒素B亚基对芯片上生物合成糖聚糖的内在选择性与以往的研究一致。5,19.

MCF-7乳腺癌细胞与芯片上生物合成Globo H相关复合物糖聚糖的相互作用分析

通过筛选癌细胞的糖基结合特性,可以发现基于糖基的靶标探针,并为癌细胞靶向有效的诊断和治疗提供了一个方向。为了验证一种基于DNA的糖聚糖芯片与芯片内糖聚糖生物合成相结合的可行性,我们分析了由六糖组成的Globo H系列糖聚糖芯片与MCF-7乳腺癌细胞的糖聚糖结合。Globo H系列糖聚糖芯片的构造如前所述。所有活细胞(4×10)5细胞/mL)加钙蛋白酶-AM染料染色于糖胶芯片上.McF-7乳腺癌细胞在芯片上强烈识别Globo H六糖,而MCF-10A正常乳腺细胞则不识别。4C,d)。这也得到了MCF-7癌和MCF-10A正常细胞的流式细胞分析的支持。4E-g)。除Globo H六糖外,两种细胞对其他生物合成的复合糖聚糖的结合亲和力相似。这些结果表明,六糖结合蛋白可以存在于mcf-7乳腺癌细胞上,这支持了先前的一项研究,该研究确定了癌细胞膜上六糖的主要结合蛋白。54。此外,用不同比例MCF-7癌细胞与MCF-10A正常细胞的混合物进行定量结合分析。随着MCF-7细胞与MCF-10A细胞比例的增加,糖聚糖芯片表现出较强的荧光强度(附图)。23).

在本工作中,我们清楚地证明了基于结构可切换的基于DNA的糖聚糖芯片平台同时能够实现复杂的糖聚糖的生物合成和对涉及到糖基的应用进行分析。为了其实际应用,有必要制备一种含有大量生物合成的复合糖聚糖的大规模糖聚糖芯片。因此,我们正在进行进一步的研究,通过与含有多通道的微流控系统相结合,设计出一种在芯片上合成大量糖聚糖的解决方案。微流控系统的引入具有以下优点:通过生物合成每个通道的不同的糖罐,在芯片上提供大量的糖罐,高效地再利用糖加工酶,以及最低限度地使用昂贵的试剂(如核苷酸糖)。基于结构可切换的基于DNA的糖聚糖芯片与微流控系统相结合,通过根据通道调节糖胶加工酶的组合,可以从固定在芯片上的简单糖聚糖中合成各种复杂的糖聚糖。考虑到各种酶的最佳反应条件,用户无需进一步纯化和与特定的连接剂结合,就可以很容易地制备出由多种复合糖聚糖组成的糖聚糖芯片。我们提出的平台将是有利的,因为它允许用户制造定制的糖聚糖芯片(微阵列),直接合成的芯片上的各种糖聚糖通过糖加工酶的组合。然而,这项技术还处于相对早期的开发阶段,最终产品是否以结构定义的形式存在着问题。因此,将进行进一步的工作,使我们提出的平台,一个(半)准备规模,能够进行全面的结构表征,最终甘露聚糖产品。我们预计,改进的平台将使糖聚糖芯片与芯片上生物合成的复合糖聚糖的实际应用。

特别是,基于结构可切换的dna芯片平台可用于分析单一芯片上各种糖基处理酶的活性,因为固定化糖聚糖可以通过pH响应的i-motif dna的结构变化而单独分离。我们预计,通过使用我们开发的糖聚糖芯片平台有效地筛选其活性,可获得的糖基加工酶的数量将增加。

总之,我们开发了一个基于I-motif dna连接物的糖聚糖芯片平台,该平台具有pH响应的结构变化,可以有效地对复合糖聚糖进行芯片内酶糖基化。结构的变化使我们能够可逆地控制生物合成的复合糖聚糖在表面的固定和分离。通过对生物合成糖聚糖的定量分析,优化了芯片上酶糖基化反应条件,克服了以往糖基化合成方法的局限性。在优化的条件下,利用几种糖基转移酶,从表面的乳糖二糖中成功地合成了Globo H六糖及其相关的复合糖聚糖。这一平台得到了额外的芯片上生物合成GM1五糖及其相关的复合糖的证实。所构建的含有Globo H六糖及其相关复合物的糖聚糖芯片被用于分析抗体和乳腺癌细胞的糖聚糖结合特性,清楚地证明了基于DNA的糖聚糖芯片与芯片上的糖基生物合成用于糖基生物分子和糖基细胞相互作用分析的可行性。因此,我们预计所开发的基于DNA的结构可切换的糖聚糖芯片平台将为高效合成复杂的糖聚糖和实现与糖聚糖相关的多种应用提供方向。


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