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环糊精主客体复合物载药治疗结直肠癌

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发表时间:2021-02-04 14:49作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

结直肠癌(CRC)的恶性程度与炎症和肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)有关,但有效的治疗手段有限。为了将靶向治疗与肿瘤微环境(TME)重组结合起来,我们研制了生物相容性的、非共价通道型纳米粒(CNPs),它是通过甘露糖修饰的γ-环糊精(M-γ-CD)与Regorafenib(RG)、RG@M-γ-CD CNPs的自组装和主-客体络合制备的。除了其载体作用外,M-γ-CD作为靶向装置参与了TME的调控.Rg@M-γ-CD CNPs通过靶向巨噬细胞抑制炎症反应并抑制其活化.它们还通过增强激酶抑制来改善RG的抗肿瘤作用。体内应用表明,通道型制剂优化了RG的药代动力学和生物分布。在结肠炎相关癌和CT 26小鼠模型中,RG@M-γ-CD被证明是一种靶向、安全和有效的抗肿瘤纳米药物,能够抑制肿瘤细胞的增殖、病变的新生血管化和TME的重塑。这些发现表明RG@M-γ-CD CNPs是一种潜在的治疗CRC的策略.

导言

结直肠癌(CRC)是最常见、最恶性的肿瘤之一,结肠切除联合化疗被认为是一种重要的治疗策略。然而,原癌基因和酪氨酸蛋白激酶受体的破坏性激活仍然是CRC治疗的主要挑战,尤其是对于无法切除的CRC肿瘤患者而言。1,2,3,4。近年来,通过引入靶向血管内皮生长因子(VEGF)/血管内皮生长因子受体(VEGFR)轴的生物制剂,如贝伐单单抗、非洛西普和瑞多拉非尼(Stivarga),提高了CRC化疗的疗效。®、RG)5,6。Rg是一种多激酶抑制剂,针对广泛的激酶参与血管生成和肿瘤发生,例如VEGFR-2、血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β),以及丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK),并为预防CRC的进展提供了重要的益处。7,8。此外,据报道,rg通过免疫球蛋白和表皮生长因子同源区2(Tee 2)信号阻断酪氨酸激酶,有效地减少了肿瘤相关巨噬细胞(Tams)在结直肠癌中的浸润,从而促进了对肿瘤转移的完全抑制。9,10。尽管取得了这些显著进展,但RG的药物特性(即溶解度、溶出度、通透性、循环和分布)较差,影响了治疗结果和副作用。11,12。因此,需要优化RG的药代动力学,提高RG的生物利用度,以达到对CRC的有效治疗效果。

异质性肿瘤微环境(TME)作为癌症的标志之一,是实现最佳治疗效果的另一个障碍。13。在大肠癌的TME中,大量的肿瘤支持因子,如VEGFs、PDGFs、基质金属蛋白酶(MMPs)等,可促进肿瘤细胞的存活、致病性血管生成和细胞外基质沉积。这些动态过程支持了肿瘤生态位的构建,加速了肿瘤的侵袭转移级联。近年来的研究表明,肿瘤支持因子可以在化疗过程中保护和支持crc干细胞的存活,影响治疗效果。14。另一方面,慢性炎症参与了大肠癌的发病机制,尤其是结肠炎相关结肠癌(CAC)的发病机制。在tme中过量的炎性细胞因子,包括白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6),持续激活一些转录因子,如核因子-转录因子B(NF-κB)、信号转导子和转录激活因子3(STAT 3)。15,16。这些转录活性在结肠癌的各个阶段都起着重要的中介作用,同时炎症反应也会阻碍治疗反应。研究表明,tme内的促炎细胞因子tf-α可诱导癌细胞靶表达异常,从而影响靶向治疗。17。越来越多的证据表明,CRC的异质性TME主要是由交替激活的结肠巨噬细胞建立的。在结肠固有层中,巨噬细胞维持促炎表型,将炎症与息肉病或癌变联系起来。当与crc细胞一起培养时,结肠巨噬细胞获得肿瘤前表型(M2),与癌细胞双向沟通以促进crc的进展。18,19,20...临床研究表明,传统治疗后TAM人群明显增多,防止TAMS的发生可提高化疗或放疗的临床疗效。因此,通过减轻炎症和调节TAM极化来重新规划TME已成为CRC治疗的一个有趣的治疗靶点。

纳米医学为优化CRC治疗提供了一个多样化的工具箱,实现了标准的CRC化疗药物(即5-氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康)和靶向药物(如索拉非尼布、瑞多拉非尼布)的高效交付。21,22,23。此外,新兴的纳米药物也证明了对TME进行重新编程。据报道,通过激酶抑制剂或CSF-1R抑制剂的靶向传递,M2 TAMs的再极化或耗竭可提高CRC的化疗疗效。10,24。近年来,纳米设计已经被证明可以通过消除活性氧、释放多酚分子和释放抗炎药来对抗结直肠环境中的炎症。25,26,27。然而,将TAM失活与炎症正常化相结合的策略还没有被报道。此外,实现肿瘤抑制和TME再编程的协同作用仍然是纳米医学领域的一个重大挑战。

甘露糖受体(MR)是一种高效的内源性细胞受体,其作用是通过甘露糖末端促进分子或纳米粒的细胞内化和转运。考虑到大肠癌细胞和结肠巨噬细胞表面均过表达mr。28,29甘露糖修饰或甘露糖加成是一种有效的双靶向策略,可植入CRC特异性纳米药物的设计中。

环糊精(CDS)是一种具有亲水腔外和疏水腔内部的生物相容性大环两亲分子。这种性质是它们作为宿主分子包封在腔内的疏水分子的能力的主要原因。30。以cd为基础的主客体包合物在药物应用中得到了广泛的应用,以优化药物的性能。31,32,33。此外,cds还被用作构建纳米结构材料的良好基石,为癌症治疗提供了新的机会。34,35,36。值得注意的是,最近有几项研究表明cds启动了抗炎机制。37,38,39。在动脉粥样硬化模型中,cd已被证明能提高胆固醇的去除率。40。此外,它还通过介导肝脏X受体(LXR)巨噬细胞转录,导致促炎症细胞因子(IL-1β,IL-6,TNF-α)的表达下调,促进动脉粥样硬化的消退.其抗炎作用扩大了CdS的应用范围,为CD基纳米医学提供了新的应用前景。

在此,我们提出了一种基于主客体分子识别和非共价自组装的纳米药物。在我们的设计中,使用γ-CD和RG作为分子模块来构建人工伴侣(如图所示)。1)。为了使γ-CD具有靶向性,将其修饰为甘露糖,得到一种功能化的宿主分子甘露糖-γ-CD(M-γ-CD).基于分子识别基元,M-γ-CD将RG封装在其腔内,形成连锁分子RG@M-γ-CD。值得注意的是,RG@M-γ-CD具有较高的自组装性,并形成具有通道结构的纳米粒子(通道型纳米粒子).我们的研究表明,甘露糖修饰和纳米级、非共价通道结构改善了RG的生物分布、药代动力学和药物特性。更重要的是,CD的抗炎作用被植入纳米药物中,与RG发挥协同作用,重塑CRC的TME。在CAC和CT 26模型中,RG@M-γ-CD CNPs具有很强的抗肿瘤作用,并将载体的化学基元与其生物学功能结合起来,为纳米药物的设计提供了一种有效的途径。

图1:Reorafenib@甘露糖-γ-环糊精通道型纳米粒(简称RG@M-γ-CD CNPs)的设计及其协同抗CRC作用机理。

Rg@M-γ-CDCNPs通过增强Reorafenib激酶的抑制作用和发挥环糊精的生物学功能,抑制肿瘤细胞存活,抑制肿瘤血管生成,减轻炎症反应,抑制肿瘤相关巨噬细胞的活化。

结果

RG@M-γ-CD CNPs的制备与表征

RG@M-γ-CD主客体配合物的制备如图所示.2A...以1,1‘-羰基二咪唑为交联剂,将甘露糖与γ-CD偶联41,42,43。如核磁共振(NMR)谱所示(附图)。110和补充表13甘露糖的C1‘与γ-CD的C6发生结合,取代率控制在1:1(甘露糖:γ-CD)。通过比较甘露糖中α-/β-失配体的化学位移与M-γ-cd在H中的化学位移2O,发现α-失范是在M-γ-cd(补充表)中形成的。3)。以M-γ-CD为主体分子,用共结晶法(RG@M-γ-CD)制备包合物.由于主-客体络合是一个非共价分子识别的动态过程,通过加热和搅拌来增强非共价相互作用,加速包合物的形成。44。经络合后,用核磁共振和质谱对RG@M-γ-CD进行了表征,证实了主-客体包合物的结构.在……里面1h和13RG@M-γ-CD(附图)的cNMR谱。1115),M-γ-CD和RG的峰值共存,并执行完全赋值以确认RG@M-γ-CD(补充表)的完整性。45)。在二维核超豪泽效应(NOE)谱(图)。二维空间和补充图。16(1)RG(H17“和H19”)的酰胺质子与M-γ-CD(H1(H1‘)-H4(H4’))的糖原(H1(H1‘)-H4(H4’))之间存在NOE相关信号;(2)RG(H2“,H24”和H25“)的苯质子和M-γ-CD(H3‘)的糖原(H3’),反映了主客体分子之间的络合作用。MS分析进一步测定了RG@M-γ-CD包合物的分子量.合成的M-γ-cd在M/z 1502.4606, M/z1525.4503及M/z1541.4243,相对于mW[M-γ-CD],MW[M+Na]的加合物+和MW[M+K]+,分别确认单次替换(图1)。2B和补充图。6)。有一个强烈的信号M/zRg@M-γ-cd的MS谱中的1965.6228,对应于mw[M-H]2O-H](无花果)2C和补充图。13)。这些结果表明M-γ-CD与RG在化学计量比为1:1时发生了主-客体络合反应.

图2:RG@M-γ-CD的合成及化学表征。

aRG@M-γ-CD的合成过程,包括1,1‘-羰基二咪唑(简称CDI)激活γ-CD(上),γ-CD与甘露糖的功能化(中)和包合物的构建,RG@M-γ-CD(下)。b, cM-γ-CD和RG@M-γ-CD的ESI-TOF-MS分析.dRG@M-γ-CD二维NOESY谱的部分放大。eRG,M-γ-CD,无通道型RG@M-γ-CD,通道型RG@M-γ-CD和受激通道型γ-CD的X射线衍射图谱.γ-CD与通道型结构叠加的示意图。用透射电镜和原子力显微镜对装配过程进行跟踪观察。f尺寸为20-50 nm的纳米棒;g尺寸为50-100 nm的纳米圆柱石,以及h粒径为100~300 nm的纳米球。iRG@M-γ-CD CNPs的DLS结果.j游离RG,M-γ-CD,RG@γ-CD和RG@M-γ-CD在甲醇中的紫外-可见光谱.kRG@M-γ-CD CNPs在不同条件下的控释谱.N=每组3次复制。数据以均值±SD表示。源数据作为源数据文件提供。

主-客体络合后,Rg@M-γ-CD在水溶液中自发地进行二次组装,形成具有沟道结构的高阶拓扑结构。RG@M-γ-CD CNPs在2θ=7.9°、15.4°、16.2°、17.1°等处,可确定沟道型结构,与RG或非晶态RG@M-γ-CD的衍射峰不同。2E)。这些峰被证明反映了四方空间群p42中的通道堆积。12,由γ-cd的器件基元驱动。45,46,47。在通道结构中,Cd的包裹体分子以氢键的形式线性地堆积在一起,组装成包括客体分子在内的“无限”通道。RG@M-γ-CD CNPs的热重和差示扫描量热图表明RG的本征吸热消失,可能是由于在络合和组装过程中的晶体重排(附图)。17A, b).

利用透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)对组装过程进行了跟踪。2Fh)。Rg@M-γ-CD首次自组装成棒状结构(20-50 nm).经过搅拌和超声波处理,纳米棒形成三维叠加,转化为纳米棒(50-100 nm)。它们最终形成纳米球,主要分布在100-300 nm。动态光散射(DLS)测量结果与形态学观察结果吻合较好。2I)。Rg@M-γ-cd cnps的紫外-可见光谱在260 nm处有一个特征吸光度,消光系数为2×10。4 M−1厘米−1,相对于等效RG,呈现出10 nm的低色差。这一差异是由RG(自由/封闭)的不同状态造成的(如图所示)。2J).

在不同条件(含10%血清、模拟消化液)下,用透射电镜和动态光镜观察RG@M-γ-CD CNPs的稳定性。37℃孵育24h后,在含血清(pH7.4)的PBS中CNPs的粒径分布基本稳定(附图)。17C)。在模拟胃液(pH1.4)和肠液(pH7.8)中,由于CNPs的部分解离,中位直径迁移到90~110 nm。17D)。24小时后监测含血清PBS和刺激消化液中Rg的释放。2K)。累积释药曲线证实了RG@M-γ-CD CNPs在含血清PBS中的稳定性,释放率为16.2%~21.4%。与此相比,刺激消化液的药物释放率提高到24.3%~35.6%。在α-淀粉酶(100 U/mL)存在下,释放率大大提高,达到76.2~85.4%(附图)。18)。作为一种环状低聚糖,γ-cd可被α-淀粉酶降解。48,这将加速CNP的解离和药物的释放。有趣的是,RG@M-γ-CD CNPs在亲脂环境中表现出持续释放.由于Cd的两亲性,非共价通道型结构很容易被亲脂分子破坏,从而导致cnps的崩溃和随后的药物释放。

体外靶向给药及抗肿瘤作用

鉴于rc细胞表达mr的事实,γ-cd的甘露糖修饰可以作为一种有效的靶向策略。28。以罗丹明(Rho)为指示剂,用M-γ-CD或γ-CD配制成CNPs。1930和补充表69)。然后用共聚焦激光扫描显微镜和荧光激活细胞分选技术研究Rho@M-γ-CD和Rho@γ-CD CNPs的细胞内化。如图所示。3A, bRho@M-γ-CD组细胞内荧光累积量较高,说明细胞内有更有效的内化作用(图1)。3C)。用游离甘露糖预处理细胞后,内化Rho@M-γ-CD诱导的荧光积累明显减少(附图)。31证实了基于M-γ-CD的CNPs的靶向性来源于CNPs的甘露糖基与CRC细胞MR的特异性结合。

图3:RG@M-γ-CD CNPs体外抗肿瘤作用。

CNPs细胞内化a, b用Rho@M-γ-CD和Rho@γ-CD CNPs(相当于RHO,5.0μM)培养的CT2 6和HT 2 9细胞有代表性的CLSM图像,蓝色荧光显示用DAPI染色,绿色荧光用FITC-抗体标记β-actin染色,红色荧光显示CNPs内化。刻度棒,20μm。c内化Rho@M-γ-CD和Rho@γ-CD(等效Rho,5.0μM和10.0μM)诱导CT2 6和HT 2 9细胞内荧光强度的流式细胞分析及统计结果4细胞/样本)。N=3次生物复制。数据以均值±SD表示。统计显着性是用双尾未配对计算的。t-测试(rho@M-γ-cd与rho@γ-cd在相同的rho浓度下,确切地p数值如图所示)。d不同剂型(当量RG,0.5~10.0μM)对HT 26和HT 29细胞的体外细胞毒作用12h。N=5次生物复制。数据以均值±SD表示。统计显着性采用双向方差分析和Tukey的多重比较检验(精确性检验)。p数值如图所示)。分别用BrdU法和AnnexinV-PI法检测不同剂型(相当于RG、2.0μM)对CT26和HT 29细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用。e有代表性的FACS分析和f治疗组增殖率统计结果。N=3次生物复制。数据以均值±SD表示。g有代表性的FACS分析和h治疗组细胞凋亡率的统计结果。N=3次生物复制。数据以均值±SD表示。i不同剂型处理的人脐静脉内皮细胞体外成管的典型图像(当量RG,2.0μM)。标尺,50μm。N=3次生物复制。数据以均值±SD表示。统计意义f, h,和i采用单因素方差分析和Dunnett的多重比较检验(*)进行计算。p≤0.05,**p≤0.01,*p≤0.001,*p≤0.0001,治疗组与对照组p值显示在源数据文件中)。j不同剂型(等效RG,2.0μM,6h)对内皮细胞VEGFR-2和PDGFR-β磷酸化的Westernblot分析。图像是三个独立实验的代表。源数据作为源数据文件提供。

我们接下来评估RG@M-γ-CD对大肠癌细胞的体外抗肿瘤活性(附图)。3233)。用RG、M-γ-CD、RG与M-γ-CD(表示为混合)、RG@γ-CD和RG@M-γ-CD在相同浓度的RG处理CRC细胞.在4小时内,这些制剂表现出类似的致死作用。治疗12h后,与游离RG相比,RG@γ-CD和RG@M-γ-CD诱导细胞死亡的比例明显增高。三维空间)。特别是Rg@M-γ-cd cnps的半数最大抑制浓度(IC 50)显著降低到2.63~3.04μM(补充表)。1011)。CNPs的增量抑制作用来源于其为CRC细胞摄取和持续药物释放量量身量身定做的纳米结构。用胞浆提取物(~20%v/v)孵育RG@γ-CD和RG@M-γ-CD CNPs,用高效液相色谱法测定释放的RG。34)。在12h内,RG@γ-CD和RG@M-γ-CD释放的RG分别为64.4±11.7%和71.5±6.6%.结合活性CRC靶向能力,RG@M-γ-CD CNPs显著提高了RG的药物利用度.

用westernblot和流式细胞术进一步阐明RG@M-γ-CD CNPs的抑制机制.对ERK活化的研究表明,RG@M-γ-CD处理可使大肠癌细胞的ERK磷酸化降低48.6±7.5%,即使在低浓度时也是如此(补充图)。35),这意味着对CRC细胞的增殖有很强的抑制作用。溴脱氧尿苷(BrDU)检测证实RG@M-γ-CDCNP处理可明显抑制大肠癌细胞的增殖(CT 26和HT 29分别为6.9±3.3%和12.8±4.5%)。AnnexinV/PI进一步表明RG@M-γ-CDCNP能有效地抑制大肠癌细胞的存活,诱导细胞凋亡的比例明显高于其他两组(分别为47.7±5.3%和40.8±7.4%)。3Eh)。这些结果表明,RG@M-γ-CD CNPs能增强RG的激酶抑制作用,并能有效地抑制大肠癌细胞的恶性。

VEGF/VEGFR信号通路参与了大肠癌的血管生成和转移,是CRC的重要治疗靶点。因此,用试管形成法评估RG@M-γ-CD的抗血管生成能力.将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)接种于三维基质中,用不同的制剂进行处理。在6h内,对照组和M-γ-CD组出现了丰富的管状分支.3I)。与RG或MIX治疗相比,RG或MIX具有中等程度的抗血管生成作用,使血管形成减少25.7±8.2%。RG@γ-CD和RG@M-γ-CD CNPs对管状形成有明显的抑制作用,其中RG@M-γ-CD CNPs的抗血管生成作用最强,使管数减少72.5±10.7%。与抑制血管生成相一致,RG@γ-CD和RG@M-γ-CD CNPs明显阻断受体酪氨酸激酶VEGFR-2和PDGFR-β的激活,而RG或MIX未能实现这一目标。3J)。这些数据表明,M-γ-CD衍生纳米药物大大提高了RG的药物活性,而主客体组装的纳米药物通过抑制大肠癌细胞的存活和阻断血管生成而发挥抗肿瘤作用。

RG@M-γ-CD对巨噬细胞的体外调节作用

根据以前报道的CdS的抗炎特性,我们接下来研究RG@M-γ-CD CNPs是否能通过靶向巨噬细胞来减轻炎症。我们从C57BL/6小鼠中分离出腹腔巨噬细胞(PMs),并首次用CLSM和FACS(图1)探讨了PMs的内化作用。4A, b)。PMS先用绿色荧光抗CD 206抗体显影,然后用Rho@M-γ-CD和Rho@γ-CD处理2h,如预期的那样,用绿色荧光来描绘PMs的轮廓,证实其表面表达MR。内化CNPs可诱导细胞内红荧光。Rho@M-γ-CD组荧光积累明显高于Rho@γ-CD组.流式细胞术显示Rho@M-γ-CD的平均荧光强度比Rho@γ-CD组增加88~93%。结果表明,M-γ-CD基CNPs具有MR靶向能力,Rho@M-γ-CD易于被巨噬细胞吞噬。

图4:RG@M-γ-CD对巨噬细胞的体外调节作用。

巨噬细胞对CNPs的细胞内化。a用Rho@M-γ-CD和Rho@γ-CD CNPs(等效Rho,5.0μM)培养2 h腹腔巨噬细胞的典型CLSM图像:蓝色荧光标记DAPI染色,绿色荧光标记甘露糖受体染色,FITC-抗体染色,红色荧光显示CNPs内化。刻度棒,20μm。b内化Rho@M-γ-CD和Rho@γ-CD(等效RHO,5.0和10.0μM)诱导腹腔巨噬细胞内荧光强度的流式细胞分析及统计结果(2×10)4细胞/样本)。N=3次生物复制。数据以均值±SD表示。统计显着性是用双尾未配对计算的。t-测试(rho@M-γ-cd与rho@γ-cd在相同的rho浓度下,确切地p数值如图所示)。c腹腔巨噬细胞分离、刺激和表型评估示意图。腹腔巨噬细胞经不同剂型处理24h,再与LPS、IL-4或肿瘤上清液孵育2h,取细胞及培养基进行表型鉴定。d不同剂型(等效RG,0.5μM)腹腔巨噬细胞的促炎细胞因子mRNA表达水平。N=3次生物复制。数据以均值±SD表示。e不同处理对巨噬细胞p-p65、p65和ABCA 1表达的Westernblot分析。图像是三个独立实验的代表。f不同处理(当量RG,0.5μM)下巨噬细胞M2相关标记的mRNA表达水平。N=3次生物复制。数据以均值±SD表示。gMRNA表达水平血管内皮生长因子-B, PDGF-α,和MMP-9巨噬细胞在不同处理下(当量RG,0.5μM)。N=3次生物复制。数据以均值±SD表示。统计意义d, f,和g采用单因素方差分析和Dunnett的多重比较检验(*)进行计算。p≤0.05,**p≤0.01,*p≤0.001,*p≤0.0001,治疗组与对照组p值显示在源数据文件中)。源数据作为源数据文件提供。

然后用不同的方法处理24h(相当于RG含量0.5μM),然后用脂多糖(LPS)刺激引起炎性细胞因子的分泌(图1)。4C)。采用定量RT-PCR和ELISA法检测典型的CRC相关炎性细胞因子的水平。49,包括IL-1β,IL-6和TNF-α(图1).4D和补充图。36)。与对照组相比,M-γ-CD、MIX、RG@γ-CD和RG@M-γ-CD处理不同程度地下调了IL-1β、IL-6和TNF-α的表达.特别是rg@m-γ-cd处理表现出明显的下调作用。IL-1β, 伊-6,肿瘤坏死因子-α,mRNA水平降低14~22倍。与RG@M-γ-CD CNPs相比,RG@M-γ-CD CNPs对甘露糖的抑制作用较弱.相反,游离RG对这些细胞因子的抑制作用不大,提示M-γ-CD在抗炎中起关键作用.为了进一步研究RG@M-γ-CD对PMs的调节作用,对调节炎症的关键转录因子NF-κB的激活进行了研究。Westernblot检测p65(p-p65)的磷酸化。如图所示。4E与对照组相比,M-γ-CD对p-p65有明显的抑制作用.此外,将M-γ-CD的抗炎作用植入RG@M-γ-CD CNPs中,对p-p65也有较强的抑制作用。与cds通过介导lxr转录发挥抗炎作用的概念一致。39M-γ-CD和RG@M-γ-CD也能增强PMs中的LXR靶基因ABCA 1.与RG@M-γ-CD CNPs相比,RG@γ-CD CNPs在p65磷酸化方面表现出次优的中介作用,可能是由于缺乏MR靶向能力。这些数据表明,纳米工程的RG@M-γ-CD CNPs维持并进一步放大了CdS的抗炎性能,显示了减轻炎症治疗的潜力。

一旦被crc细胞激活,TAMS主要表现为M2表型,并致力于通过产生一系列细胞因子(如VEGFs、PDGFs和MMPs)来建立支持肿瘤的tme。46,504F)。我们还研究了RG@M-γ-CD是否能通过减少M2细胞支持肿瘤细胞因子的产生而使M2细胞失活。PMS先用不同的制剂,然后激活分泌支持肿瘤的细胞因子(即VEGF-B、PDGF-α和MMP-9)。RT-PCR和ELISA定量显示RG@M-γ-CD处理明显降低了这些细胞因子的表达.与之相比,RG、MIX和RG@γ-Cd处理的降低幅度相对较小,而M-γ-Cd处理的效果较小。4G和补充图。36)。总之,我们的结果表明RG@M-γ-CD CNPs通过减少炎性细胞因子和抑制M2活化而对巨噬细胞具有双重调节作用。

RG@M-γ-CD对CAC小鼠模型的治疗作用及安全性

摘要CAC是crc的一种亚型,以慢性炎症和加速性肿瘤为特征,抗炎治疗与常规治疗相结合可预防CAC的发生。51。在RG@M-γ-CD CNPs的体外实验中,我们评价了RG@M-CD CNPs在小鼠结肠肿瘤发生中的体内治疗效果。我们首先以游离Rho、Rho@γ-CD和Rho@M-γ-CD为指标,通过口服灌胃评价CNPs的肠滞留情况。与Rho@γ-CD和Rho@M-γ-CD CNPs相比,RHO在给药后24h内肠内蓄积低,衰减快。两种CNPs的Rho荧光在肠内逐渐积累,在给药后12h达到最高。24小时后,仍能检测到大量的荧光,表明镉基纳米制剂促进了肠道滞留(图一)。5A)。体外荧光显像显示CNPs主要分布在肠道,胃内分布较低。在模拟胃液稳定性研究的基础上,认为CNP制剂对胃酸水解有一定的保护作用,且易于在肠道内积累。此外,肝脏和肾脏的弱荧光强度可能提示肝脏第一次代谢减少(如图所示)。5B和补充图。37)。以上结果表明,CNP制剂是一种理想的结肠给药制剂。

图5:RG@M-γ-CD对CAC小鼠模型的治疗作用。

用体内外成像方法观察了Rho、Rho@γ-CD和Rho@M-γ-CD CNPs在C57小鼠体内的生物分布。a代表体内外荧光图像和平均荧光强度在不同时间点(等效Rho,10μg/g)标尺,2.0cm。N=3只小鼠,每组在每一时间点均不依赖生物。数据以均值±SD表示。bRho@M-γ-CD CNPs给药后2 h、6 h、12 h和24 h主要器官的代表体内荧光显像。图像代表了三只独立于生物的小鼠。c基于AOM-DSS方法的CAC小鼠模型建立示意图。变化d体重和e不同治疗组在造模和抗肿瘤实验中的疾病活动指数(等效Rg,10μg/g)。N=10只无生物学依赖性的小鼠。数据以均值±SD表示。f有代表性的结肠图像,结肠长度来自不同的治疗组。N=5只无生物学依赖性的小鼠。数据以均值±SD表示。g不同治疗组荷瘤结肠组织的典型图像。红色箭头显示肿瘤区域。h肿瘤负荷数,i肿瘤体积j治疗组肿瘤平均大小。gj N=6只小鼠,每组6只。数据以均值±SD表示。统计意义a, f, hj采用单因素方差分析和Dunnett的多重比较检验(*)进行计算。p≤0.05,**p≤0.01,*p≤0.001,*p≤0.0001,治疗组与对照组p值显示在源数据文件中)。源数据作为源数据文件提供。

我们接下来通过口服RG@M-γ-CD CNPs在CAC小鼠模型中观察RG@M-CDCNPs的体内抗肿瘤作用。用偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸钠(DSS)建立化学诱导C57BL/6小鼠结肠肿瘤模型。5C)52。在肿瘤发生过程中,小鼠体重减轻,结肠炎病理表现为便血、低温、结肠变短,疾病活动指数(DAI)增至10(图1)。5D, e)。M-γ-CD、MIX、RG@γ-CD和RG@M-γ-CD与未处理的小鼠相比,可减轻出血,保存结肠长度,降低DAI,提示结肠炎减轻。其中RG@M-γ-CD组DAI最低(5.8±0.5),与正常结肠长度相当.相反,RG治疗对结肠炎影响不大,DAI和结肠长度与未治疗小鼠相似(图1)。5F)。然后对结肠中的肿瘤负荷进行计数和测量(如图所示)。5G, j)。M-γ-CD治疗虽能缓解结肠炎,但对肿瘤进展无明显抑制作用.Rg组和混合组肿瘤数目减少,但肿瘤以大体积(8~13 mm)为主。3)。这一结果归因于RG的生物药物限制,阻碍了其抗肿瘤作用。Rg@γ-cd cnps提高了rg的抗肿瘤作用,使rg@γ-cd组的肿瘤平均体积减少到10 mm以下。3...与之相比,rg@m-γ-cd治疗进一步减少了肿瘤的数量和体积(小于6mm)。3)由于结肠肿瘤细胞具有靶向性,对恶性肿瘤有显著的治疗作用。此外,RG@M-γ-CD治疗明显延长模型小鼠的存活时间,与其他治疗相比(补充图)。38)。提示RG@M-γ-CD CNPs可作为治疗CAC小鼠模型的理想平台。非共价通道结构提供了系统的稳定性和结肠特异性药物传输的优势。此外,该二元体系还发挥协同作用,减轻炎症和抑制肿瘤的进展。

我们进一步检查了口服RG@M-γ-CD CNPs的安全性.健康小鼠口服10μg/g不同剂型,每次3次。在给药后21天,RG@M-γ-CD CNPs处理的小鼠与未治疗的小鼠相比,显示了与肝肾功能相关的生化标记物水平。相反,RG或MIX给药会导致包括丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶在内的一些参数的改变,这意味着肝功能异常(附图)。39A)。组织学分析进一步评估安全性。用RG或MIX处理小鼠肝脏的H&E切片显示部分血管被红细胞所充血,并可见水肿区,表明肝脏有一定程度的损伤。相反,RG@M-γ-CD组的肝脏切片显示有规则的血管和外观,没有异常变化(补充图)。39B)。这些结果提示,以M-γ-CD为基础的环磷酰胺系统可以降低RG引起的肝毒性,为口服给药提供了更安全的策略。

RG@M-γ-CD对CAC小鼠模型的抗肿瘤作用机制

为了进一步了解RG@M-γ-CD CNPs治疗CAC小鼠模型的作用机制,我们从RG@M-γ-CD和PBS两组中研究了RG@M-γ-CD和PBS的全基因变异。共鉴定出587个差异表达基因(p < 0.01, fold change cutoff > 1.5, hypergeometric test), including 202 upregulated genes and 385 downregulated genes (Fig. 6A和补充图。40)。基于生物过程和KEGG途径的基因本体富集分析(GOEA)分析差异表达基因。6B, c)。RG@M-γ-CD治疗后,参与转运、代谢和细胞反应的基因被上调,表现为“对外界刺激的反应”、“受体介导的内吞作用”、“小泡介导的运输调控”、“葡萄糖代谢过程”、“对有机环化合物的反应”和“药物代谢过程”等。这些GO簇描述了RG@M-γ-CD CNPs在内化、转化和代谢过程中的作用机制.进一步研究发现RG@M-γ-CD对Go中的“蛋白酪氨酸激酶活性”、“跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性”、“生长因子受体信号通路”和“MAPK信号通路”等关键基因具有负调控作用。这种对酪氨酸活性的负调节可能与血管生成受损以及对癌细胞的抑制有关(如“凋亡”和“对细胞周期的负调控”)。免疫组织化学染色证实RG@M-γ-CD CNPs具有系统的抗肿瘤作用。6d)。TUNEL染色显示RG@M-γ-CD组结肠肿瘤切片有明显的细胞凋亡.相比之下,RG、MIX和RG@γ-CD组凋亡细胞稀少,对恶性肿瘤的抑制作用有限.同样,Ki 67染色显示RG@M-γ-CD处理可显著降低细胞增殖,而其他处理未能达到这一目的。用CD 34染色观察各组新生血管形成情况。RG@M-γ-CD组血管数目明显减少,提示RG@M-γ-CD治疗可抑制肿瘤血管生成.

图6:RG@M-γ-CD CNPs在CAC小鼠模型中的体内抗肿瘤机制。

a差异表达(DE)基因热图参与TME介导和肿瘤抑制(RG@M-γ-CD与对照)。b差异表达DE基因的GOEA可视化为GO网络,其中具有不同颜色的节点根据连接的GO项表示聚类。这些专题组用一个共同的通用术语手工标注。c与肿瘤抑制相关的DE基因直方图(左侧)和基于GO注释的TME(右侧)中介(−log 10)pacN=3只无生物学依赖性的小鼠。统计显着性是用未配对的双尾计算的。t-测试。折叠更改≥2.0p以≤0.0 5值作为DE基因分析的阈值。d不同治疗组CAC肿瘤组织TUNEL、Ki 67和CD 34染色切片的典型图像。标度棒,50μm,每组3只具有生物学独立能力的小鼠。e炎性细胞因子mRNA表达水平IL-1β, 伊-6,和肿瘤坏死因子-α)和M2相关的支持性肿瘤细胞因子(血管内皮生长因子-B, PDGF-α,和MMP-9)不同治疗组的CAC肿瘤组织。N=3只无生物学依赖性的小鼠。数据以均值±SD表示。统计显着性采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验(*)。p≤0.05,**p≤0.01,*p≤0.001,*p≤0.0001,治疗组与对照组p值显示在源数据文件中)。f代表不同治疗组CAC肿瘤组织CD11b、CD 80和CD 206染色切片的免疫荧光图像。标度棒,50μm,每组3只具有生物学独立能力的小鼠。g不同治疗组CAC肿瘤组织VEGF染色切片的代表图像。标度棒,50μm,每组3只具有生物学独立能力的小鼠。源数据作为源数据文件提供。

GOEA还阐明了RG@M-γ-CD CNPs对CAC肿瘤TME的调节作用.Rg@M-γ-CD治疗显著降低炎症介质的基因产生,包括IL1β, IL6, IL 17, Tnfrsf, NFκb1,以及一些类似收费的受体(TLRs)和TLR适配器。这些基因在炎症与癌症的联系中起着至关重要的作用,如“Toll样受体信号通路”、“Jak-stat信号通路”和“NF-κB信号通路”等。RT-PCR定量显示RG@M-γ-CD治疗可抑制荷瘤结肠组织中炎性细胞因子的表达,证实结肠炎症的缓解.值得强调的是,M-γ-CD治疗也显著降低了炎性细胞因子的表达水平,提示M-γ-CD可作为一种具有抗炎作用的药物载体。6E)。此外,与免疫细胞分化相关的基因,包括老总, CXCL 1, CD 59, Arg 1, IL4, Mmp8, YM2,和CSF 1RG@M-γ-CD处理后,等人受到调节.以“白介素-4和13信号”、“髓样白细胞分化”和“干扰素γ信号”为代表的分化调控可能影响TAM极化。采用抗F4/80抗体、抗CD 206抗体和抗CD 80抗体对不同治疗组的结肠肿瘤切片进行免疫荧光分析,以评价肿瘤的TAM谱。如图所示。6f和补充图。41,M2 TAMS显著减少(F4/80)+CD 206+CNP组结肠肿瘤细胞(RG@γ-CD和RG@M-γ-CD)与对照组比较。同时减少M1塔姆(F4/80)的入渗量+CD 80+在RG@γ-CD组和RG@M-γ-CD组均观察到细胞的变化.FACS分析还表明CD 206在结肠固有层巨噬细胞(F4/80)中的表达。+CD11b+肿瘤区域的子集明显减少(附图)。42)。这说明RG@γ-CD和RG@M-γ-CD CNPs通过使TAMS失活来调控CAc肿瘤的TME,RG@M-γ-CD CNPs的失活作用最强。

与M2相关的肿瘤支持因子的表达水平,血管内皮生长因子-B, PDGF-α,和MMP-9,经RG@M-γ-CD处理后,被确定为明显下调(如图所示).6E)。由于M2相关细胞因子与耐药相关,且与预后不良有关,有效的M2灭活RG@M-γ-CD CNPs可能对提高疗效有重要意义。RG@M-γ-CD组肿瘤切片中VEGF-B蛋白表达也明显降低,胞外区阳性区域较其他组明显减少(图1)。6g)。总的来说,这些发现有助于建立RG@M-γ-CD协同靶向恶性细胞和异质TAMS对抗CAC的机制。

RG@M-γ-CD对CT26小鼠模型的治疗作用

接下来我们评价RG@M-γ-CD CNPs在CT26肿瘤模型中的抗肿瘤效果。7A)。通过监测血浆药物浓度和定量药物在组织中的积累,首次研究了药物的药代动力学和生物分布。给荷瘤小鼠注射rg、rg@γ-cd和rg@M-γ-cd,剂量为10μg/g,血浆浓度测定结果表明,rg@γ-cd和rg@M-γ-cd具有2.38~3.45倍的抗肿瘤作用。0-24与RG比较,证实了经络型纳米制剂能延长血液循环,减少血流量。7b)。生物分布分析表明,注射后2h肿瘤组织中RG@γ-CD和RG@M-γ-CD CNPs迅速积累,肿瘤组织RG浓度是游离药物的1.8~2.7倍。注射24h后,游离RG消失,肿瘤蓄积可忽略不计。与之相比,RG@γ-CD和RG@M-γ-CD CNPs在肿瘤部位仍保持相对较高的药物浓度(1.4~2.3μg/g),原因是CNPs的通透性和保留作用增强。尤其是RG@M-γ-CD CNPs在注射24 h后,再加上活化的CRC靶向效应,显示出最大的肿瘤蓄积.RG@M-γ-CD暴露于肝脏和肾脏中也被发现,这可能降低了激酶抑制剂在这些组织中的全身毒性。7C)。结果表明,M-γ-CD衍生的非共价纳米制剂有效地优化了RG的药代动力学和生物分布.合适的颗粒大小和稳定的通道结构有利于Rg@M-γ-cd的系统循环和肿瘤的穿透。53...此外,甘露糖介导的靶向策略进一步增强了RG@M-γ-CD CNPs的肿瘤积聚.

图7:RG@M-γ-CD治疗CT26CRC模型的疗效。

aCT 26皮下肿瘤模型及尾静脉注射治疗的原理图(等效RG,10μg/g)。b药物动力学和c用高效液相色谱法测定RG、RG@γ-CD和RG@M-γ-CD CNPs在注射后4h和24h的生物分布(相当于RG,10μg/g)。N=3只小鼠,每组在每一时间点均不依赖生物。数据以均值±SD表示。d代表PET/CT显像结果及小鼠CT26荷瘤小鼠在不同治疗组治疗22d后的图像。e不同治疗组CT26荷瘤小鼠肿瘤体积的变化。N=7只无生物学依赖性的小鼠。肿瘤生长数据以平均值±SD表示。f不同治疗组小鼠的典型光声成像及血氧饱和度(HBO)2)在治疗的22天内。N=3只无生物学依赖性的小鼠。数据以均值±SD表示。g治疗组Kaplan-Meier生存曲线(n=7)。h不同组肿瘤组织CD 34、Ki 67和TUNEL染色切片的典型图像。标度棒,50μm,每组3只具有生物学独立能力的小鼠。iTAM群体(CD 206)流式细胞仪分析+F4/80+CD 45上的门控子集+细胞集)在不同的治疗组。N=3只无生物学依赖性的小鼠。数据以均值±SD表示。统计意义c, e, i采用单因素方差分析和Dunnett的多重比较检验(*)进行计算。p≤0.05,**p≤0.01,*p≤0.001,*p≤0.0001,治疗组与对照组p值显示在图中或源数据文件中)。源数据作为源数据文件提供。

基于药物动力学和靶向性优势,我们将该策略应用于CT 26肿瘤(~100 mm)的治疗。3)。CT26荷瘤小鼠随机分为6组(n=7/组),每2天用PBS、RG、M-γ-CD、MIX、RG@γ-CD和RG@M-γ-CD处理21天。正电子发射断层扫描-计算机断层成像是为了显示肿瘤的进展(图一)。7D和补充图。43)。多光谱光声断层成像(MSOT)技术也可用于监测肿瘤血管化程度。肿瘤负担扩大(1500-1800毫米)32 1d后,PBS组和M-γ-CD组血管形态明显增强,无明显疗效。Rg和混合处理对肿瘤生长有一定的抑制作用(750~1000 mm)。3)但未能抑制血管化,肿瘤区血氧饱和度较高,导致复发快,预后差(图一)。7E,g)。Rg@γ-cd和rg@M-γ-cd cnps对肿瘤生长和血管生成有明显的抑制作用(<600 mm)。3)。作为一种优化的纳米药物,rg@m-γ-cd cnps的抑瘤效果最好,肿瘤体积限制在200 mm以内。3.

免疫组织化学染色观察RG@M-γ-CD对恶性肿瘤的抑制作用。7H)。TUNEL和Ki 67染色显示RG@M-γ-CD处理引起的细胞凋亡水平最高,增殖率最低。CD 34染色显示RG@M-γ-CD CNPs能有效阻断肿瘤血管生成.RG@M-γ-CD cnps对TAMS的调节作用,CD 206的FACS分析+F4/80+CD 45上的门控子集+肿瘤组织内固定。将不同组肿瘤切除、机械处理、酶切后,用流式细胞仪进行分析。与对照组相比,rg、mix、rg@γ-cd或rg@M-γ-cd可显著降低肿瘤组织中的肿瘤细胞数(CD 206)。+F4/80+CD 45上的门控子集+设置)。尤其是CD 206下降了5倍~5倍+F4/80+在RG@M-γ-CD组中观察到亚群体。7I和补充图。44)。免疫荧光分析显示F4/80细胞浸润明显减少。+CD 206+用RG@M-γ-CD治疗小鼠的肿瘤细胞,并与未治疗小鼠的肿瘤细胞进行比较(补充图)。4547)。这证实了RG@M-γ-CD CNPs对CT26CRC模型TAMS失活的作用.由于TAM在肿瘤中的浸润有助于肿瘤发生的微环境,并被认为是影响广泛癌症预后的一个不良因素。54,RG@M-γ-CD CNPs的有效TAM失活对改善疗效有重要意义.


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