您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!2008-2021
Wuhan Xinqidi Biotech Co.Ltd
本企业通过iso9001质量体系认证

DNA甲基化模式鉴定胰腺神经内分泌肿瘤的临床相关性

 二维码
发表时间:2021-02-04 14:38作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

本文报道84例散发性胰腺神经内分泌肿瘤(PanNETs)的DNA甲基化谱及相关的临床和基因组信息。我们鉴定了三组PanNET的亚组,称为T1,T2和T3,具有不同的甲基化模式。T1亚组在功能性肿瘤中富集,ATRX, 达克斯MEN 1野生型基因型。T2亚群包含有突变的肿瘤ATRX, 达克斯MEN 1和重复模式的染色体丢失在一半的基因组之间没有关系的区域之间反复丢失和甲基化水平。T2肿瘤体积较大,甲基化程度较低。MGMT基因体与基因表达呈正相关。T3亚群在MEN 1随着11号染色体的反复丢失,G1级肿瘤的组织学参数明显增高,预后较好。我们的结果表明甲基化在PanNETs的肿瘤发生和潜在的分层预后中都有作用。

导言

摘要胰腺神经内分泌肿瘤(PanNETs)是一种罕见的由胰岛神经内分泌细胞衍生的上皮性肿瘤,其发病率在过去几十年中集体上升。1。Pannet患者总的5年生存率为54%,但在诊断阶段差异很大。局部疾病的5年生存率为93%,局部晚期疾病的5年生存率为77%,远处转移疾病的5年生存率为27%。最近的基因组、转录组和甲基组研究揭示了Pannet分子的异质性,这反映了它们的临床变化过程。2,3,4,5,6,7,8,9。PANET要么是功能性的,要么是非功能性的,后者比较普遍。功能性PanNET与激素分泌相关的症状相关,导致早期诊断.由于缺乏早期症状,非功能性泛非典型肺炎通常在晚期发现,局部晚期或转移性疾病。无功能的泛非典型肿瘤是一组更异质的肿瘤,具有不可预测的不同程度的恶性肿瘤。1,10。预测Pannets临床疗效的最佳指标是增殖性肿瘤细胞的比例,高级别(G3)肿瘤是更侵袭性的疾病,分子改变往往与神经内分泌癌相一致。1。相反,低级别(G1)和中等级别(G2)的pannet具有独特的分子病理学,缺乏可靠的生物标志物来帮助预测恶性肿瘤和选择治疗方法。11.

以前的研究已经检查了DNA甲基化和基因组模式,试图进一步细分PanNET。DNA甲基化在许多癌症的发生中起着重要的作用。评估PanNETs候选基因DNA甲基化的研究表明,肿瘤亚组中特定基因的异常甲基化。12,13,14。研究表明甲基化可能有助于PanNETs亚组的鉴定,这些亚组可能与临床特征有关。7,8,9。最近,研究表明甲基化可以识别Pannets的起源细胞。15,16,17。一些研究表明,在Pannets中观察到的重复拷贝数改变的模式,如整个染色体的得失,包括杂合性丢失(LOH),都与临床参数有关。2,18,19。排序工作已确定ATRX, 达克斯MEN 1作为Pannets中最常见的突变基因和哺乳动物靶点中的基因,雷帕霉素(MTOR)通路被报道频率较低。2,20.

在这里,我们用全基因组甲基化分析,结合临床和其他基因组特征,评估了一大群散发性PanNET,以便更全面地了解PanNET的分子特征,并具有潜在的临床意义。

结果

临床和突变信息

用Illumina450K甲基化阵列分析了84例临床散发性原发性PanNET和11例正常邻近胰腺。斯卡帕等人的临床和基因组信息。2(补充数据)1)用于了解甲基化模式识别的潜在PanNETs亚组。队列中有32名女性和52名男性,34名G1,48名G2,2名G3(世卫组织,2019年)和11名功能性肿瘤。该队列包括9个肿瘤,这些肿瘤中存在体细胞突变。ATRX基因,21达克斯和31MEN 1。也有四个肿瘤MEN 1种系变体(补充数据)1).

甲基化亚基

为了确定癌症特异性dna甲基化有可能将PanNET分层,我们选择了位于启动子区域的cpG位点,这些位点没有被甲基化(β-值<0.3)所有11例正常邻近胰腺标本。在通过质量过滤的411,159个CpG位点中,161,299个位点在正常胰腺中没有甲基化(β-值<0.3,其中111,113位于基因启动子区(TSS 1500,TSS 200,5‘-非翻译区(5’-UTR),或1 stExon)。在后11113个站点中,共有3378个CPGS有β-SD值>所有肿瘤DNA甲基化水平的0.20。通过上述探针的选择,我们期望减少来自肿瘤样本中的非肿瘤细胞的潜在混杂信号。对这3378个最可变启动子CpG位点的甲基化水平进行了二分法和无监督聚类,在肿瘤样本中发现了三个不同的聚类,提示了PanNETs(补充图)的潜在亚组。1)。在整个基因组中选择探针时,也发现了相似的亚组(补充图)。2)

甲基化亚组与常见突变基因的关系MEN 1, 达克斯ATRX,并具有临床特征

三个PanNETs亚组(称为T1,T2和T3)由甲基化模式确定(补充图)。1)显示出与临床和基因组特征的潜在联系(见图)。1A)。T1亚组占队列的26.2%,在PanNET中,三个最常见的突变基因的突变显著减少(ATRX, 达克斯(P-adj≤0.02,图1.1B)。此亚组为功能性肿瘤(11例功能性肿瘤中有7例,补充数据)。1)。T2亚组占队列的42.9%;该亚组的肿瘤因突变而富集。ATRX达克斯(P-adj≤0.003.1C),明显大于其他两个亚组的肿瘤(p-adj≤0.0003,图1)。1D),端粒较长(p-adj≤0.00008,图1)。1E)并呈现出端粒交替延长的高频率(p-adj≤0.0001,图1).1A)。T2亚群的肿瘤也有较高的肿瘤突变负担(每mb点突变)(p-adj≤0.03,图1)。1F)和80%的mTOR通路基因突变(补充数据)1)。各亚组患者年龄及性别分布无显着性差异,但T1亚组肿瘤含量略低于其他两个亚组(p-adj=0.018,图1)。1A和补充数据1MEN 1(占队列的30.9%),G1型肿瘤的比例较高(p-adj=0.001,图1)。1A)和较低频率的胰腺外扩张,神经周围和血管的侵袭(图一)。1g-i),提示一组预后较好的肿瘤。

图1:84个原发肿瘤的甲基化特征和无监督分级聚类鉴定的Pannet亚组。

肿瘤(列)以与附图所示的二分法聚类相同的顺序呈现。1. a亚组与基因组和临床特征的关系。bT1亚群显示野生型肿瘤明显富集。MEN 1/Daxx/ATRX基因(Fisher的精确测试)。cT2亚型肿瘤因突变而富集。ATRX达克斯基因(Fisher的精确测试)。dT2亚群肿瘤大于其他两个亚组(Wilcoxon秩和检验)。eT2亚群肿瘤端粒较长(Wilcoxon秩和检验)。fT2亚型肿瘤每兆位酶(Mb)的突变率高于其他亚组(Wilcoxon秩和检验)。gT3亚型肿瘤的胰腺外扩散明显低于其他亚组(Fisher‘s精确检验)。hT3亚型肿瘤有减少神经周浸润的趋势。iT3亚型肿瘤的血管浸润较其他两个亚组少。丙氨酸转氨酶状态:用C-尾灵qPCR评估端粒的可替代延长2ALT+Ve:ALT阳性,ALT−Ve:ALT阴性;端粒比率:端粒重复序列在肿瘤和正常样本中均计数,并用qMotif归一化为样本的平均基因组覆盖率。2对于肿瘤和匹配的正常样本和比率给我们一个缩短或延长与正常样本相比的指示。功能性PANETs:过度分泌生物活性激素的肿瘤。方框中的方框表示从第一个到第三个分位数的一系列值,其中的线表示分布的中值。晶须代表分布的最大值和最小值,不包括离群值,星号代表任何离群值。

甲基化亚组与体细胞拷贝数变化的关系

以前的研究报告了与拷贝数变化相关的PanNET亚组。2,5。为了研究拷贝数的改变与甲基化亚组(T1-T3)的关系,我们比较了由斯卡帕等人产生的拷贝数数据。2甲基化数据(如图所示)。2)。亚组t1具有拷贝数的异质型,主要为野生型。ATRX/达克斯/MEN 1。T2亚组在第1、2、3、6、8、10、11、15、16、21和22染色体上重复LOH。T3亚型肿瘤以二倍体基因组为主,第11号染色体反复缺失。接下来我们研究了肿瘤甲基化的聚类是否会受到各组间观察到的不同拷贝数的影响,更确切地说,如果拷贝数的丢失会导致甲基化的丧失。我们评估了6861个(411,159个CpG位点中)大多数可变CpG位点的甲基化水平(β-SD≥值为0.20,位于T2亚组染色体启动子区,表现为反复LOH(补充图)。3)。我们还评估了7316个变量最多的探针(β-sd≥0.2值跨肿瘤)位于基因体内(补充图)。4)。与其他亚组(T1和T3)相比,T2亚型肿瘤CpG位点甲基化水平较低,多数肿瘤在11条染色体上反复丢失或LOH。

图2:甲基化亚基与基因组特征的关联。

肿瘤(列)以与附图所示的二分法聚类相同的顺序表示。1. a突变ATRX, 达克斯MEN 1基因,端粒的交替延长(ALT)和端粒长度。b染色体臂受LOH影响的比例。c染色体臂之间的中位logr比率,作为拷贝数变化的参考(通过提供等位基因比率的估计)。采用欧氏距离法和Ward聚类法对染色体臂拷贝数和LOH(行)进行聚类。

亚组间差异甲基化基因及其与基因表达的相关性

接下来,我们比较了三个亚组(由3378个在正常邻近胰腺中未甲基化的肿瘤中发现的大多数可变探针),以确定整个基因组中不同的甲基化位点,并获得一些可能区分这些基因群的生物学方面的潜在洞察力。在411,159个GPG位点中,我们发现了至少一对不同的亚组之间甲基化的11,042个GPG位点。其中3603个定位于基因启动子区域,7439个定位于基因组其他区域。在T1和T2亚组中,共有6185个CpG位点被甲基化(q < 0.05 and a difference of average β-≥值0.20),其中1884个位于基因启动子区域(补充数据)2)。CPG位点(4044)在T1和T3之间存在差异甲基化(1563个CPGS位于启动子区域,补充数据)3和3586在T2和T3之间(启动子区域有1113个CPGS,补充数据)4)。在评价受差异甲基化CpG位点影响的基因数目时,有2630个基因在T1和T2亚组之间存在CpG位点差异甲基化,有1401个基因存在差异甲基化,启动子区域差异甲基化。当比较T1和T3甲基化时,1907个基因与1025个基因存在差异甲基化CpG位点,启动子差异甲基化。在T2和T3之间,1731个基因与CpG“CpG位点”启动子区的834个位点发生了差异甲基化(补充数据)5).

然后,我们对有RNA测序(RNAseq)数据的47例病例进行了甲基化水平和基因表达的相关性分析。CPG位点定位于基因,并在至少一对亚组之间被甲基化,目的是了解可能受到异常甲基化影响的潜在生物学机制。在11,042个CpG位点中,7303个CpG位点定位于4317个基因(TSS 1500、TSS 200、5‘-UTR、第一外显子、基因体或3’-UTR)。在这些基因中,987个基因被认为低于检测极限(876个基因的每百万计数(CPM)<3,111个在RNAseq数据中没有记录),被排除在相关估计之外。共有1573个CpG位点的甲基化水平与910个基因的基因表达呈显著相关(补充数据)。5)。共有35个基因有5个或更多的差异甲基化CpG位点,与该基因的表达显著相关,其中12个基因是转录调节因子(补充数据)。6)。相关性为正相关和负相关性,这取决于基因中差异甲基化探针的位置和基因。每个亚组的基因表达和甲基化的详细信息汇编在补充数据中。6。在35条基因中,有3条基因表达与甲基化之间存在显著的相关性,此前有报道称,在PanNET的亚组中,O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)21、胰十二指肠室1(PDX 1)4和Caspase 8(Casp8)12,14.

基因体甲基化MGMTT2亚组肿瘤明显低于其他组(T1和T3)。T2肿瘤还表现为染色体10q臂的反复缺失,包括MGMT(无花果)3A)。在我们的队列中,46个CpG站点映射到MGMT基因(45个基因体和1个到启动子区域)在各亚组间存在差异甲基化,并与基因表达呈正相关(补充数据)。5还有无花果。3B)。只有一个cpG位点(Cg 24420981)位于MGMT至少有一对亚组之间存在差异甲基化,而且出乎意料地也与表达呈正相关。基因体甲基化及其表达MGMTT2亚组肿瘤低于T1和T3组肿瘤MGMT甲基化在这些亚组之间没有不同程度的甲基化(如图所示)。3C,d)。基因体的低甲基化加上LOH可能导致低表达MGMT在T2子群内。我们研究了这两个基因的甲基化水平。MGMT,E型蛋白酪氨酸磷酸酶受体(PTPRE)和EBF转录因子3(EBF 3),也没有观察到T2亚组肿瘤中基因体甲基化的缺失(补充数据)。6),提示基因特异性缺失的基因体甲基化MGMT.

图3:MGMT基因。

肿瘤(列)以与附图所示的二分法聚类相同的顺序表示。1. aMGMT通过过滤器的基因。探针由5‘到3’方向的基因组坐标绘制。位于左侧的46个cpgs位点在肿瘤亚组间差异甲基化,并与MGMT用RNAseq数据评估47例患者的基因表达。正常邻近胰腺CpG位点的甲基化水平MGMT基因出现在右边。b44个CpG位点甲基化中位数的相关性MGMT基因体和MGMT用RNAseq数据表达47例。c平均甲基化水平MGMTT2亚组肿瘤基因体CpG位点(n=36)vs.T_1和T_3子群(n=48)。d基因表达水平MGMT用RNAseq数据分析47例基因(T2)n=17、T1和T3n=30)。方框中的方框表示从第一个到第三个分位数的一系列值,其中的线表示分布的中值。晶须代表分布的最大值和最小值,不包括离群值,星号代表任何离群值。

这个PDX 13个亚组间有19个CpG位点差异甲基化,其中6个与基因表达呈显著负相关(补充数据)。5和补充图。7An=2),在身体内(n=2)和3‘-UTR(n=2)的基因(补充图)。7b,c)。在我们的队列中,PDX 1基因在T2和T3(突变体)的肿瘤中表现出高甲基化的CpG位点。ATRX/达克斯/MEN 1)与T1亚组中的肿瘤相比,这些基因主要是野生型的,这一亚组对于功能性肿瘤来说是丰富的(补充图1)。7D,e)。只有一种更高的基因表达的趋势PDX 1在亚组T1中(附图)。7F)。这些结果需要谨慎对待,因为我们只有47例(T1亚组中的8例)有基因表达。Chan等人4提出了两个分化的基因ATRX/达克斯/MEN 1野生型PanNET突变体,与Aristaless相关的同源盒(ARX)和PDX 1。如ARX基因位于X染色体上,通常从甲基化分析中删除,我们对此进行了评估。ARX甲基化模式。我们观察到各组间甲基化水平没有差异(补充图)。8)甚至在分别评估男性和女性时(补充数据)7)。然而,我们观察到T2和T3的基因表达高于T1(野生型肿瘤)。这与以前的研究是一致的。4,22的甲基化状态ARX可能不会影响基因的表达。PDX 1低表达和高甲基化ATRX/达克斯/MEN 1突变型肿瘤(T2和T3)高于野生型肿瘤(T1)。此外,大多数样品具有强烈的低甲基化PDX 1T1亚组为功能性肿瘤(附图)。7A). PDX 1表达被认为是胰腺β-细胞的标志。23。我们利用Muraro等人描述的标记基因研究了胰腺α-和β-细胞类型的基因表达谱。23(补充图。9)。尽管病例数量不多,但我们的数据表明T1亚组肿瘤有更高的与β-细胞相关的标记物的表达,这支持了先前的报道,即这些肿瘤可能起源于胰腺β-细胞。

鉴定起源细胞不是本研究的主要目的,而是最近研究的一个组成部分。15,16,17已经确定了PANET与α-或β-胰岛细胞和肿瘤发生途径的相似之处。考虑到这一点,我们比较了五个胰岛细胞(两个α-和三个β-胰岛细胞)。24我们的小组。补充图10结果表明,α-和β-胰岛细胞之间甲基化程度最高的一组探针表明T1肿瘤为β样肿瘤,T2和T3肿瘤为α样肿瘤,这与47个肿瘤的基因表达谱与RNAseq和最近的文献一致。

讨论

本研究报告散发性原发性PanNET甲基化的全基因组模式。我们鉴定了三个PanNETs亚组,显示甲基化模式与其他基因组和临床特征之间的关系,为研究这种异质性疾病的机制提供了新的见解,并具有潜在的临床意义。

以前的研究表明dna甲基化有识别pannets亚组的潜力;然而,他们使用了较少的dna甲基化位点。3,12,14,较小的队列7或原发性和转移性肿瘤的混合队列4,他们没有探讨与临床和/或其他基因组特征之间的联系。本研究基于DNA甲基化谱确定的亚组与Lawrence等人所描述的一致。5基于拷贝数和体细胞突变,并强调甲基化状态、拷贝数改变和体细胞突变之间的联系,为我们了解这些肿瘤的基因景观增加了另一个重要因素。

T1亚组包括肿瘤,这些肿瘤主要是野生型的,是常见的突变基因。ATRX, 达克斯MEN 1。该亚组表现为不同拷贝数改变模式的肿瘤,与Chan等人的观点一致。4据世卫组织报告,突变体的基因表达和甲基化特征更为一致。ATRX/达克斯/MEN 1肿瘤比野生型肿瘤。T_1亚组对功能性肿瘤也有富集作用(11组中有7例)。

T2亚群肿瘤中有更多的突变ATRX, 达克斯MEN 111条染色体反复丢失/LOH。这是第一项强调dna甲基化谱与影响突变的相关性的研究。Daxx/ATRX基因和反复染色体丢失,这与PanNETs的存活率降低有关2,3,5,25。我们研究了复发缺失和LOH区域与基因定位相关的CpG位点甲基化水平,未观察到复发缺失的肿瘤区域甲基化水平低于其他亚组,提示LOH和甲基化可能共同影响PanNETs的肿瘤发生。与其他两个亚组相比,该亚组的肿瘤更大,并且含有更多的体细胞点突变。劳伦斯等人5认为体细胞LOH的单倍体功能不全可能通过影响多种肿瘤抑制因子的基因表达而促进PanNETs的发育。我们的数据表明了一个额外的复杂层,通过精心安排的甲基化模式的改变,这可以潜在地解释在本研究中观察到的亚组与Lawrence等人的相似之处。5,支持联合机制(拷贝数/LOH+甲基化)的假说,以推动这种癌症的肿瘤发生。

T3肿瘤存在突变MEN 1除11号染色体丢失或LOH外,它们的基因组没有主要的重复拷贝数变化。T3肿瘤的神经周膜、血管浸润和胰腺外扩展的发生率较低,G1级肿瘤的比例高于其他各组(T1和T2),表明这些肿瘤的侵袭性较低。10. MEN 1突变在遗传的PanNET中也起着一定的作用。先前的研究7评价9例散发性和10例遗传性甲基化MEN 1-相关的泛非政府组织建议MEN 1在这两种情况下发生突变的肿瘤比VHL遗传性肿瘤(n=10)。然而,散发和遗传的MEN 1相关的PanNET有不同的甲基化模式。在不久的将来评估一下MEN 1-与两个分组相比,与遗传相关的PanNET相比较,MEN 1在这里发现的突变,有不同的组织学参数指示预后。

总之,本文的结果提高了对PanNETs基因和表观遗传学景观的理解,也表明甲基化模式有可能对PanNETs的预后进行分层。我们的发现是关于DNA甲基化在PanNETs中作为一种生物标记物的潜力的初步报告,需要在其他队列中加以验证。如果得到证实,在临床实践中使用的下一步是与其他组织相比,识别更少的具有泛网特异性甲基化的cpG位点,这些组织可以明确区分亚型,并可能在将来影响临床治疗和监测患者的管理方式。

PDX 1高甲基化和低表达在肿瘤中的突变ATRX/达克斯/MEN 1基因(T2和T3)高于野生型肿瘤(T1)。这与Chan等人的调查结果一致。4,支持在我们的研究中观察到的基因表达的趋势。PDX 1是一个转录因子的几个基因,包括胰岛素,生长抑素,葡萄糖激酶,胰岛淀粉样多肽,葡萄糖转运蛋白2型。PDX 1在葡萄糖依赖的胰岛素基因表达调控中起重要作用。有趣的是,T1亚组对队列中的大多数功能性肿瘤都进行了富集,其中包括6个胰岛素瘤中的5个。布恩等人15中使用了甲基化探测。PDX 1两种泛NET亚型(A和B)的基因座分别与α-和β-胰岛细胞相似。与B亚型相比,A亚型预后明显差,后者大多数为胰岛素瘤。B亚型主要为野生型ATRX/DAXX/MEN 115,A亚型似乎在其聚类分析中有进一步的分支,表明转移性疾病有潜在的差异,但作者没有进一步讨论这一点。在这里,我们推测A亚型的进一步亚型可能与我们在研究中看到的两组(T2和T3)有关。T2和T3主要为无功能的PanNET,但在组织学指标上有显着性差异(P<0.05),而T2与预后较差的指标有关。

T2亚型肿瘤在cpgs中甲基化程度较低,位于cpgs体内。MGMT基因,与基因表达呈正相关。这些数据与以前的研究一致,表明MGMT基因体甲基化在MGMT表达26,27,并将这一现象置于PanNETS的一个特定分组中。低表达MGMT已被建议增加肿瘤对替莫唑胺的敏感性,替莫唑胺是治疗晚期PanNETs的常用药物。然而,研究表明,在表达的结果之间存在矛盾。MGMT替莫唑胺在PANETs中的作用21,28,29。一项对分化良好的晚期十二指肠胰、肺或未知原始网的临床试验目前正在评估MGMT启动子甲基化可以预测烷基化剂的反应(NCT 03217097)30。在我们的研究中,只有一个cpG位点位于MGMT亚组间差异甲基化,与表达呈显著正相关。基因体内甲基化的作用及其与基因表达的关系尚不完全清楚。研究表明了潜在的机制,如调节替代启动子,调节反转录转座子元件影响替代转录,以及调节其他维持转录效率的功能元件。31,32,33. MGMT基因体甲基化将需要进一步的研究,因为它作为一个潜在的临床影响,作为治疗PanNETs的预测指标。

总之,这项研究报告了对PanNETs中dna甲基化的全基因组扫描,提供了异常dna甲基化在其肿瘤发生中起重要作用的证据。这是最大的与甲基化与基因组和临床信息相结合的队列,表明在这一疾病中,调控的表观基因解除与体细胞的LOH/拷贝数的变化一起起着一定的作用。DNA甲基化可能有助于这些肿瘤的临床表现和行为的异质性。我们的发现也可能有未来的临床意义,以分层的预后和协助选择治疗的PanNETS患者。


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297