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+Pd-1+CD8+T细胞介导乳腺癌转移休眠

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发表时间:2021-02-04 14:33作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

一些乳腺肿瘤侵袭性转移,而另一些则休眠数年。转移性休眠的机制尚不清楚。通过对小鼠进行高参数单细胞定位,确定了CD 39的离散群体。+Pd-1+CD8+T细胞存在于原发肿瘤和隐匿性转移中,在侵袭性转移肿瘤中几乎不存在。利用阻断抗体,我们发现休眠依赖于肿瘤坏死因子α和干扰素γ。免疫治疗减少了潜伏在肺部的癌细胞的数量。纯化CD 39的过继转移+Pd-1+CD8+T细胞阻止转移生长。在人类乳腺癌中,CD 39的频率+Pd-1+CD8+但不是全部CD8+T细胞与切除后延迟转移复发(无疾病生存)相关,从而强调CD 39的生物学意义。+Pd-1+CD8+T细胞控制实验和人类乳腺癌。因此,我们认为原发性乳腺肿瘤可以引发系统性的CD 39。+Pd-1+CD8+T细胞反应有利于肺内转移休眠。

导言

转移是乳腺癌患者死亡的主要原因。这种疾病的转移行为在受影响的器官和时间上是不一致的。1,2。有些患者在诊断后不久甚至在诊断前就会出现转移,而另一些患者则在切除原发肿瘤数年或几十年后才发现转移灶。1,3。事实上,20%的无疾病患者在切除后7年内就会复发,而似乎从乳腺癌中痊愈的患者甚至在手术后20年内也比其他人群的死亡率高。4,5。这种晚期复发被认为是由扩散性癌细胞(DCC)引起的,这些癌细胞到达不同的器官,但休眠了几年。6。事实上,乳腺癌患者骨髓中DCCs的存在与转移复发的发生密切相关。7,8.

转移性休眠的癌细胞内在和外在机制尚不清楚。一些癌细胞的内在因素与休眠有关,例如抑制PI3K-AKT通路。9激活p38或触发内质网应激反应10。此外,(前)转移器官的微环境可能导致休眠。11通过不同的信号,如内皮细胞衍生的凝血酶反应素-112或骨髓中产生的转化生长因子-β2。13。只有很少的研究涉及癌症细胞外部因素的影响,如先天因素。14,15和适应性免疫16,17在休眠的时候。虽然T细胞浸润原发肿瘤与预后良好有关18目前尚不清楚这种相关性是由消除癌细胞的细胞毒性T细胞还是阻止癌细胞生长和诱导休眠的T细胞所致。19,20.

在这里,我们试图了解控制DCC转移休眠的机制,并发现原发肿瘤启动了一种全身性的CD8。+T细胞反应,防止DCCs在肺部转移生长。保护性T细胞表达的标记通常与激活和衰竭有关。促进这种反应可能为今后发展旨在防止转移性复发的免疫疗法提供理论依据。

在这里,我们展示了CD 39+Pd-1+CD8+T细胞在乳腺癌的临床前模型中介导转移性休眠,并与乳腺癌患者术后无病生存率增加有关。

结果

播散性4T07乳腺癌细胞休眠

我们使用了两种乳腺癌的临床前模型,这两种模型最初来自BALB/c小鼠相同的自发肿瘤,即4T1和4T07。21(无花果)1A)。4t1原位乳腺癌在不同器官内产生巨大转移。22,23,而4T07基本上是非转移性的。然而,一些研究表明,远端器官存在播散的4T07细胞。21,24.

图1:4T07但不是4T1乳腺癌细胞在扩散到肺后处于休眠状态。

a4T1和4T07细胞起源图21. b实验设计4T07-MCH细胞(10例)5在雌性BALB/c小鼠乳腺脂肪垫内注射PBS。30d后进行分析。c定量病理学定量检测播散性4T07-MCH细胞*p < 0.0001. d4T07-MCH细胞(10例)5)在雌性BALB/c小鼠乳腺脂肪垫内注射。35d后进行分析。原发肿瘤(上板)和肺(下板)在终点的代表切片。5只小鼠肺内4T07-MCH细胞为单个、Ki 67阴性细胞。4T07-MCH细胞呈红色,Ki 67为绿色,DAPI为蓝色。标尺表示50米。e实验设计4T07-MCH细胞(10例)5)在雌性BALB/c小鼠乳腺脂肪垫内注射。肿瘤注射后20d切除,切除后21d(终点)进行分析。f定量病理学对播散性4T07-MCH细胞的定量研究。****p < 0.0001. g在终点的肺代表切片。5只小鼠肺内4T07-MCH细胞为单个、Ki 67阴性细胞。4T07-MCH细胞呈红色,Ki 67为绿色,DAPI为蓝色。标尺表示20米,每个符号代表单个鼠标。每组5只小鼠。二尾学生t-测试。杆代表平均±SD。结果代表了三个独立的实验。

骨科注射的4T1和4T07细胞在免疫活性BALB/c小鼠中显示出类似的乳腺癌生长和发病率,尽管4T1肿瘤在晚期生长更快(补充图1)。1A和b)。但是,虽然4T1乳腺癌容易诱发积极生长和宏观可见的肺转移,但4T07没有(补充图1)。1C和d)。尽管没有大转移,但我们在肺部发现了4T07细胞(补充图)。1E)在所有小鼠中,表明4T07 DCCs能播撒肺,但不能生长。免疫荧光法证实和定量了所有4T07-MCH原发肿瘤小鼠肺中休眠DCC的存在。1B-d,以及附图。1F)。播散的4T07细胞以单细胞的形式存在,并且是Ki 67-阴性,就像以前对休眠dcc的描述一样。15,17。事实是,我们发现不增殖,播散4T07后第21天的原发肿瘤(图一)。1E-g)进一步强调4T07 DCC的休眠状态。

乳腺癌诱导CD8+T细胞休眠

我们首先通过静脉注射4T1或4T07乳腺癌细胞来研究癌细胞的内在特征是否影响DCCs在肺内的生长(i.v.)变成天真的老鼠。2A)。在这些实验条件下,这两种细胞系形成了相当大的转移(图一)。2B),表明这两种细胞都能在肺中逐渐生长。

图2:原发肿瘤诱导保护性免疫介导转移休眠。

a实验设计4T1或4T07细胞(3×10)5)注射静脉注射。雌性BALB/c小鼠。25d后分析。b肺转移结节数目。4T1,n=5;4T07,n=4。c实验设计4T1或4T07细胞(10个)5)在雌性BALB/c或BALB/c的乳腺脂肪垫内注射。FOXN 1NU/NU老鼠。30d后分析。当4T07肿瘤大小达到BALB/c时,对“WT晚期”小鼠的肺进行分析。FOXN 1NU/NU组(D 35)。d原发性肿瘤的重量。左面板封闭符号,4T1。两组n=5.打开符号的右面板,4T07。FOXN 1NU/NU, n=7;WT,n=5;WT迟,n=4,**p=0.006(FOXN 1NU/NU),**p=0.0027(FOXN 1NU/NU比较晚)。e肺转移结节数目。带闭合符号的左面板,4T1;带有打开符号的右面板,4T07,**p=0.071,用于两种比较。f实验设计雌性BALB/c小鼠接受0.5mg抗CD8或同类型对照。在−1和+5天,相对于注射10天54T07-乳腺脂肪垫中的MCH细胞。25d后分析。g生物发光法测定肺转移负荷*p < 0.0001. Anti-CD8, n=9;同类型n = 10. h生物发光图像反CD8,n=9;同类型n = 10. i实验设计4T07细胞(10细胞)5)或将PBS注射到雌性BALB/c小鼠乳腺脂肪垫中。在d 11上,3×1054T07LZ细胞腹腔注射,第25天肺转移负荷分析。j生物发光法测定肺转移负荷。4T1,n=5;4T07,n=4,*p=0.0021。k生物发光图像l4T07细胞(10细胞)5)或将PBS注射到雌性BALB/c小鼠乳腺脂肪垫中。第8天,小鼠腹腔注射。500 g抗CD8抗体或同类型对照。D 15,3×1054T07-LZ细胞经腹腔注射。在第25天定量注射和肺转移负荷。mD25生物发光法测定肺转移负荷所有组n=5,*p < 0.0001. Each symbol represents an individual mouse. ns = not significant. 2-tailed Student’s t-韦尔奇校正测试(b, d左面板,e左面板,g, j);带Bonferroni校正的双面方差分析(d右面板,e右面板,m)。杆代表平均±SD。结果代表3(f, g, h)或2(所有其他)独立实验。

在4t1模型中,髓系细胞室被证明通过创造一个转移前小生境而经历癌症诱导的促进转移的变化。25,26。具体来说,4T1原发肿瘤诱发全身性中性粒细胞减少。27脾肿大26,以及炎症单核细胞的积聚。28、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞27肺泡巨噬细胞29在转移前的肺部。因此,我们比较了4T1-和4T07-在血液和肺部髓系室的变化,并观察到在脾肿大方面没有差异(附图)。2A),或中性粒细胞减少(补充图。2B)。4T1或4T07乳腺癌小鼠的肺部炎症单核细胞的存在相似(附图)。2C),中性粒细胞(补充图。二维空间),嗜酸性粒细胞(附图)。2E)和肺泡巨噬细胞(补充图。2F)流式细胞仪检测结果(附图)。2G)。我们看到了以前报道的在乳腺癌进展过程中肺部髓系细胞的积聚。27在4T1和4T07相似(补充图。2)。因此,4T1和4T07乳腺癌转移行为的差异不能用髓系室的系统性改变来解释。

原位4T07肿瘤在T细胞缺乏的BALB/c中诱导肺转移FOXN 1NU/NU小鼠,而T细胞缺乏几乎不影响4T1肿瘤的转移行为(图)。2C-e)。为了比较两种菌株的肺转移,我们分析了野生型和FOXN 1NU/NU小鼠在注射后的同一时间点,并添加了另一组野生型小鼠,其中乳腺肿瘤被允许进展,直到他们匹配的大小FOXN 1NU/NU小鼠(WT迟)(图1.2D和e)。因此,播散性4T07乳腺癌细胞的转移休眠完全依赖于T细胞。在免疫缺陷小鼠中,4T1细胞在本质上比4T07细胞具有更高的转移性,这一事实反映了4T1和4T07细胞之间不同的特性,其中一些特征与T细胞无关。事实上,我们认为4T1和4T07细胞之间的许多差异妨碍了在体内进行适当的和结论性的比较。

研究CD8是否+T细胞是转移性休眠的原因,我们耗尽了CD8。+小鼠T细胞,原位注射4T07细胞,IVIS分析肺转移负荷(图1)。2F)。原发肿瘤的生长不受CD8-耗竭的影响,在不含CD8的情况下,播散性4T07-lz细胞生长为大转移。+T细胞(图1.2G和h),提示原发性4T07乳腺癌可诱导CD8。+T细胞依赖性免疫。

检验CD8的假设+T细胞是转移性休眠所必需的,我们用未标记的4T07细胞(或PBS作为对照)进行原位注射,然后注射i.v。11天后用荧光素酶标记的4T07-LZ细胞进行攻击。2I)。如果原发肿瘤诱导了保护性免疫,我们预计肺转移负荷会减少。因为我们用生物发光法测量了肺转移负荷,所以我们对I.V进行了具体的量化。注射荧光素酶标记的4T07细胞。原发于4T07的乳腺肿瘤阻止了I.V的转移。注射4T07-LZ细胞(见图)。2i-k)但不影响接种后0.5h和3h的播种量。注射(附图)3A和b)。在终点,I.V。注入细胞在肺内呈播散、非循环的单个4T07细胞(补充图)。3C和D)。术前切除原发肿瘤。挑战不影响休眠。特别是I.V.注射4T07-MCH细胞可轻易诱导对照组小鼠出现宏观可见的肺转移(乳腺和模拟手术中的PBS;补充图。3E,f4T07荷瘤小鼠肺内仅检测到单个、不增殖的4T07细胞,与切除无关(补充图)。3E,g)。我们在4T07-LZ细胞和生物发光的类似实验装置中证实了这些结果(补充图)。4A,b)。CD8耗竭+在I.V.之前的细胞。挑战促进了转移生长(图1)。2L和m),确定休眠对CD8的依赖性。+T细胞相反,4T07和4T1乳腺癌对实验性4T1肺转移有保护作用,尽管4T07诱导的全身免疫降低了因i.v引起的转移负荷。注射4T1-LZ细胞(补充图)。4C和d)。虽然肺转移负荷是由静脉注射引起的。4T07荷瘤小鼠注射4T1细胞减少,病灶仍在进行性(即多细胞和Ki 67)。+)而不是休眠(附图。4A-d)。此外,我们认为通过移植的CD 39的数量+Pd-1+CD8+T细胞根本不足以控制具有内在较高转移潜能的4T1细胞。

这些数据表明,4T07乳腺癌诱导了一种全身性的保护性免疫反应,介导了DCCs在肺中的休眠。

+Pd-1+CD8+T细胞介导转移性休眠

首先,我们分析了不同免疫细胞在原发性4T1和4T07肿瘤中的存在情况(附图)。5A)。我们没有发现嗜酸性粒细胞数量的差异(补充图)。5B),中性粒细胞(补充图。5C),NK细胞(附图)。5D)或炎性单核细胞(补充图。5E),但4T1肿瘤中巨噬细胞的数量高于4T07肿瘤(附图)。5F).

自从我们发现4T07转移休眠依赖于CD8+我们用高维流式细胞仪对4T1和4T07原发肿瘤的T细胞进行了鉴定.首先,我们对T细胞进行门控(补充图)。6A),使用二维显示23参数面板中的所有标记。t-随机邻居嵌入(TSNE)投影30(无花果)3A)并使用FlowSOM对单元格进行聚类。31,32(无花果)3A和b,上面板和左下面板)。根据在簇中观察到的中位标记强度(如图所示)。3B,右下角),我们注释了主要的细胞群(CD8)。+T细胞,CD4+T细胞和CD4+CD 25+调节性T细胞),并确定其频率和各群体在tSNE投射中的位置。此外,不仅是CD 39的数量+Pd-1+CD8+T细胞在4T07细胞高于4T1肿瘤,但其CD8的比例也高于4T1肿瘤。+T细胞调节性T细胞在4T1和4T07肿瘤中的频率与常规CD4相似。+4T1肿瘤细胞较4T07细胞丰富。相比之下,4T07原发肿瘤中CD8的比例较高。+T细胞(图1.3B,左下角)。

图3:CD 39+Pd-1+CD8+休眠乳腺癌中出现T细胞。

雌性BALB/c小鼠注射10只。520d后用流式细胞仪分析乳腺脂肪垫和原发肿瘤中的4T1或4T07细胞。a标记在单、活、CD 45上浇口后的t-sne可视化+TCRβ+CD 44+细胞。b上面板:主T细胞子集的t-SNE图.左下角:两组主要T细胞亚群的频率。每个符号代表一个单独的鼠标,*p=0.019(CD4)+),*p=0.011(CD8)+T细胞)。右下角:主T细胞亚群标记表达的热图。cCD8标记物的T-SNE可视化+TCRβ+细胞。d面板上:主CD8的t-sne图+用FlowSOM算法辨识T单元子集。下面板:主CD8的频率+由FlowSOM算法在两组中识别的t子集,*p=0.028,**p=0.0069。eCellCnn(红色)鉴定的群体在CD8中的相对标记分布+T细胞(蓝色)。KS表示整个细胞群与所选细胞子集之间的Kolmogorov-Smirnov双样本检验.f主CD8标记表达的热图+用FlowSOM算法辨识T单元子集。gCD8门控后4T1、4T07原发肿瘤的典型FACS图+TCRβ+. hCD8总人数的频率+CellCnn在两种模型中识别的*p < 0.0001. iCD 39的数目+Pd-1+CD8+肺部T细胞*p=0.0317。j代表CD 103-活CD 39染色+Pd-1+CD8+来自肺的T细胞。每个符号表示单个鼠标。n=所有小组每组4人,但h小组除外(n=3)和I(n=5)。双尾学生t-用韦尔奇的修正进行测试。杆代表平均±SD。

值得注意的是,在CD8室内(如图所示)。3C),我们观察到4T07乳腺癌累积CD 39+Pd-1+CD8+T细胞(图1.三维空间).

证实CD 39的富集+Pd-1+CD8+T细胞是4t07和4t1乳腺癌的主要免疫差异,我们用无偏表示学习算法cellcnn分析了我们的高维流式细胞术数据。33,34。与Flow SOM分析一致,CellCnn检测到CD 39、PD-1、LAG 3和Tim-3的高表达群体(图3)。3E和补充图。6A和b)。事实上,在Kolmogorov-Smirnov双样本测试中,最能定义种群并显示最大差异丰度的两个标记是pd-1和CD 39(图1)。3E)。此外,CD 39+Pd-1+CD8+T细胞表达较多的延迟-3和提姆-3。3F),它将这个群体描述为最近经历了T细胞受体接触的效应细胞。35,36但也可能意味着精疲力竭37,38。与4T1肿瘤相比,这一群体在4T07中的数量是4T07的三倍(图1)。3G和H, p < 0.001). Therefore, we analyzed the functionality of CD39+Pd-1+CD8+T细胞从4T07肿瘤中分离,证实产生了干扰素γ和肿瘤坏死因子α(附图)。6C)。此外,CD 39+Pd-1+CD8+T细胞对体外培养的4T07细胞和4T1细胞均表现出细胞毒作用(附图)。6d)。我们发现这种CD 39的存在有所增加。+Pd-1+CD8+原代4T07(而非4T1)乳腺癌中的T细胞已经在第10天出现(补充图)。7A-d)。这些结果表明CD 39+Pd-1+CD8+4T07肿瘤T细胞具有保护效应功能。

重要的是CD 39+Pd-1+CD8+T细胞存在于原发性4T07乳腺癌小鼠的肺中(图一)。3I)。这个群体中有一部分表达CD 103,因此类似于组织内的记忆T细胞。39,40(无花果)3J)。我们观察到CD 39+Pd-1+CD8+T细胞在原发肿瘤中不表达CD 103。3F)与最近的数据一致,表明人类乳腺癌组织内的类组织记忆细胞为CD 103阴性。41。因此,CD 39的积累+Pd-1+CD8+T细胞是潜伏性和转移性肿瘤的主要免疫学差异。

因为CD8+细胞在4T07中特异表达PD-1,我们想知道阻断PD-1是否能改善其推测的保护作用。事实上,抗PD-1的免疫治疗可以减少肺部播散的4T07细胞的数量(图二)。4A和B),暗示PD-1+CD8子集+T细胞包括保护性效应细胞。调查CD 39是否+Pd-1+CD8+T细胞亚群确实控制着转移性生长,从而介导了转移性休眠,我们将这个群体从4T07乳腺癌中分离出来,并将其过继转移到幼稚的BALB/c小鼠,然后再用i.v。注射4T07LZ细胞(见图)。4C和d)。CD 39过继转移+Pd-1+CD8+T细胞预防4T07肺转移,而注射PBS或CD8+T细胞缺乏CD 39+Pd-1+细胞(称为其他CD8)+T细胞)没有。4E和F)。在这些实验中,我们没有看到休眠的细胞,从而为I.V的可能性留出了一些空间。当CD 39的时候,注射的细胞实际上从未到达肺部。+Pd-1+CD8+转移T细胞。为此,我们进行了同样的实验,并在肺部可视化地播散了4T07-MCH细胞。我们观察了未接受CD 39的小鼠肺部转移生长情况。+Pd-1+CD8+T细胞;相反,在接受CD 39的小鼠中。+Pd-1+CD8+T细胞,我们发现单个的,不增殖的,因此休眠的4T07-MCH细胞在肺(补充图)。8)。因此,我们的结果表明CD 39+Pd-1+CD8+T细胞是控制播散性4T07乳腺癌细胞所必需且充分的细胞。

图4:肿瘤相关CD 39+Pd-1+CD8+T细胞阻止转移生长。

a实验设计4T07-MCH细胞(10例)5)在雌性BALB/c小鼠乳腺脂肪垫内注射。第20天切除乳腺肿瘤,第32天行肺组织学分析。老鼠接受静脉注射。注射250μg抗PD-1或同型对照,d 15,18,23,26和29。b定量病理学计数播散性4T07细胞(右面板)。每个符号表示单个鼠标。等型,n=6;抗PD-1,n=7,*p=0.0152,(双尾学生的)t-用韦尔奇的修正进行测试)。杆代表平均±SD。cCD 44分选中的选通++Pd-1+CD8+其余的CD 44+CD8+人口(称为其他CD8)+T细胞)建立的4T07原位乳腺肿瘤。d实验设计20万分类CD 44++Pd-1+CD8+或其他CD 44+CD8+T细胞注射10次后转移。54T07LZ细胞进入雌性BALB/c小鼠。所有注射均静脉注射。14d后用生物发光法测定肺转移负荷。e肺末端的生物发光。f生物发光法测定肺转移负荷**p=0.0058,*p=0.0002。每个符号表示单个鼠标。每组5只小鼠。**p < 0.01, ***p < 0.001 (ANOVA with Bonferroni’s correction). The bar represents the mean ± SD. g实验设计4T07-MCH细胞(10例)5)在雌性BALB/c小鼠乳腺脂肪垫内注射。老鼠接受静脉注射。每3天注射500 g抗干扰素γ+500 g抗肿瘤坏死因子α。对照组小鼠接受同型对照抗体。在第20天,用免疫荧光法在肺内显示4T07-MCH细胞.h两例有代表性的例子显示4T07-MCH细胞在小鼠肺内增殖,用抗干扰素γ和抗肿瘤坏死因子α治疗。8只小鼠肺中4只检测到4T0-mCh7细胞增殖。

肺内无增殖播散的4T07细胞提示CD8+T细胞通过细胞周期阻滞介导休眠。因此,我们测试了CD 39是否+Pd-1+CD8+T细胞源性干扰素γ和肿瘤坏死因子α可诱导衰老。42在体外将4T07细胞暴露于这些细胞因子中。我们观察到衰老相关β-半乳糖苷酶活性的表达显著增加了衰老细胞的数量(补充图)。9A和b)。为证实干扰素α/肿瘤坏死因子α诱导小鼠体内衰老的相关性,我们阻断了4T07MCH乳腺癌小鼠的两种细胞因子,并用免疫荧光法分析了4T07细胞在肺内的表达情况。4G)。阻断干扰素γ和肿瘤坏死因子α可使播散细胞的转移爆发,如4T07细胞增殖团的存在所示(如图所示)。4H)。我们观察了8只接受抗干扰素γ和抗肿瘤坏死因子α治疗的小鼠中有4只发生了这种转移。在同型处理小鼠的肺中,我们没有发现转移性的爆发;相反,我们观察到了所有被分析的小鼠肺中单一的、不增殖的播散细胞。因此,阻断干扰素γ和肿瘤坏死因子α后肺内仅存在多细胞转移瘤4T07,说明诱导休眠依赖于这两种细胞因子。

因此,4T07原发肿瘤主要是全身性CD8。+T细胞通过干扰素γ和肿瘤坏死因子α诱导DCCs细胞周期阻滞,从而预防明显的转移性疾病。

CD 39的效应功能与衰竭+Pd-1+CD8+T细胞

为了理解为什么这个群体控制DCC,我们对CD 39进行了排序。+Pd-1+CD8+和其他CD8+T细胞来自4T07乳腺癌,并比较了他们的转录组(图)。5A和b和补充图。10A)。CD 39+Pd-1+CD8+细胞表现出与效应器功能相关的转录本的过度表达,包括Prf 1,Fasl,Gzmf,Gzme,Gzmd,Gzmc,Gzmb,Gzmk,和IFNG(无花果)5C)。基因集富集分析(GSEA)证实了这一点。43显示已排序的CD 39的转录组+Pd-1+CD8+细胞与人类组织内的CD8有很强的相似之处。+T细胞(图1.5D),最近被证明与三重阴性乳腺癌的生存率提高相关。19。这是符合他们独特的能力细胞,以防止转移的进展。此外,在4T1乳腺癌中从来没有观察到休眠现象,这是由于这种保护性T细胞在携带4T1的宿主中数量较少的原因(图一)。3)而不是它们的转录特征,因为CD 39+Pd-1+CD8+4T1和4T07肿瘤细胞无明显差异(附图)。10b-d)。CD 39转录体+Pd-1+CD8+细胞也富含激活和衰竭的标记,例如瓦西尔(Vista)Tnfrsf 18(GITR),蒂吉特, 镉224(2B4),Tnfrsf 9(4-1BB),Tnfrsf 4(OX-40),ICOS, LAG 3, Ctla4,哈弗克2(Tim-3)这与转录因子TOX的过度表达是一致的。5C)导致慢性抗原刺激时衰竭标志物的表达和效应功能的持续存在。44.

图5:CD 39+Pd-1+CD8+T细胞具有独特的转录特征。

a分类CD 44间显着差异表达基因的层次聚类++Pd-1+CD8+和CD 44+CD8+T细胞bCD 44火山地形图比较记录++Pd-1+CD8+T细胞与其他CD 44细胞+CD8+T细胞从4T07乳腺肿瘤中分离出来。红色符号代表在CD 44中明显过度表达的转录本。++Pd-1+CD8+T细胞,而蓝色符号代表明显低表达的转录本.c热图显示CD 44中选定转录本的相对表达++Pd-1+CD8+(三行顶行)和其他CD 44+CD8+通过差异基因表达分析鉴定T细胞(三行底)。d基因集富集分析比较转录谱与Goldrath等人发表的数据。80(左面板)和Savas等人。19(右面板)。

加在一起,CD 39+Pd-1+CD8+细胞具有独特的转录特征,由免疫检查点分子和效应蛋白的共同表达决定。

+Pd-1+CD8+T细胞与乳腺癌生存期的关系

为了探讨临床前发现的临床相关性,我们分析了54例原发性乳腺癌切除后转移复发患者的原发性乳腺癌组织(补充表)。1)对CD8、CD 39、PD-1和上皮细胞进行5-复合免疫荧光检测(图一)。6A)。我们的队列显示了每个亚型的典型存活曲线,表明它是有代表性的(补充图)。11A)。肿瘤内CD 39高密度患者+Pd-1+CD8+手术后T细胞的无病存活时间明显长于低密度的患者(图一)。6B)。肿瘤外CD 39密度+Pd-1+CD8+T细胞与无病生存无关(附图)。11B),相对于CD 39的密度+Pd-1+CD8+T细胞与其位置无关(补充图)。11C)。此外,我们观察到类似的数据时,聚焦于腔A和B患者(补充图)。11d和e)。肿瘤内CD 39的密度+Pd-1+CD8+根据多变量Cox回归分析,T细胞不是自变量(补充表)1)。重要的是,肿瘤内CD8的密度。+T细胞与无病生存无相关性(图一)。6C),强烈支持我们的临床前观察,即播散性癌细胞是由CD 39的这一特定子集控制的。+Pd-1+CD8+T细胞

图6:肿瘤内高密度CD 39+Pd-1+CD8+但不是全部CD8+T细胞与乳腺癌无病生存相关。

a人乳腺癌5色多重免疫荧光的代表图像。染色显示上皮细胞(Panck+EpCAM,黄色),CD8+T细胞(CD8,洋红),PD-1(绿色),CD 39(红色)和核染色(DAPI,蓝色)。标尺为50m。b54例肿瘤内CD 39高、低数患者的无病生存+Pd-1+CD8+T细胞。丙54例肿瘤内CD8高、低数患者的无病生存+T细胞高、低CD 39分离患者的阈值+Pd-1+CD8+用ROC曲线分析确定T细胞密度。用Kaplan-Meier曲线对高、低细胞密度患者的生存率进行比较。置信区间表示为围绕生存曲线的阴影区域。用对数秩检验计算显着性。每15年随访一次,显示处于危险中的病人人数.

讨论

我们发现乳腺癌可以诱发全身性的CD8。+T细胞反应介导肺内转移休眠,从而防止临床转移生长。因此,我们描述了原发肿瘤的一个意想不到的特征,以及它们众所周知的促进转移的能力。25,26,45,46。用高维单细胞谱分析原发性肿瘤,我们鉴定了保护性的CD8。+T细胞群体为pd-1+和CD 39+细胞,暗示最近的同源相互作用和肿瘤特异性20,47。根据我们的临床前数据,我们发现高密度的肿瘤内CD 39。+Pd-1+CD8+乳腺癌切除术后T细胞与无病生存率显著相关。即使在腔内A或B亚型患者中,肿瘤组织中CD8的浸润也较少+T细胞48,CD 39的存在+Pd-1+CD8+T细胞与肿瘤切除后无病生存相关。在我们的临床前模型中,包含所有CD8的异质人群+T细胞与无病生存无关,强烈支持CD 39的观点。+Pd-1+CD8+T细胞由一群细胞组成,这些细胞具有独特的控制播散性癌细胞的能力。

CD 39在癌症中的作用相当复杂。一方面,有证据表明CD 39的表达标志着肿瘤特异性T细胞的存在和这种细胞的存在与更好的预后或免疫介导的控制有关。47。另一方面,CD 39在肿瘤微环境(Tregs和髓系细胞)中由某些癌细胞和抑制型细胞(Tregs和髓系细胞)构成表达,并催化促炎细胞外ATP,导致CD8受损。+T细胞依赖性肿瘤控制49,50。同一篇论文描述了阻断CD 39酶活性后肿瘤相关巨噬细胞和单核细胞的减少以及T细胞功能的改善(以及肿瘤的控制)。

我们观察到CD 39+Pd-1+CD8+T细胞表达效应分子,但也有典型的与衰竭相关的标记。最近在人类乳腺癌中也出现了类似的人群。19,51,52,53。耗竭的T细胞被认为具有降低效应功能和丧失增殖能力的作用。54,55。尽管如此,乳腺癌中耗尽的T细胞可能比黑色素瘤更有功能。56.

除局部免疫外,免疫疗法诱导全身免疫反应对其疗效至关重要。57,表明保护性的CD8+T细胞被吸收到肿瘤中。循环CD8+T细胞也可以进入组织,在组织中发育成CD 103。+组织驻留记忆细胞,并可能通过诱导细胞死亡或细胞周期阻滞来保护组织免受肿瘤细胞的传播。58。事实上,我们检测到CD 39+Pd-1+CD8+T细胞在原发肿瘤和肺部,并发现一定比例的CD 103表达作为组织居留的标志。最近发现肿瘤内CD 103表达CD8。+T细胞与乳腺癌生存期的关系41.

如上所述,转移性休眠可能是由两种不同的状态引起的。59*播散的静止单细胞60,即通过扩散和死亡之间的平衡保持稳定的微转移。61。我们发现播散性4T07细胞以单个非循环细胞的形式存在于肺内,提示细胞周期阻滞时处于休眠状态。我们观察到休眠本质上依赖于CD8。+T细胞揭示了一种新的休眠机制。我们发现保护性CD 39+Pd-1+CD8+T细胞产生肿瘤坏死因子α和干扰素γ,在Th1介导的抗肿瘤保护作用下,它们被描述为诱导不可逆转的衰老。42同样的细胞因子可抑制弥散性4T07乳腺癌细胞在肺内的增殖。

这可能是由于环境因素在播散性癌细胞中诱导了肿瘤干细胞的性质。62,这与低循环频率是一致的。这种癌症干细胞将是一个潜在的转移库。63以应对环境变化。为什么休眠的癌细胞在几十年后才会被唤醒?3它仍然是神秘的,不能排除不同的途径汇合来启动休眠病变的生长。假设CD8+T细胞是维持休眠所必需的,组织滞留记忆c88的消耗是可以想象的。+T细胞可能导致休眠细胞的觉醒。肿瘤切除和抗原丢失可能会导致免疫记忆减弱;在没有抗原的情况下,组织驻留记忆细胞被描述为特别不稳定。64,65。或者,休眠细胞本身可能会改变,例如失去阻止免疫介导清除的分子的表达。66。最后,最广泛意义上的环境因素可能会唤醒休眠的癌细胞。微环境的这些变化包括纤维化。67,组织重塑68、肥胖69、发炎70,血管稳态紊乱71、糖皮质激素72或香烟烟雾73。这些因素如何导致休眠细胞的循环,以及免疫细胞在这个阶段是否能干扰尚不清楚。

在这里我们发现CD 39+Pd-1+CD8+T细胞介导播散性癌细胞的休眠,但不能完全根除所有癌细胞。这在临床上是高度相关的,因为潜伏的癌细胞很可能是未来转移疾病的来源。由于决定觉醒的因素是未知的,甚至可能是无法控制的,因此更好地了解休眠癌细胞的性质以及必须动员哪些途径来彻底消除它们是很重要的。


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