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SPOP和ERG在前列腺癌雄激素治疗反应中的双重作用

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发表时间:2021-02-04 14:25作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

在肿瘤发生过程中,具有相互排斥突变模式的驱动基因被认为具有重叠的作用。相反,我们在这里展示了相互排斥的前列腺癌司机的改变埃尔格转录因子与泛素连接酶适配器SPOP都是人造病。在分子水平上,不相容的癌症通路是由SPOP中的相反功能驱动的。ERG上调野生型SPOP抑制雄激素受体(AR)信号,并通过降解溴结构域组蛋白读取器ZMYND 11来维持ERG活性。相反,SPOP-突变肿瘤稳定ZMYND 11,抑制ERG-功能,并启动致癌雄激素受体信号。这种二分法调节对AR通路的治疗干预的反应。突变型SPOP使肿瘤细胞易受雄激素剥夺治疗的影响,ERG则可促进肿瘤细胞对大剂量雄激素治疗的敏感性和野生型SPOP的药理抑制作用。更广泛地说,这些结果定义了一种独特的对抗性癌症驱动因素,并为它们的治疗开发提供了蓝图。

导言

正常细胞通过获得所谓的驱动基因中的遗传畸变而转化为癌细胞。在某些情况下,不同基因的功能冗余导致肿瘤基因组相互排斥的突变模式,因为一次改变就足以激活特定的致癌途径。基于这一假设,已经产生了一些生物信息工具,用于在较大的癌症基因组数据集中寻找突变基因的功能冗余。1,2.

在前列腺癌中,复发的基因融合涉及埃尔格泛素连接酶适配器中转录因子和点突变的研究SPOP这是两个相互完全分布在肿瘤基因组上的截短突变(图一)。1A和补充图。1A)3,4,5,6,7,8,9。造成这种精致图案的根本原因仍然存在争议。而早期的研究表明,突变体spop和ERG之间存在功能冗余,这是基于突变体spop稳定ERG癌蛋白的结果。10,11,最近的研究通过显示肿瘤发生差异的描述性证据来挑战这一观点。3,12.

图1:SPOP埃尔格都是人造病。

a遗传变异的分布SPOP埃尔格TCGA数据库中333例原发性前列腺癌3,8,9. bC57BL/6小鼠前列腺上皮样组织的三维生长n=3,技术复制)。有代表性的亮场图像和苏木精和伊红(H&E)染色切片。cVCaP异种移植物在免疫受损小鼠体内过度表达SPOP的体内生长(每组,n=10)。dVCaP细胞过表达SPOP的免疫印迹及相应的蛋白质水平的定量显示为热图。蛋白表达变化为β-actin和对照细胞。n=2)。e稳定高表达ΔERG或控制载体的LuCaP-147 PDX(SPO-Y83C)建立的异种移植物的肿瘤生长动力学(每组,n=10)。相应的免疫印迹和定量被描绘成一个热图。蛋白表达变化以VCL和对照细胞为标准。fVCaP细胞高表达SPOP的剂量-反应曲线及ETS抑制剂YK-4-279处理。所有错误条,平均值+S.E.M.P-数值由单因素方差分析(b)或双向方差(c, e, f)进行多重比较,并使用Benjamin amini-Hochberg后测调整*P < 0.0001. Molecular weights are indicated in kilodaltons (kDa). Source data are provided as a Source Data File.

在这里,我们展示了SPOP-和埃尔格突变型癌症亚型是由拮抗的致瘤途径驱动的,这些途径涉及到SPOP和雄激素受体信号水平的根本不同的作用。肿瘤发生的差异与雄激素受体通路对SPOP抑制和干扰的特异性敏感性有关。

结果

ERG癌基因激活与SPOP错义突变是合成病态

为了阐明这些反复出现的驱动基因的功能关系,我们评估了SPOP突变和ERG激活对小鼠前列腺上皮样组织细胞生长的影响。为此,我们首先建立并验证了多层结构的细胞器,CK5和CK8分别在基底细胞和腔内细胞中表达(附图)。1B)。与近期报道一致的是,慢病毒介导的SPOP点突变体(SPOP-Y87C,SPOP-W131G)或截短型ERG,通常与前列腺癌中雄激素调节基因(ΔERG,氨基酸33-486)融合,促进细胞生长(如图所示)。1B和补充图。1C)13,14,15,16。SPOP突变体呈圆形,ERG过度表达则产生特征性手指状突起。令人惊讶的是,这两种基因的联合表达大大降低了细胞生长,减少了手指状突起,这意味着这两种基因改变之间存在着一种合成的病态关系。细胞学随访显示Ki-67降低,p16、P-HP1y阳性表达增加,细胞质空泡化,与衰老诱导相适应(补充图)。1D).

我们想知道,观察到的合成病态关系是否也适用于来自晚期、耐阉割性转移疾病的已建立的癌细胞。突变体SPOP(SPOP-Y87C,SPOP-W131G)的强制表达促进了大鼠的三维生长。埃尔格融合阴性LAPC-4人前列腺癌细胞(补充图。2A)。在致癌作用的同时,癌基因转录因子MYC和HOXB 13的表达增加,而细胞周期抑制因子p21的表达减少,这在一种来源于SPOPF133V-突变转基因小鼠(附图)。2A,b)13。相反,我们观察到VCaP人前列腺癌细胞的表型和分子改变与复发性相反。TMPRSS 2-ERG聚变(图1.1C,d和补充图。2C,d)。在此背景下,突变型SPOP(SPOP-Y87C,-F102C,-W131G,-F133S)能显著抑制癌细胞的增殖和体内移植瘤模型的生长。与小鼠前列腺器官类似,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-GAL)阳性细胞增多,p21和GDF 15蛋白水平上调,可作为诱导小鼠前列腺衰老的证据。与此相一致,表达突变型SPOP的VCaP细胞(SPOP-Y87C,SPOP-W131G)条件培养基的转移也降低了亲本VCaP细胞的增殖,提示衰老相关分泌表型(SASP)可能是参与合成病态关系的生物学途径之一。1D和补充图。2F,j).

相反,ΔERG的强制表达在体内和培养中均显著降低了SPO-Y83C突变体LuCaP-147患者源性异种移植物癌细胞的生长。1E和补充图。3A,b)17在晚期前列腺癌中加入正交支持,以支持突变体spop与ΔERG之间的合成病态关系。此外,MYC的过表达促进VCaP和LuCaP-147细胞的生长(附图)。3C,d)。后一项发现可能暗示过度表达系统本身并不是上述合成病态关系的潜在原因。

下一步,我们想知道是否基因或药物抑制ERG信号可能恢复突变的SPOP在VCaP细胞中的生长抑制功能。事实上,短发夹RNA干扰抑制ERG抑制VCaP对照细胞和过度表达野生型spop的细胞的生长,而促进过表达spop-w131G(补充图)的细胞的生长。3E)。此外,低剂量的ETS抑制剂YK-4-279能特异性地促进VCaP细胞高表达突变型SPOP的生长。1F)。当VCaP细胞与SPOP(补充图)的小分子抑制剂共同处理时,我们注意到了类似的效果。3F)18。总之,这些数据支持前列腺癌细胞ERG的致癌激活与SPOP功能丧失之间的拮抗关系。

突变体spop诱导的雄激素受体信号拮抗ERG活性

对抗性关系的分子生物学基础研究埃尔格-熔融和SPOP-突变型肿瘤,我们询问来自TCGA组的转录序列,以指定这些肿瘤亚型之间的差异。事实上,无偏主成分分析(PCA)揭示了转录输出的显著差异(图1)。2A)。在去势耐药前列腺癌(Crpc)(SU2C)队列中,采用单样本基因集富集分析方法(图1)保持了这些差异。2B和补充数据1)。此外,衍生(Pdx)模型还保留了模拟转录差异,如SPOP-突变体(LuCaP-78,−147)和埃尔格-融合模型(LuCaP-35,−23.1,VCaP细胞)。2B和补充数据1).

图2:原发性前列腺癌患者的转录组分析显示SPOP突变型和埃尔格-融合肿瘤亚型。

aPCa-基于RNA-Seq衍生mRNA表达水平的分析(TCGA队列)。埃尔格-熔合(紫)和SPOP-突变型(绿色)。如材料和方法所描述的那样,个体被标注为亚型。b应用于CRPC样本(SU2C-2019队列,左)和PDX-模型的SPOP集成签名(见材料和方法)转录活性的盒形图。分数是由来自原发性前列腺肿瘤(TCGA-Cohort)的基因决定的.Erg-融合样品用紫表示,SPOP-突变样本用绿色表示.不携带SPOP突变或ERG重排的样本以灰色表示。P-用Wilcoxon秩和检验确定值,并调整为多次检验。个人。(实例尺:max=0.22;min=−0.75;−=0.31;Q2(25%)=−0.47;Q3(75%)=−0.13,其他:max=0.88;min=−0.55;Center=−0.03;Q2(25%)=−0.20;Q3(75%)=0.12,SPOP:max=0.79;Min=−0.02;中心=0.50;Q2(25%)=0.19;Q3(75%)=0.64)。c之间的比较导致的所有差异绑定(DB)区域的每个绑定站点的规范化读取数。埃尔格-熔合(紫)和SPOP-突变(绿色)样本。分析仅限于显示经调整的DB区域P-数值(FDR)低于0.05(由DiffBind/DESeq 2管道确定)。随后,用Wilcoxon秩和检验ERG与SPOP亚组间的显着性差异。(−=8.14;min=8.14;中心=1.51;Q2(25%)=0.74;Q3(75%)=2.39,SPOP=7.03;min=−1.07;中心=2.76;Q2(25%)=2.11;Q3(75%)=3.48)。

在……里面SPOP-突变型前列腺癌,几种SPOP底物(如NCOA 3、TRIM 24、BET蛋白)已被证明能促进AR通路,最终导致AR靶基因的高水平(补充图)。4A)3,13,19,20,21,22,23,24,25,26。相反,埃尔格融合癌细胞通常表达较低水平的AR靶基因,如广泛采用的AR评分(补充图)所示。4A)3。我们进一步对这两种肿瘤亚型进行了差异表达分析,以更深入地了解这种不同的行为。基因集富集分析导致正常雄激素反应通路明显上调。SPOP-突变体V.埃尔格-融合肿瘤,由相应的Hallmark基因集定义,由分子标记数据库(MSigDB)(补充图)策划。4B)。与图中PCA图中所识别的转录组特征的差异相一致。2A,一个明确的划分SPOP-变种人和埃尔格-融合的肿瘤也在各自的脑池对应物中被报道。25。通过对芯片-seq数据的重新分析,我们可以确定两种肿瘤类型之间最不同的结合区域是在SPOP-突变型肿瘤(图1.2C和补充数据2).

其次,我们分析了过表达SPOP突变体(SPOP-MTS;SPOP-Y87C,-F102C,-F133S)的VCaP细胞转录组的变化。不偏不倚的特征分析显示雄激素反应显著增加,重复了原发性前列腺癌的变化(补充图)。4B5A, b)。基于这些结果,我们认为雄激素受体(AR)信号的差异水平在SPOP-突变体V.埃尔格-融合癌可能是驱动程序事件之间不兼容的根源。因此,我们特别分析了vcap细胞中AR-和erg相关的转录,并利用芯片-seq数据和匹配的rna-seq样本(补充数据)生成自定义标记。3)27。如预期的那样,SPOP-MTS增加了AR结合的基因的转录,增加了由其配体二氢睾酮(DHT)诱导的基因转录,而与AR结合和DHT抑制的基因则进一步减少。3A,补充图。5C,以及补充数据35)。值得注意的是,我们观察到只有ERG结合的基因受到相反的影响。突变体SPOP分别下调ERG诱导的基因(如MYC)和上调ERG抑制基因(图1)。1D1D、图1.,以及附图。5D)。为了减少属于我们自定义签名范围的基因的数量,我们使用了一种特别严格的方法,并考虑只与AR和ERG结合位点重叠至少1 bp的基因。因此,一些基因(例如CDKN1A/p21)在启动子区域被AR和ERG结合,但它们的结合不重叠,尽管它们是真正的共同结合靶标,但不包括在这类基因中。

图3:突变体SPOP诱导雄激素受体信号转导,拮抗ERG活性.

a基于RNA-seq数据的VCaP细胞高表达SPOP突变体(SPOP-MTS;SPOP-Y87C,-F102C,-W131G)与SPOP-野生型(-WT)的基因集富集分析。每个条件下使用三个重复进行实验。在直接雄激素受体(AR)和ERG靶基因(补充数据集1)的自定义基因集上确定了该基因的丰富程度。浓缩和FDR调整P-数值是用照相机(预选)b维恩图和热图描绘了AR/ERG共结合基因在VCaP细胞(SPOP-Y87C、F102C、W131G)、SPOP-WT和矢量控制细胞中的表达,这些基因被ERG抑制,DHT诱导。利用欧氏距离对基因(行)和样本(列)进行聚类。用方差稳定变换(VST)对基因表达值进行归一化,并在聚类前按行进行缩放和中心化。列表示每个条件的三个副本的平均表达式。c将SPOP-MTS(SPOP-Y87C,F102C,W131G)与野生型SPOP-野生型(WT)高表达VCaP细胞进行比较,发现两维网络代表10个最显着富集的Hallmark和定制基因集之间的重叠。边缘厚度与Fisher检验测得的连通节点重叠的显着性成正比。只显示FDR值<0.05的边缘。节点的大小与基因集富集的意义成正比,并等于−10×log。10(罗斯福)。d代表基因集活性的热图按肿瘤亚型分层,来源于tcga队列。每个肿瘤组均考虑单样本GSEA评分的平均值.值被缩放并引用到没有任何ETS融合的样本(埃尔格, ETV 1,和ETV 4)或点突变SPOP3.

细胞周期基因(如E2F和MYC靶标)的下调与此基因的显著上调平行,这意味着诱导的AR/ERG共结合基因、ERG靶点的抑制、细胞分化以及ERG与突变体SPOP的合成病态关系之间存在直接联系。1D,补充图。5A-E,以及补充数据6,7)。AR-和ERG相关的自定义签名与标记基因集的关系在图中得到了强调。3C在二维网络中。此外,VCaP过度表达SPOP突变体,丰富了衰老相关转录本的独立特征,进一步证实了衰老诱导的细胞周期阻滞的数据(补充图)。5F)28,29.

相反,我们评估了低DHT水平下ERG在LNCaP细胞中过表达的后果,即突变的SPOP触发AR信号和肿瘤生长(附图)。6a,b和补充数据89)19,23。在此背景下,ΔERG的过度表达有力地逆转了与细胞增殖(如E2F和MYC靶点)和AR信号有关的信号的诱导。综合来看,这些数据表明突变体SPOP诱导的AR信号与ERG癌基因的功能相互不相容。

接下来,我们验证了是否在临床组织标本中发现了相应的转录变化。事实上,从vcap细胞中筛选出的ERG调控基因被上调。埃尔格-融合和下调SPOP-突变型原发肿瘤(图1.三维空间,补充图。6C,以及补充数据10, 11)3。值得注意的是,两组之间最显著的变化是在原发性前列腺癌的AR/ERG共结合基因中再次发现的(补充图)。6d和补充数据12, 13)3,6。研究结果强调了我们基于细胞培养的数据的相关性,并强调了我们之间的转录差异。埃尔格-和SPOP-由肿瘤驱动

ZMYND 11是一种全新的SPOP基板

利用串联质量标签(TMT)定量质谱技术,寻找可能影响AR和ERG活性的SPOP底物,从而导致突变型SPOP与ERG在VCaP细胞中的合成病态关系(SPOP-MTS;SPOP-Y87C,-F102C,-W131G,图)。4A和补充数据14)。当周期性功能缺失的SPOP突变体损害底物泛素化和蛋白酶体降解时,我们寻找表达水平增加而mRNA水平不同时增加的蛋白质(如图所示)。4B,补充图。7A,以及补充数据15)。总之,我们注意到蛋白质与mRNA表达的变化有很强的相关性,我们的AR和ERG自定义标记在蛋白质水平上的变化是一致的(如图所示)。4B和补充图。7b,c)。此外,我们还发现已知的SPOP底物和AR激活剂TRIM 24在蛋白水平上有明显的上调(图一)。1D4A;补充数据14)22,23然后评估TRIM 24和更一般的AR是否与突变体SPOP和ERG之间的合成病态关系有关。事实上,两个短发夹RNA敲除TRIM 24,部分恢复了突变体-SPOP对VCaP细胞的生长抑制作用,降低了AR信号(补充图)。7D-f),而AR的过度表达足以抑制细胞生长(附图)。7g,h).

图4:ZMYND 11是一种新的SPOP基板。

a图示展示了蛋白质组学实验的设计。基于TMT的定量质谱(TMT)n在VCaP细胞过表达控制载体(Control)、SPOP-WT或3种不同的SPOP突变体(SPOP-Y87C、SPOP-F102C和SPOP-W131G)中使用。b比较SPOP-Y87C、-F102C、-W131G细胞与SPOP-WT VCaP细胞比较的转录和蛋白质组学折叠变化的散点图。(n=3表示转录组,n=2(蛋白质组)。属于DHT诱导/ERG抑制基因标记(AR+ERG共结合)的基因以红色突出.TRIM 24和ZMYND 11是最上调的蛋白质,在mRNA水平上没有改变,并以绿色突出。CDKN1A(P21)在mRNA和蛋白质水平均上调,而MYC在mRNA和蛋白质水平均表达下调。c透明质酸ZMYND 11和SPOP-WT在293 T细胞中的高表达及免疫印迹分析n=2)。d293 T细胞高表达HA-ZMYND11-WT的全细胞提取物(WCE)和不同的SPOP种类及相应的抗HA免疫沉淀(HA-IP)。免疫印迹法检测上述蛋白的表达。n=1)。eZMYND 11的结构域结构与指示的SPOP-degron和泛素位点。fSPOP-WT与HA-ZMYND11-WT或两个DMT 1和DMT 2在293 T细胞中的强制表达n=1)。g透明质酸ZMYND 11在293 T细胞中的泛素化实验。瞬时转染细胞,组氨酸标记(His-Tag),泛素化蛋白被镍珠拉下来。免疫印迹法检测未泛素化HA标记的ZMYND 11。n=1)。h透明质酸ZMYND 11和SPOP-Y87C在293 T细胞中的高表达及MG 132抑制蛋白表达的免疫印迹分析。i293 T细胞高表达HA-ZMYND11-WT的全细胞提取物(WCE)和相应的抗HA免疫沉淀(HA-IP)和不同的SPOP-MTS种类。免疫印迹法检测上述蛋白的表达。n=1)。j透明质酸ZMYND 11在293 T细胞中的泛素化实验。将所指示的结构和组氨酸标记(His-Tag)瞬时转染细胞,用镍珠将泛素化蛋白提取下来。免疫印迹法检测未泛素化HA标记的ZMYND 11。n=1)。k在VCaP、LNCaP和LAPC 4人前列腺癌细胞中有大量的蛋白表达。分子量以千吨(千达)表示(n=3)。源数据作为源数据文件提供。

最显着的上调是对溴结构域组蛋白读取器ZMYND 11的关注(图11)。4B)。与SPOP底物一致,野生型SPOP以蛋白酶体依赖的方式结合并降低了HA-ZYMND 11的表达。4C,d)。我们发现两个degron序列是有效的SPOP介导的泛素化和蛋白质降解所必需的(如图所示)。4E-g和补充图。8A)。如所料,SPOP突变体不能结合并充分泛素化HA-ZMNYD11-WT。4H-j)10,11,20,21,22,24,25,26。最后,我们证实了突变体SPOP的表达延长了VCaP细胞内源性ZMYND 11的半衰期,并上调了其他前列腺癌细胞中ZMYND 11的表达。4K和补充图。8B).

ZMYND 11诱导AR信号通路抑制ERG活性

接下来,我们评估ZMYND 11蛋白的上调是否也参与了合成的病态关系。作为支持,强迫表达ZMYND 11的Degron缺陷变异体(HA-ZMYND11-DMT 1/DMT 2)足以抑制VCaP细胞的生长(图一)。5A,b和补充图。8CZMYND 11的基因敲除部分恢复了突变体SPOP介导的生长抑制作用。5C).

图5:ZMYND 11诱导AR信号通路,抑制ERG活性。

a, b指示蛋白的免疫印迹(n=2)(a)和相应的2D增殖试验(b)的VCaP癌细胞高表达HA-ZMNYD 11-WT和衍生的degron缺陷突变体(DMT 1/2)。n=3)。细胞活力与ZMYND 11蛋白表达变化的相关性经验。),以同一细胞株中的免疫印迹进行量化。P-用Pearson秩相关法计算。cVCaP癌细胞在有或不表达SPOP物种时的细胞活力变化ZMYND 11在第16天用两种不同的短发夹RNA打倒(n=3)具有多重比较的单因素方差分析,并采用Benjamin amini-Hochberg后测进行调整.免疫印迹法检测上述蛋白的表达。dSPOP-MTS或HA-ZMYND11-DMT2在VCaP细胞中转录调控基因的Chord-图(FDR<0.05)。字符串的厚度与共享元素的数量成正比,表示集合之间的共同基因。e基因集e基于RNA-seq数据,对VCaP细胞高表达的HA-ZMYND11-DMT2与对照进行了比较分析。对直接雄激素受体(AR)和ERG靶基因的自定义基因集进行了丰富。FDR调整P-数值是用照相机(预先排名)。f热图of芯片-seq信号周围的TSS区域(+/−4kb),在其中ZMYND 11结合被识别的峰值调用程序(Mac 2)在VCaP细胞过度表达指示结构。gIGV衍生截图,代表突变型SPOP(SPOP-Y87C)与野生型SPOP过度表达的VCaP细胞中ZMYND 11结合的对数似然比。报道有MYC(上)及CDKN1A(下)所有误差条,平均值±S.E.M。P-数值由双向变异系数(b分子量以千吨数表示。源数据作为源数据文件提供。

我们推测ZMYND 11上调可能通过抑制ERG癌基因的转录活性或增强AR信号来促进合成的病态关系。因此,HA-ZMYND 11-DMT 2诱导的表达变化与突变体SPOP所干扰的基因有很大的重叠,而当ZMYND 11的表达被RNA干扰所抑制时,则相反。5D,补充图。8D,以及补充数据16)。与突变型SPOP相比,HA-ZMYND11-DMT2对AR和ERG靶基因也有类似的调控作用(图二)。5E和补充数据17, 18)。ZMYND 11的PWWP结构域通过与h3k36me3组蛋白标记结合而参与转录调控。30,我们测试了这个结构域对整个转录输出的贡献。事实上,VCaP细胞的PCA高表达HA-ZMYND11-DMT2或PWWP结构域缺陷突变体(W294A)显示了该结构域对ZMYND 11诱导转录改变的重要贡献(补充图)。8E).

随后,通过染色质免疫沉淀测序(芯片-seq),将ZMYND 11在表达SPOP-Y87C突变体的VCaP细胞中的基因组占位定位,并在控制ERG诱导基因(如MYC)和AR/ERG共结合基因(如p 21/CDKN1A)的启动子区域发现ZMYND 11结合位点的富集。5F,g,补充图。9A-E,以及补充数据1922)。这些数据提示ZMYND 11在促进AR信号和抑制突变体SPOP下游ERG信号方面具有关键的增强子功能。

野生型SPOP是ERG致癌功能所必需的

我们推测ERG驱动的肿瘤可能需要野生型SPOP来降解ZMYND 11并解除ERG的致癌功能。在支持下,野生型SPOP的过度表达只有在ERG过表达时才能促进小鼠前列腺上皮样组织和VCaP细胞的三维生长(图1)。1B、补充图。2C10a,b)。值得注意的是,ERG融合的人肿瘤组织也显示出最高的SPOP mRNA水平。6A)。因此,我们怀疑ERG本身是否可以直接上调SPOP的转录,以支持其自身的致癌活性。事实上,在VCaP细胞中挖掘ERG芯片-seq数据显示了ERG结合位点在SPOP(补充图)的启动子区域。10C)。ERG的敲除降低了VCaP细胞中的SPOP蛋白水平,而ΔERG的强制表达则导致PC3细胞中SPOPmRNA和蛋白水平的升高(如图所示)。6B、补充图。3E10d).

图6:SPOP-WT是ERG介导的细胞侵袭所必需的ERG靶基因.

a SPOP333例原发性前列腺癌组织中mRNA表达水平的研究3。误差条,平均±S.D。b分别用qPCR和免疫印迹法检测ΔERG在PC3前列腺癌细胞中的表达。误差条,平均值+S.E.M.(n=3)。P-数值由未配对的双尾学生决定t-测试。控件与ΔSPOP表达水平。控件与Δ埃尔格表达水平。c用两种不同的短发夹RNA强迫表达Δ、ERG和敲除PC3细胞的Transwell Matrigel侵袭实验。免疫印迹法并行检测上述蛋白的表达。误差条,平均值±S.E.M.(n=3)(标杆代表400米)。d用Δ、ERG和HA-ZMYND11-DMT 2强制表达法检测PC3细胞的Transwell Matrigel侵袭性,并进行相应的免疫印迹分析。误差条,平均值±S.E.M.(n=3)(标杆代表400米)。eΔERG-和HA-ZMYND11-DMT 2诱导ERG靶基因转录变化的分析PLAU平地。所有误差条,平均值±S.E.M。P-数值采用单因素方差分析,多次比较,并采用bjamini-hochberg后测进行调整(a, c, d, e)。NS,没什么意义。分子量以千吨数表示。源数据作为源数据文件提供。

然后,我们询问,在强迫Δerg表达的情况下,spop水平的升高是否对雄激素无关的pc 3细胞中Δerg的致癌活性产生了功能影响,其中erg促进了肿瘤细胞的侵袭。31。事实上,RNA干扰降低了ΔERG入侵Matrigel的能力(如图所示)。6C)。同样,在VCaP细胞中敲除SPOP可降低三维细胞培养中细胞的生长,并破坏ERG介导的基因转录(附图)。10E,f和补充数据2324)。根据突变体SPOP以显性-阴性方式抑制内源野生型SPOP功能的能力,突变型SPOP(SPOP-Y87C,-F102C,-W131G,-F133S)的过表达表现出SPOP基因敲除对ERG介导的PC3细胞侵袭作用的影响(附图)。10g,h)。与ZMYND 11对ERG的抑制作用一致,我们发现HA-ZMNYD 11-DM2的过度表达足以抑制ERG诱导的PC3细胞侵袭和建立靶基因。6d,e)。综上所述,这些数据表明存在一个正的前馈环,其中ΔERG促进了spopp的表达,以维持其致癌活性。

ERG和突变型SPOP引起治疗干预的不同反应。

基于上述肿瘤发生的差异,我们推测ERG或突变的SPOP也可能引发不同的治疗反应。根据ERG驱动的肿瘤对野生型spop功能的依赖性,我们假设埃尔格融合阳性细胞对SPOP的药理抑制可能特别敏感。我们分析了spop小分子抑制剂化合物6b(spop-1)在埃尔格-熔断,SPOP突变体,以及其他前列腺癌细胞系和患者来源的异种移植模型(Pdx)18。SPOP抑制剂提高了已建立的SPOP底物和ZMNYD 11的mRNA水平,而相关的非活性类似物6c却没有增加(补充图)。11A-c)。后者在3D培养模型中也没有发挥任何作用(补充图)。第11d)。与我们先前的结果一致,我们发现埃尔格-融合细胞(vcap,lucap-23.1,−35)对spop-i的敏感性高于埃尔格-阴性细胞(22Rv1,LNCaP,PC3)SPOP突变细胞(LuCaP-78,−147)在三维培养模型和体内异种移植瘤模型中特别不敏感。7A-f和补充图。11E)。我们进一步验证了我们在小鼠前列腺上皮样组织中的结果,并证实了ΔERG表达细胞对此等基因系统抑制的敏感性增加(如图所示)。7g).

图7:埃尔格-阳性肿瘤细胞对SPOP抑制特别敏感。

aSPOP抑制剂(SPOP-I,化合物6b)介导甲基纤维素对前列腺癌细胞系的三维生长抑制作用。b肿瘤生长动力学n=10)或无(车辆);n(10)SPOP-I处理从LuCaP-147(SPOP-Y83C)PDX细胞建立的异种移植物。c肿瘤生长动力学n=4)或不包括(车辆);n(4)SPOP-I处理从LuCaP-78(SPOP-W131G)PDX细胞建立的异种移植物中。d肿瘤生长动力学n=11)或无(车辆);nSPOP-I在VCaP建立的异种移植物中的作用。e肿瘤生长动力学n=6)或无(车辆);n=8)LuCaP-23.1的SPOP-I治疗(ERG-阳性)f肿瘤生长动力学n=8)或无(车辆);nSPOP-I治疗LuCaP-35(ERG阳性)PDX。所有SPOP-I治疗在肿瘤平均达到100 mm时开始。3. g高表达ΔERG、SPOP-Y87C和控制载体的小鼠前列腺器官的剂量-反应曲线。所有错误条,平均值+S.E.M.P-数值采用双向方差分析,多次比较,用Šidák后测进行调整.NS,没什么意义。****P < 0.0001. Molecular weights are indicated in kilodaltons (kDa). Source data are provided as a Source Data File.

鉴于野生型SPOP在ERG中抑制AR功能以维持肿瘤生长的观点,我们询问VCaP细胞是否特别易受DHT升高的影响。事实上,体内大剂量睾酮或体外dht对突变体spop的过度表达有相似的分子变化,并极大地抑制了dht在体内的生长。埃尔格-融合阳性细胞SPOP突变细胞在体外和体内(图五。1C和8A-f;补充图。12A-E和补充数据2526)。此外,DHT处理VCaP细胞时,衰老相关转录本的特征也丰富了,进一步证实了衰老诱导的细胞周期阻滞的数据(补充图)。12F)。引人注目的是,对SPOP-I和体内高睾酮的敏感性与ERG融合阳性细胞系和PDX模型中ERG蛋白的表达水平密切相关。8g,h)。该数据表明,对于表达高水平ERG的前列腺癌,SPOP抑制或大剂量雄激素治疗有一个治疗机会。

图8:ERG和突变的SPOP引起不同的治疗干预反应。

aDHT处理VCaP、LuCaP-35、LuCaP-78和LuCaP-147 PDX细胞的剂量-反应曲线。在DHT处理前,PDX在不含DHT的标准培养基中生长。在CSS培养基(RPMI+10%去炭血清)中饥饿24h。2周后检测细胞活力。b肿瘤生长动力学n=10)或无(车辆);n10)用LuCaP-147(SPOP-Y83C)建立的异种移植体内睾酮治疗。c肿瘤生长动力学n=4)或不包括(车辆);n4)从LuCaP-78(SPOP-W131G)细胞建立的异种移植体内睾酮处理。d肿瘤生长动力学n=6)或无(车辆);n10)用ERG阳性细胞建立的异种移植体内睾酮处理。e肿瘤生长动力学n=12)或无(车辆);n(12)从LuCaP-23.1(ERG-阳性)细胞建立的异种移植体内睾酮处理。f肿瘤生长动力学n=10)或无(车辆);n10)从LuCaP-35(ERG-阳性)细胞建立的异种移植体内睾酮处理。g异种移植和PDX模型对睾酮和SPOP-I治疗的敏感性。LuCaP-23.1、LuCaP-35和VCaP分别为埃尔格-阳性癌细胞。LuCaP-147和LuCaP-78是SPOP突变型癌细胞(分别为SPOP-Y83C和SPOP-W131G)。生长抑制是用最近的肿瘤测量来计算的,如b-f和图所示。7b-f. h扩展数据图显示的SPOP-I或睾酮治疗敏感性的相关性。8F-j和9e-i,在PDX模型和异种移植物中,用免疫印迹法测定ERG蛋白水平。P-用Pearson秩相关法计算。相应的免疫印迹和定量的AR和ERG蛋白水平被描绘为一个热图。蛋白表达变化以GAPDH和LuCaP-78为标准。所有错误条,平均值+S.E.M.P-数值经多次比较后经双向方差分析确定,并采用bjamini-hochberg后测进行调整(be)或不成对的双尾学生t-测试(g),NS,不显着。分子量以千吨数表示。源数据作为源数据文件提供。

相反,因为SPOP突变型癌症主要由雄激素信号驱动,因此在人类肿瘤组织中显示AR相关转录本的高水平激活,我们推测这些肿瘤可能特别容易受到雄激素剥夺或抗雄激素治疗(ADT)的影响(补充图)。4C)。事实上,SPOP原发性肿瘤--以及在初次手术或放射治疗后进展中的肿瘤--的突变一直高于对随后的ADT产生耐药性的肿瘤(也称为去势耐药前列腺癌,CRPC,附图)。13A)。这一差异可能与SPOP突变肿瘤对ADT的更好反应有关,SPOP突变型肿瘤虽然在最初治疗后取得了更快的进展,但仍呈现出更好的整体生存的趋势(图一)。9a,b)。为了从功能上分析雄激素剥夺或抗雄激素氮杂胺反应,我们选择在雄激素依赖性人LAPC 4前列腺癌细胞中表达不同的Δ变异体和ERG,这两种驱动基因都是野生型。根据临床观察,与表达控制载体的细胞相比,突变型SPOP(SPOP-Y87C,SPOP-W131G)使LAPC 4细胞比表达控制载体的细胞更易受ADT或苯扎路酰胺的影响。9C和补充图。13B).

图9:SPOP突变型肿瘤对雄激素剥夺疗法(ADT)特别敏感。

a来自TCGA队列的前列腺癌患者的无进展生存期。代表TMPRSS2-ERG重排和SPOP-突变患者的曲线分别用紫罗兰色和绿色表示.曲线周围的面积代表80%的置信区间。左下角的条形图显示所有被诊断为前列腺癌(DIAG)的患者中SPOP-突变型肿瘤的百分比,以及发生这种疾病(PROG)的个体中的比例。P用对数秩检验确定Kaplan-Meier曲线的值(P=0.115)。b前列腺癌患者的总体生存率来源于MSK-冲击队列。曲线表示TMPRSS 2-ERG重新排列,以及SPOP-突变病人分别用紫罗兰色和绿色表示。曲线周围的面积代表80%的置信区间。左下角的条形图显示了在所有被诊断为前列腺癌(DIAG)的患者中,在发生转移性进展(PROG)的患者中,以及在发生去势抵抗的前列腺癌(CRPC)的患者中,SPOP突变肿瘤的百分比。P用对数秩检验确定Kaplan-Meier曲线的值.(P=0.247)。cP-数值由未配对的双尾学生决定t-测试(c),NS,不显着。

相反,ΔERG使相同的细胞对佐那妥胺更有耐受性。根据先前在VCaP和LuCaP-147细胞中的研究结果,ΔERG的表达使LAPC 4细胞对高水平的DHT敏感,而突变型SPOP则相反(补充图)。13B)。综上所述,突变型SPOP和ERG对已建立的治疗方式和实验治疗方式的不同反应进一步证实了它们在肿瘤发生相关AR通路中的不同作用。

讨论

尽管近年来的多项研究发现了不同的原发性前列腺癌的基因亚型,但它们的生物学理解和治疗意义仍然是一个很大程度上尚未探索的领域。在这里,我们报告了两条完全不同的通向肿瘤发生的途径,这两条路径是由高度重复的错义突变引发的。SPOP或基因融合涉及埃尔格癌基因重要的是,野生型spop(野生型spop)是通过抑制AR活性来增强致癌ERG信号的关键成分,而突变型spop则通过激活AR信号来推动肿瘤的发生。此外,先前的一些研究强调了AR靶基因在spop突变体和ERG阳性肿瘤中的重要性。19,32,33。基于这两种肿瘤亚型之间的不相容性,我们的工作使我们能够开发出与AR和ERG转录本相关的特定的自定义签名,这对于在以下情况下驱动增殖和肿瘤发生是必要的。埃尔格-积极和积极SPOP-突变型肿瘤此外,我们还发现溴结构域组蛋白读取器ZMYND 11是SPOP下游的一种SPOP底物,参与了两种肿瘤亚型ERG和AR通路的反向调控(图1)。10)。AR和ERG通路曾被报道有部分拮抗关系。33,34进一步证实了我们的发现。

图10:拟建立的突变体间厌恶关系模型的示意图SPOP埃尔格前列腺癌。

在左边,SPOP本文描述了突变型前列腺癌的发生。SPOP突变型肿瘤损害了基质蛋白如AR激活因子(例如,TRIM 24)和ZMIND 11的降解,最终触发AR途径,抑制ERG信号。在这方面,SPOP突变型肿瘤对ADT治疗更敏感。在右边,TMPRSS 2-ERG突变的肿瘤发生被描述。Erg与野生型spop启动子结合,上调其蛋白表达.因此,AR激活子和ZMYND 11底物蛋白被降解,导致AR通路下调并释放ERG信号通路。TMPRSS 2-ERG因此,突变型肿瘤对大剂量雄激素治疗或SPOP抑制是敏感的.

由于雄激素对雄激素受体的激活是前列腺癌的一个重要的谱系特异性致癌途径,因此雄激素剥夺/抗肿瘤治疗(ADT)至今仍是一种统一的治疗方式。也就是说,对ADT的反应是高度可变的,可能从几个星期持续到许多年。在这里,我们提供了功能证据,证明先前存在的前列腺癌创建者突变影响治疗反应.最值得注意的是,SPOP突变促进了雄激素缺乏治疗的易感性。与我们的调查结果一致,早先的报告显示SPOP去势抗药性疾病队列中的突变肿瘤及对阿弗他酮和佐那妥胺的更有利反应35,36.

相反,我们发现ERG癌基因的存在增加了肿瘤细胞对大剂量雄激素治疗的敏感性,而表达突变体spop的细胞在很大程度上没有受到影响。这是临床上感兴趣的,因为睾酮治疗晚期去势症的患者最近已经证明,大约三分之一的患者会引起抗肿瘤反应。37。人们很容易推测,这些洞察力可能有助于区分响应者和非应答者。

此外,我们还提供了证据,证明突变体SPOP与ERG之间的拮抗关系可能被用于开发新的治疗途径。更具体地说,我们发现erg驱动的癌细胞对野生型spop的抑制特别敏感,使用最近开发的小分子抑制剂。18。我们的临床前数据表明,SPOP抑制在ERG表达强烈的临床环境中可能是有效的(例如,新佐剂环境或早期转移性疾病)。

我们的结果通常发现了另一种在前列腺癌中的拮抗驱动基因的范式,最近出现在其他类型的癌症中。38,39,40。类似于前列腺癌,截断点突变DNMT3A和基因融合PML-Rara是急性髓系白血病(AML)的相互排斥的驱动因素。与SPOP相似,完整的DNMT3A被发现对PML-Rara驱动的白血病至关重要(补充图)。14a,b)41,42。重要的是,我们在这里证明了前列腺癌的概念,对抗驱动基因可以被利用,以确定治疗机会。



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