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IL-23诱导调节性T细胞可塑性与炎症性皮肤病的关系

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发表时间:2021-02-03 15:11作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

Foxp 3+调节性T细胞(Tregs)占皮肤内T细胞的主要部分。虽然Tregs通常是保护性的,但在包括银屑病在内的人类疾病中,Tregs会产生促炎细胞因子。Treg领域的一个重要障碍是识别或开发模型系统来研究Treg塑性。为了克服这一空白,我们分析了小鼠IL-23介导的银屑病样皮炎模型中的皮肤滞留物。我们的结果表明,IL-23促进了Tregs的积累,其中包括一个共同表达RORγt并产生IL-17A的亚群体。该人群的发生被ROR、γ、t反式激动剂和临床相关治疗药物所削弱。离体,IL-23推动了CD4的产生。+Foxp 3+RORγt+伊-17A+来自Treg细胞的细胞。综上所述,我们的数据表明,IL-23通过诱导cd4群体来驱动Treg可塑性。+Foxp 3+RORγt+伊-17A+细胞可能在疾病的发病机制中起作用。通过这项工作,我们定义了离体系统和临床前体内小鼠模型,可用于进一步研究银屑病背景下Treg的动态平衡和可塑性。

导言

Foxp 3+调节性T细胞(Tregs)是维持自身耐受性和防止自身免疫的不可或缺的细胞。Tregs在建立免疫动态平衡过程中的非冗余作用表现在人类和小鼠多器官自身免疫的发展中,其中包括Foxp 3位点的突变。1,2。此外,越来越多的自身免疫性疾病报告了Tregs的数量或功能缺陷。3。这些发现突出了描述Tregs的个体发育、表型和功能的重要性,特别是在发炎的组织中。这些研究可能有助于开发新的治疗策略来治疗大量自身免疫性疾病。

Tregs的大部分来源于胸腺,也可以由幼稚的CD4诱导。+组织中T细胞介导外周耐受4。一些组织特异性的Tregs已经被描述为具有不同的转录特征和专门的功能。其中包括Foxp 3+结肠固有层、内脏脂肪组织和骨骼肌中的T细胞亚群5。除此之外,Foxp 3的数量异常高+T细胞存在于皮肤中。这个皮肤Treg子集是小鼠和人类皮肤的主要组成部分,它们表达不同的趋化因子受体,在维持免疫平衡和防止皮肤自身免疫方面发挥着重要作用。6,7。此外,还描述了许多炎症驱动的“效应”Treg亚群,它们对宿主有保护作用,也可能对宿主有害,这取决于炎症环境和组织。8。从保护的角度来看,表示Tbet、GATA 3/IRF 4或Bcl 6的Treg子集对于抑制Th1至关重要。9、Th210,11或Tfh12分别答复。此外,结肠RORγt+Tregs在调节Th17细胞应答和维持肠道室内宿主微生物共生方面起着重要作用。13。与之形成鲜明对比的是,在某些炎症条件下,Tregs可能是有害的,并已被证明能分泌效应细胞因子,并可能支持免疫病理。已经证明产生干扰素-γ的药物会加重多发性硬化症。141型糖尿病15。白细胞介素-17A的合成与类风湿关节炎的发病机制有关。16银屑病17。银屑病是一种典型的IL-17A和Th17细胞介导的自身免疫性疾病,其靶向抑制IL-23/IL-17轴是一种临床有效的治疗方法。18。除增加RORγt外+伊-17A+Th17细胞,即银屑病炎性细胞因子环境,已被证明能推动Tregs产生IL-17a。17。很明显,银屑病皮损皮肤中很大一部分是Foxp 3+表达IL-17A的细胞7,17,控制这些Th17类Tregs生成和维护的个体发育和信号节点(在文献中定义为Foxp 3)。+伊-17A+T细胞(T细胞)在知识方面仍然是一个很大的差距。由于缺乏研究Th17类Tregs在与人类疾病相关系统中的发展和功能的模型,这一领域的进展受到了阻碍。

在目前的研究中,IL-23诱导了Tregs的积累(在本手稿中定义为CD4)。+Foxp 3+T细胞),在皮肤中表现出更强的增殖能力。Treg细胞数的增加与Tregs的数量显著增加有关,后者共同表达ROR、γt并产生IL-17A。这些类似Th17的Tregs的发展和/或能力(在本手稿中定义为CD4)。+Foxp 3+RORγt+伊-17A+T细胞)通过ROR、γ、t信号转导调控IL-17A。在临床相关治疗药物中和肿瘤坏死因子-α或白细胞介素-23的存在下,这些人群的积累也减少了。IL-23本身就推动了CD4的产生。+Foxp 3+RORγt+伊-17A+离体Tregs细胞离体。我们的数据表明,IL-23推动Th17样Tregs的积累,这一群体可能与银屑病的发病机制有关。

结果

IL-23诱导的炎症促进了Tregs的积累和皮肤Tregs产生IL-17A。

我们对Th17样Tregs在银屑病中的起源和功能的理解受到了阻碍,因为这些细胞已经在人类皮肤中分化。为了克服这一障碍,在以人银屑病为代表的银屑病样皮炎小鼠模型中,研究了Tregs的可塑性。19,20。正如我们小组先前所报告的19,IL-23诱导耳朵厚度增加,呈时间依赖性。1A)与细胞总数和CD 45数量显著增加有关+耳朵里的白细胞。1B)。IL-23还显著增加了耳引流淋巴结的细胞密度(附图)。1A)。以前的研究表明,Tregs是CD4的主要组成部分。+皮肤T细胞室6,7...与这些发现一致的是,~20%的CD4+车辆处理动物耳部T细胞为Tregs(图1)。1C,D)。有趣的是,IL-23诱导的炎症导致耳中Treg细胞的频率和数量显著增加(图1)。1C,D)和引流淋巴结(补充图。1B)。因此,除了耳朵厚度和细胞总数的增加外,IL-23还会导致炎症部位Tregs的积累。此外,IL-23刺激了相当一部分的tregs进入细胞周期,其基础是ki 67的频率和数量增加。+耳中的Tregs(如图所示)。1英、法)和引流淋巴结(补充图。1C)。更重要的是,IL-23在皮肤和引流淋巴结中诱导了大量的Tregs产生IL-17A。而只有约1%的耳朵和引流淋巴结Tregs从车辆处理动物表达IL-17A,这是增加5-6倍,在IL-23治疗(图1)。1g,H;补充图。1D)。与已发表的关于IL-23驱动真皮αβ产生IL-17A的报道相一致+和γδ+T细胞21,22,23,IL-23也能诱导γδ产生IL-17A。+T细胞与Foxp 3αβ+T细胞(附图)2A,B),本报告将重点讨论IL-23对Tregs的影响。这些结果表明,IL-23介导的炎症支持了与IL-17A共同表达的Treg群体的积累。这些发现与银屑病患者皮损皮肤中发现的Tregs表型相一致。7.

图1

IL-23诱导的炎症促进了Tregs的积累。动物每天接受4次真皮内(耳)注射或IL-23(0-3天)的注射,并于第4天进行分析。A)耳朵厚度的测量。(B)细胞总数和CD 45的数目+耳朵里的细胞。(C)典型的CD 45活细胞流式细胞仪图谱+CD4+TCRβ+耳朵里的细胞。(D)Foxp 3的频率和数量+(直播CD 45)+CD4+TCRβ+Foxp 3+老鼠耳朵里的细胞。(EG)Foxp 3具有代表性的流式细胞仪图谱+耳朵里的细胞。(FH)耳内指示细胞群的频率和数量。(A)至少3个独立实验的代表性数据,n=4。BF)两个独立实验的汇总数据,n=8。GH)数据表示对2辆车或IL-23耳的综合分析。两个独立实验的代表性数据,每个实验至少n=3。活CD 45+CD4+TCRβ+Foxp 3+耳朵里的细胞被定义为Foxp 3+图中的细胞。*p < 0.05由学生的t测验决定。

IL-23诱导一群Th17样Tregs,这对rorγt抑制也是敏感的。

接下来,对这些细胞进行检测,以确定它们是否具有Th17细胞的其他表型特征。IL-17A产生T细胞(CD4)的特性研究+TCRβ+伊-17A+)在车辆处理动物的耳朵中表明,IL-17A+细胞主要为RORγt+和Foxp 3(无花果)2A)。相反,在白细胞介素-23治疗的动物中,很大一部分(10-15%)的CD4。+伊-17A+细胞共表达Foxp 3和RORγt。2A,B)。用RORγt反向激动剂(RORγt(I))评价这些细胞对药物抑制的敏感性,该激动剂已知能显著减轻IL-23介导的皮肤炎症(StephenGauld,等人.,正在审查中的手稿)24。应用AbbVie RORγt(I)在所有时间点均能显著降低IL-23所致的耳炎症(图1)。2C耳厚曲线下面积减少84%(如图所示)。二维空间)。重要的是,CD4的积累+Foxp 3+RORγt+伊-17A+IL-23处理小鼠的种群几乎完全被ROR、γ、t抑制所消除。2 E、F)。然而,总体上,在rorγt(I)存在下观察到的疾病严重程度的下降很可能是对所有rorγt减少IL-17a产生的全球性影响。+子集。这些结果清楚地表明,IL-23支持Treg细胞集落的积累,该细胞群体也共同表达功能RORγt并产生IL-17A。类似于Th17细胞,Th17样Treg细胞的发育和/或效应功能依赖于RORγt。

图2

IL-23诱导Th17样Tregs的形成,对RORγt抑制也很敏感。在第4天对车辆或IL-23处理过的耳朵进行分析。A)典型的CD 45活细胞流式细胞仪图谱+CD4+TCRβ+伊-17A+耳朵里的细胞。(B)活CD 45的频率+CD4+TCRβ+伊-17A+RORγt+Foxp 3+耳朵里的细胞。数据代表了两辆车或IL-23耳的综合分析。两个独立实验的代表性数据,每个实验至少n=3。(C)绝对耳朵厚度和(D)在RORγt(I)为100 mg/kg PO-Qd的情况下,用载体或IL-23处理小鼠曲线下面积(AUC)。(E)有代表性的流式细胞术图和(F)IL-23和RORγt(I)PO-QD处理的小鼠引流淋巴结中Th17样Tregs细胞的频率。活CD 45+CD4+TCRβ+Foxp 3+耳朵中的细胞和活的CD4+TCRβ+Foxp 3+引流淋巴结中的细胞被定义为Foxp 3。+图中的细胞。数据表明,每组的研究n=6,RORγt(I)对IL-23处理的动物的疗效与其他γt(I)化合物的独立研究结果相似。*p < 0.05由学生的t测验决定。

IL-23驱动的Treg反应被进一步表征,以确定IL-23是否通过诱导其他效应细胞因子的产生而引起Tregs的广泛谱系不稳定。Th1样Tregs在多发性硬化症的发病机制中起着重要的作用。141型糖尿病15。对耳部Tregs的分析表明,IL-23可使IFN-γ的数量略有增加。+Treg细胞(附图)1E),干扰素-γ+Tregs未在IL-23治疗动物的引流淋巴结中富集(附图)。1F)。因此,IL-23对Tregs的影响主要局限于IL-17A和IL-23-IL-17A轴。

临床相关疗法对Th17样Tregs蓄积的影响

抑制肿瘤坏死因子α和IL-23信号节点是治疗银屑病的有效途径18。Th17样Tregs在发炎的皮肤中富集,这一事实导致了这样一种假设,即降低疾病严重程度的治疗药物也会减少这种杂交群体的积累。为此,对同时接受抗肿瘤坏死因子α抗体或IL-23的p19亚基的IL-23处理动物进行了分析。抗肿瘤坏死因子α和抗IL23p19在所有时间点均表现出明显的抑制IL-23所致耳炎症的作用(图1)。3A用抗肿瘤坏死因子-α和抗-IL23p19分别使耳厚曲线下面积减少69%和72%。3B)。随着耳厚的变化,抗IL-23p19治疗的动物耳中Th17样Tregs的比例和数量显著减少(图1)。3C)。抗肿瘤坏死因子α治疗后耳部Th17样Tregs的积累也明显减少(图1)。三维空间)。IL-23还可引起引流淋巴结中Th17样Tregs的显著积聚,抗IL-23p 19的治疗可将其降低到基础水平(图1)。3E)。有趣的是,肿瘤坏死因子α中和也导致引流淋巴结中Th17样Tregs的比例和数量显著减少(图1)。3E)。因此,减轻疾病严重程度的临床相关疗法显著减少了Th17样Treg人群的积累。

图3

临床相关治疗对Th17样Tregs的积累有显著影响。在给药前4.2h(第0天和第2天),小鼠腹腔注射抗肿瘤坏死因子-α(15 mg/kg)或抗IL-23p 19(15 mg/kg)。(A)绝对耳朵厚度和(B抗肿瘤坏死因子-α15 mg/kg或抗IL-23p19 15 mg/kg。(CD在抗IL-23p19(C)或抗肿瘤坏死因子-α(D)存在或不存在的情况下,载体或IL-23处理小鼠耳皮中Th17样Tregs的频率和数量。数据表示每个数据点的2耳合并分析,n=4.*p < 0.05用学生的考试。(E)引流淋巴结中Th17样Tregs的频率和数目。数据代表了每组8人的研究,并对抗肿瘤坏死因子-α和抗IL-23p19在其他一些独立研究中获得的抗肿瘤坏死因子和抗IL-23p19的疗效进行了类似的研究。活CD 45+CD4+TCRβ+Foxp 3+耳朵中的细胞和活的CD4+TCRβ+Foxp 3+引流淋巴结中的细胞被定义为Foxp 3。+图中的细胞。*p < 0.05由学生的t测验决定。

Th17类Tregs优先由Tregs生成。

据报道,在Foxp 3中都可以生成类似Th17的Tregs。+Tregs或Foxp 3Th17细胞依赖于炎症环境25。为了确定IL-23驱动的Th17样Tregs是否可以从Treg或传统T(Tconv)细胞中生成,gfp(TCOV)和GFP+(Treg)CD4+从Foxp3-GFP报告小鼠中分离T细胞。培养3d后,分离的Tconv细胞中有一部分表达Foxp 3(8-15%)。然而,IL-23刺激只能驱动这些Foxp 3中的一小部分。+细胞共表达ROR、γ、t和IL-17A(图1)。4A,C)。有趣的是,CD4明显增加。+Foxp 3+RORγt+伊-17A+分选后的Treg细胞用IL-23刺激。4B、C)。总的来说,当将IL-23刺激条件的变化表示为与车辆控制相比,Th17样的Tregs显然是由Treg细胞优先生成的。离体(无花果)4D)。更重要的是,IL-23刺激的分类Tregs分泌的IL-17A蛋白的数量明显高于车辆控制和分类的Tconv细胞(如图所示)。4E)。IL-23刺激的分类Tregs也使IL-10水平高于车辆控制和分类Tconv细胞(补充图)。3)。这些数据共同支持这样的假设,即IL-23诱导分泌IL-17A的Th17样Tregs是由Treg前体细胞优先产生的。

图4

Th17类Tregs优先由Tregs生成。流式细胞术(FACS)经载体或IL-23处理后,在抗IFN-γ和抗IL-4存在下用DynaBead刺激。在第3天,在蛋白质转运抑制剂存在的情况下,PMA和离子霉素再次刺激细胞,然后进行分析。(AB)有代表性的流式细胞术图和(C)活Foxp 3的频率+RORγt+伊-17A+分类CD4培养中的细胞+绿色荧光蛋白Tconv细胞或CD4+绿色荧光蛋白+第三天戒酒。D)Tconv或Treg分类细胞产生Th17样Tregs的倍倍变化,表现为IL-23刺激与车辆控制的比率。(E)分离Tconv或Treg细胞,于第3天检测IL-17A水平。数据代表了两项独立实验的分析,每次从4只动物的脾脏和淋巴结细胞中分离出细胞。*p < 0.05由学生的t测验决定。

讨论

越来越明显的是,辅助性T细胞亚群之间,特别是Th17和Treg细胞之间存在着相当大的可塑性。26。最近的研究发现了一些效应物,如Treg种群,它们根据炎症部位和炎症环境保护或驱动免疫病理。8。例如,根据炎症环境的不同,Tregs具有Th17细胞的共同特性,已被证明可以调节Th17炎症,以维持肠道内的稳态。13并在小鼠系统性红斑狼疮模型中发挥保护作用27或者导致银屑病发炎17,28.

由于对人体组织的需求、人类疾病的异质性以及这些细胞已经在组织中分化,阻碍了银屑病中Th17样Tregs生物学特性的研究。因此,我们无法描述调节Th17类Tregs产生和/或维持的起源和信号节点。为了更好地了解这些细胞和Tregs在炎症性皮肤病中的作用,在银屑病样皮炎模型中研究了Tregs在银屑病样皮肤炎症过程中的稳态和功能。结果表明,IL-23支持Treg在炎症小鼠皮肤中的增殖和聚集.尽管如此,IL-23仍然导致了一种严重的疾病负担,提示Treg细胞反应受损或不足。与此相一致,IL-23诱导效应细胞因子IL-17A在一小部分Tregs中产生异常。此外,这些细胞具有原型Th17细胞的表型和功能特征。这些Th17样Treg细胞不仅表达Th17基因的主转录因子rorγt,而且这些细胞的发育和功能受到rorγt信号的调控。体内。临床相关的治疗药物能中和肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子(α)或白细胞介素-23(IL-23),也显著减少了这一群体的产生这些结果表明,Th17样Tregs在炎症过程中产生,并被减轻疾病严重程度的治疗方式所调控。

小鼠和人类Th17样Tregs的个体发育在知识上仍然是一个空白。这导致我们推测这些细胞可以从调节Foxp 3和rorγt的常规T细胞分化,也可以从失去血统整合的Tregs分化来上调rorγt并分泌IL-17A。+在煽动性环境下。我们的结果清楚地表明,IL-23优先从Treg前体中驱动Th17样Tregs的生成。离体我们假设一种类似的途径可能会推动这一群体的产生。体内.

在本报告中,我们进一步观察到银屑病皮肤中有一小部分Tregs表达IL-17A。我们发现IL-23能驱动Treg细胞的可塑性,并诱导一个类似Th17的Treg细胞,受rorγt信号的调控。这些细胞可能在驱动和/或加剧炎症性皮肤病(如银屑病)中发挥重要作用。我们还定义了以前未被重视的IL-23信号在调节Treg稳态中的作用.除了扩展我们对调控Th17样Tregs的信号节点的现有知识外,这项工作还可以帮助克服该领域研究Th17样Tregs可塑性的一个重大障碍。进一步确定Th17样Tregs的表面标记物,或开发报告鼠模型来分离这些细胞,将使未来的研究能够解决IL-23是否驱动Tregs的谱系不稳定和可塑性,从而加剧疾病的严重程度。这些研究对于更好地理解组织Tregs在疾病和下一代治疗模式发展中的作用至关重要。


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