新冠肺炎阳性症状无症状患者血清学分析的多重化学发光免疫分析

新冠肺炎大流行影响到全世界超过8100万人，超过170万人死亡。随着人群返回工作岗位，开发可靠的检测SARS-CoV-2特异性抗体的测试至关重要。在这里，我们提出了一个多重血清学测试的结果，以评估对新冠肺炎的抗体反应。在初始大队列中，与新冠肺炎PCR检测结果的一致性大于99%。在科罗拉多州由成人和儿童组成的第二个门诊队列中，阳性/症状参与者的IgG反应比阳性/无症状参与者更强，症状参与者的IgM反应是短暂的，并在症状发作后30天内基本低于检测极限，有中到重度症状的参与者的IgA水平显著高于有轻到中度症状或无症状个体。因此，我们的研究结果为研究新冠肺炎的血清学特征和免疫应答提供了理论依据。

新冠肺炎是由新型冠状病毒sars-cov-2引起的一种传染病。1,2,3。自2019年12月以来，新冠肺炎已在全球范围内传播，截至2020年12月底，已造成近8100万人感染，170万人死亡(Https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports，也见2,4,5)。摘要新型新冠肺炎感染肺炎以发热、疲劳、干咳、呼吸困难为特征。3。然而，还需要进一步的研究才能准确地识别NCIP症状，因为其他症状已经被报道，包括呕吐、腹泻、嗅觉丧失和味觉丧失。1,6,7。新冠肺炎阳性患者的症状严重程度和表现信息较少，而无症状患者感染SARS-CoV-2的抗体谱信息更少。自第一次抗体测试获得紧急使用授权以来，大多数研究的重点是检测SARS-CoV-2特异性免疫球蛋白-M(IgM)和仅针对一种或两种抗原的免疫球蛋白-G(IgG)抗体(穗蛋白(SP)和/或核蛋白(NP))。8,9,10,11,12分析SARS-CoV-2感染患者的免疫球蛋白A(IgA)抗体反应的人要少得多。13,14,15。因此，需要更多的研究来充分描述无症状和症状性SARS-CoV-2感染者的抗体反应.

了解新冠肺炎患者的特异性抗体谱和免疫应答对于描述疾病的进展，鉴别有轻微症状或无症状或有延迟症状发作的患者，以及预测潜在的长期免疫，都是至关重要的。16。在感染的早期，新冠肺炎阳性患者的抗体水平是无法检测到的。17,18。刘等人(2020)和其他人发现，在症状出现后4天，新冠肺炎阳性患者检测到IgM抗体，并在4周后下降到无法检测到的水平。16,18。IgG抗体在感染后7天达到可检测水平，在25天左右达到高峰，4周后仍保持高水平。18。最近对173例新冠肺炎阳性患者的另一项研究显示，IgM和IgG的中位转阴时间分别为感染后11天和14天。17。IGM水平在5周后开始下降，7周后低于检测极限。IgG在感染后7周显著升高。17。由于他们的半衰期较长，感染后的数月或数年内，IgG抗体可能会维持在可检测的阈值之上。19,20。而一些纵向研究则对新冠肺炎阳性患者和医护人员的抗体反应进行了研究。13目前尚不清楚症状消退后IgG持续升高的时间以及持续IgG水平对长期免疫记忆的影响。抗sars-cov-1病毒特异性IgM和IgA抗体，与sars-cov-2有很大的同源性。21，在发病6-8天后的患者血清中同样升高，并在3-4周后开始下降。22,23。重要的是，sars-cov-1感染患者的IgG滴度在感染后8周内升高，并在2年内持续升高，这可能表明存在长期免疫。24.

最显著的免疫检测方法是化学发光免疫法、人工ELISA法和快速侧流免疫分析法，检测sars-cov-2感染后产生的IgM和IgG。8,25。在目前的手稿中，我们描述了由充满活力的美国临床实验室开发的化学发光免疫分析法，该方法被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于紧急使用授权，能够敏感地检测SARS-CoV-2感染患者的抗体滴度。这种血清学蛋白微阵列技术已在7,700多份患者血清样本中进行了检测，检测了多种抗体应答，其中包括12种抗体/抗原组合：IGM、IgA和IgG、抗sars 1 sp(S1 Sp)、受体结合结构域(Rbd)、spke 2 sp(S2 Sp)和np的sars-cov-2。26。在此，我们介绍了相对于PCR证实的新冠肺炎阳性和抗体阴性病例，动态血清学化学发光免疫分析法的总体临床敏感性和特异性。然后我们利用这个血清分析工具来调查来自科罗拉多州丹佛市的一组参与者的血清学特征。

科罗拉多州已经有超过326,000例新冠肺炎病例，其中3717人死亡，目前为止已经有17,962人住院治疗。该社区约有210万人接受了测试(见Https://covid19.colorado.gov/data/case-data关于最新情况)。就新冠肺炎造成的死亡人数而言，科罗拉多州在全国排名第21位，在全国排名第26位。

在目前的研究中，我们分析了在科罗拉多州丹佛市一家门诊部报告各种covd样症状的健康社区参与者的症状和抗体特征。采用动态多重化学发光免疫分析法，我们发现新冠肺炎阳性症状患者的IgG抗体效价明显高于无症状者。新冠肺炎阳性者表现出更大的IgG免疫应答，而无症状者则表现出更大的IgM应答。最后，随着症状严重程度的增加，IgA水平升高。这些发现提示，充满活力的免疫分析可能有助于区分个人免疫反应，这些反应反映了SARS-CoV-2感染者的不同症状严重程度。

美国临床实验室化学发光免疫分析法的初步验证

尽管充满活力的美国临床实验室化学发光免疫分析法已被FDA认可用于紧急使用授权，但这种血清分析工具相对来说是一种新的工具。26。因此，在使用这种化学发光免疫分析法分析科罗拉多州丹佛市的患者队列之前，Vih进行了一项验证性研究，其中包括RT-PCR证实的新冠肺炎阳性血清样本(n=303)和新冠肺炎-负数(n(296)病人。此外，健康对照组的血清样本(n=4502)及非新冠肺炎疾病控制(n也使用了新冠肺炎爆发前采集的样品。该方法对sars-cov-2抗原s1、rbd、s2和np的IgA、IgG和IgM抗体的临床敏感性和特异性由活跃的美国临床实验室化学发光免疫分析法评估(见表)。1)。用化学发光免疫法检测了99.67%的新冠肺炎阳性病例中至少一种抗SARS-CoV-2抗原的IgA、IgG或IgM。另一方面，该方法还证实了99.77%的rt-PCR证实的新冠肺炎阴性患者对所有抗体/抗原组合均为阴性(见表)。1)。这些数据表明，活跃的美国临床实验室化学发光免疫分析法具有较高的临床敏感性和特异性，可可靠地用于SARS-CoV-2感染的诊断。

参与者人口-科罗拉多州丹佛

在科罗拉多州丹佛市及周边郊区的107名12至78岁(平均42岁)的参与者(52名男性和55名女性)的血清样本中，用活跃的美国临床实验室化学发光免疫分析法检测了sars-cov-2抗原(包括s1、rb d、s2和np)中的IgA、IgG和IgM抗体。26。31名参与者至少有一次SARS-CoV-2抗体/抗原组合呈阳性(抗体滴度为≥1.0)。76名参与者的抗体/抗原组合均呈阴性(滴度<1.0)。64名参与者(28名新冠肺炎阳性者和36名抗体阴性者)完成了广泛的健康问卷，以确定症状严重程度和潜在的共患病情况。在一个时间点进行血清学测试，对报告症状的参与者进行相对于症状发作的平均50天(1-117天)的测试。21名新冠肺炎阳性的参与者和18名阴性的参与者报告说，他们经历了一种或多种典型的与“攻克”相关的症状。根据病人对与病史、体力活动水平和一般生活方式有关的问卷项目的答复，这一人群被认为是健康和活跃的。这一人群的平均体重指数(BMI)为25，只有21人报告患有慢性病，只有10人有吸烟或吸食大麻的病史(表)。2)。新冠肺炎阳性者与阴性者在年龄、性别、体重指数、吸烟史或慢性病方面无显着性差异(表)2).

抗SARS-CoV-2抗原抗体滴度

我们首先证实，在新冠肺炎阳性的参与者中，所有抗sars-cov-2抗原的抗体滴度均显著升高(n=31)与新冠肺炎-负参与者(n(71)使用双尾独立样本t-检验。所有12种抗体/抗原组合的滴度在新冠肺炎阳性组与阴性组中均显著增加(补充图1)。1)。男性和女性之间的效价没有显着性差异(附图)。2).

在新冠肺炎阳性的参与者中，嗅觉丧失的情况尤其严重。

新冠肺炎阳性组和阴性组的几名参与者都报告了症状。因此，我们用双尾独立样本T-测验分析了21名测试阳性的症状参与者和18名测试阴性的症状参与者在症状表现和严重程度上的差异。所有参与者都自我报告了他们第一次约会的经历，症状严重程度，以及症状缓解的日期。症状出现时间与症状缓解时间无显着性差异(附表)1)。有症状的新冠肺炎阳性者和阴性者之间的严重程度不同，共报告了18种不同的症状。嗅觉丧失的严重程度是阳性者的唯一症状(平均(SE)=4.50±0.50)，与阴性者(平均(SE)=2.50±0.65)相比，差异有显着性(P<0.05)。t(6)=−2.45，p=0.05，补充表1)。这些数据表明，严重的嗅觉丧失可能与SARS-CoV-2感染有着独特的联系.我们对每个症状的症状严重程度总分和汇总的总分进行了Pearson‘s相关分析，发现18种症状中没有一种与年龄或BMI显著相关，男性或女性在症状严重程度上与报告的任何一种症状均无显着性差异(P>0.0 5)。

轻度和重度患者抗sars-cov-2抗原的抗体效价

虽然本研究中没有参与者需要住院治疗，但新冠肺炎阴性和阳性的参与者都报告说，他们都经历过严重的症状(定义为一种不可忽视的症状，也是病人所感到的最糟糕的症状)或中度的症状(被定义为不可忽视的症状和有限的日常活动)。由于并非所有的新冠肺炎阳性者对每一种抗体/抗原组合均呈阳性，我们调查了症状较严重的抗体/抗原组合是否更有可能阳性。我们比较了新冠肺炎阳性者的抗sars-cov-2抗原抗体滴度，这些人报告有轻度-中度症状(n=11)有中重度症状者(n=10)和无症状者(n=7)。有中重度症状的新冠肺炎阳性者(平均(SE)=0.93±0.19)的抗RBD IgA抗体滴度显著高于有轻、中度症状者(平均(SE)=0.45±0.05)和无症状者(平均(SE)=0.41±0.10)(F(2，25)=5.73)。p=0.01，图1。1A)。我们还发现，有中重度症状(IgG NP：(SE)=1.10±0.12；IgA S2 SP：(平均SE)=0.80±0.10)的患者，其抗NP和IgA S2 SP的效价均显著高于无症状者(IgG NP：(SE)=0.54±0.10)。t(15)=−2.36，p=0.03；IgA S2 SP：(平均(SE)=0.50±0.10)，t(15)=−2.24，p=0.04；图1。1B，c)。在这些症状组中，新冠肺炎阳性女性和男性的抗RBD、IgA、S2 SP和IgG NP抗体滴度均无显着性差异(附图)。3)。有轻、中、中度症状的新冠肺炎阳性者的症状出现日期、年龄、性别和BMI之间的天数也没有显着性差异。

IGM和IgG时限

其次，我们评估了报告的症状发生与血清学测试日期之间的差异。滴度、症状出现天数、症状缓解天数、症状起效天数与初测均无显着性差异(P>0.05)。然而，在新冠肺炎阳性人群中，高滴度IgG和IgM抗体的参与者在症状发作后的不同时间内分层(如图所示)。2A，b)。新冠肺炎阳性者在症状发作后0~60天分别出现IgM和IgG水平升高(每种免疫球蛋白平均检测4种抗原)。IGM水平在症状出现后30天出现下降。

基于上述发现，我们接下来用单因素方差分析(ANOVA)方法比较了21例症状性新冠肺炎阳性者在症状发作与血清学检测日期之间的0~30、30~60、60~90、90~120天的所有抗SARS-CoV-2抗体效价的组合。平均IgG抗体浓度在各间期间无显着性差异，但在0~30d(平均(SE)=1.14±0.18)高于30~60d(平均(SE)=1.03±0.23)，如图所示。2A)。平均IgM滴度在0~30天和30~60天之间差异有显着性(p=0.03)，每隔0至30至60至90天(p(F(3，17)=4.47，p=0.02，图1。2B)。0~30d间隔组IgM平均浓度最高(平均(SE)=1.08±0.11)。p=0.03)与其他间隔相比较。抗S1抗体的平均水平F(3，17)=10.89，p < 0.01; Fig. 2C)和成果预算编制(F(3，17)=4.55，p=0.02；图1。二维空间)抗原在上述四个区间之间有显着性差异。具体来说，0-30之间存在着显著的差异(p < 0.01) and 30–60 (p=0.04)日间隔，以及0-30(p < 0.01) and 60–90 (p分别为S1抗原和RBD的日间隔(图0.0 4)。2C，d).

新冠肺炎阳性症状与无症状参与者的抗体滴度

接下来对无症状和有症状的新冠肺炎阳性者的人口统计学和临床特征进行了研究。两组间在性别、年龄、体重指数、吸烟史或是否有慢性疾病方面并无显著差异(表)。3)。在有症状的女性中，只有抗RBD的IgG滴度显著增加(n=6)与有症状的男性(n=4，t(8)=2.71，p=0.03)。Fisher‘s精确试验用于比较无症状和有症状的参与者中每种抗体/抗原组合呈阳性的比例。我们发现有症状的参与者中有更多的人检测出了抗S1抗原的IgG阳性。n=10，p=0.03)和NP抗原(n=10，p=0.03)与无症状新冠肺炎阳性者比较(n=S1和NP=0；表3)。同样，更多有症状的参与者检测出抗S2抗体阳性(n=12)比无症状参与者(n=1)，这一结果趋向于显着性(p=0.08，表3)。用双尾独立样本T-试验比较其余抗体/抗原组合的效价，两组间差异无显着性(表)3)。最后，我们利用IgA、IgG和IgM对所有抗原的平均滴度，并使用双尾独立样本T-检验检测新冠肺炎阳性、无症状和有症状的参与者之间的差异。我们发现，新冠肺炎阳性症状参与者的平均IgG抗体滴度(SE=1.04±0.11)明显高于无症状者(平均(SE)=0.64±0.10)。t(26)=−2.00，p=0.06)。这些数据表明，无症状和症状新冠肺炎阳性的参与者可能对SARS-CoV-2感染有不同的免疫反应。我们使用Fisher‘s精确测试来探讨IgA、IgG或IgM抗体阳性与是否有症状之间的关系。我们发现，与至少一种IgG抗原阳性的人数相比，更多的无症状新冠肺炎阳性者至少有一种IgM抗原阳性(Fisher‘s精确检验，p=0.05)。综合上述发现，新冠肺炎阳性症状的参与者表现出更大的IgG免疫应答，而无症状的参与者有更大的IgM应答。有趣的是，新冠肺炎阳性的无症状参与者中没有一人对任何病毒抗原呈阳性反应(见表)。3).

抗体/抗原组合与新冠肺炎诊断及症状严重程度的关系

为了更好地了解某些抗体/抗原组合在新冠肺炎阳性诊断中是否重要，以及某些抗体/抗原组合是否具有症状严重的特征，我们使用Pearson相关分析。我们包括新冠肺炎阳性(n=31)和消极参与者(n=76，补充图。4A)和分离的新冠肺炎阳性参与者，没有症状(n=7，无症状)，轻度-中度症状(n和中度-严重症状(n=10，补充图。4B)。在新冠肺炎阳性的受试者中，我们发现抗S1 SP的IgG和抗RBD的IgG(r=0.7)，以及抗S1 SP和IgM抗RBD(r呈强正相关(附图)。4A)。新冠肺炎阴性者抗体/抗原组合之间没有明显的正相关或负相关(附图)。4A)。此外，当新冠肺炎阳性参与者按症状严重程度进一步细分时，观察到了一些正相关关系，尽管每一组的参与者都太少，无法得出任何明确的结论(补充图1)。4B)。有趣的是，抗S1 SP的IgM抗体和抗RBD的IgM抗体在有轻度-中度症状的参与者中呈显著正相关(r=0.9)，有中重度症状(r=0.9)但无症状参与者(r=0.5，附图。4B)。然而，需要进一步的研究，因为这些相关数据很难解释，因为相对较小的样本规模。

最后，分别绘制不同症状的参与者的效价图，以观察抗体谱的差异，并探讨症状严重程度的增加是否导致抗体反应的幅度增加，表明许多抗体/抗原组合的效价增加。用热图显示每个抗体/抗原组合对没有症状(无症状)的新冠肺炎阳性者的效价增加和降低。n(7)有轻微至中度症状的参与者(n及有中重度症状的参与者(n=10)(图1。3)。总的来说，似乎大多数新冠肺炎阳性的无症状参与者只有少数抗体/抗原组合增加了滴度(≥1.0)。相反，许多有中重度症状的参与者似乎增加了几种抗体/抗原组合的效价，而有轻度-中度症状的参与者因抗体/抗原组合较少而增加了效价(图一)。3).

与上述发现相一致，我们还观察到症状性参与者IgG抗体滴度增加，而无症状者则表现出抗大多数抗原IgM抗体滴度增加。我们还发现，与无症状和轻度-中度症状的参与者相比，有中重度症状的参与者抗RBD的IgA抗体滴度有所增加(图一)。3)。综合起来，这些数据可以提供对抗体反应的大小如何影响症状严重程度的洞察力。

在目前的研究中，我们对科罗拉多州一群健康的成年人和儿童进行了新冠肺炎的多重血清学测试。使用同一检测试剂盒的最新结果显示，抗sars-cov-2的IgM抗体一般在初次感染数天后才能在血液中检测到，尽管随着时间的推移，抗体的水平没有很好的特征。26。我们的结果表明，IgM和IgG水平都在早期(症状发作后0-30天)升高。IGM水平在症状出现后30d下降，而IgG水平在症状出现后60d仍保持升高。早期IgM水平的升高可能意味着急性感染，IgG水平的升高与免疫反应的延长和适应性体液免疫的激活相对应。8。Suhandynata和合作者(2020年)27在一组急性疾病患者中，证明了IgG和IgM血清转换的演变，支持了我们在这里的发现。虽然sars-cov-2在发病后60天后IgG水平下降，但最近的一项研究表明，相对较低的IgG水平仍可提供对sars-cov-2的显著免疫。28.

与这些结果相反，一些研究表明，sars-cov-1感染患者在感染后2年后，IgM水平在20天左右达到高峰，并下降到基线以下约6个月，而IgG水平在感染后2年仍保持升高。22,24。尽管SARS-CoV-1和SARS-CoV-2有相似之处，但对于新冠肺炎患者来说，IgG水平可能不会长期升高。最近，其他几项研究报告，新冠肺炎阳性患者50天后抗sars-cov-2的IgG水平仍在升高。29。类似的结果由Zhang等人描述。(2020)，但对于大群体中IgG的长期滴度的研究甚少。25。新冠肺炎的复发还没有得到很好的描述，这表明抗体的存在至少可以提供短期免疫。这与Chandrashekar等人的研究结果一致。(2020)显示感染sars-cov-2的灵长类动物在病毒清除后免受再感染。30。有趣的是，抗sars-cov-2的IgG抗体的发展也与呼吸道病毒载量减少有关。31。这些发现可能表明抗体的发展提供了一定程度的保护免受再感染。此外，人们普遍认为，与病情较轻的病人相比，患有严重疾病的患者更有可能有更高的免疫反应和较强的长期免疫能力。32。因此，应该指出，这里研究的群体是一个相对年轻、健康的群体，不需要住院治疗。IgG水平下降可能是由于对较轻微感染的免疫反应较弱所致。12,19,33。在老年人群中，血清学特征可能有所不同，也可能是由先前或慢性传染病或疾病引起的。

目前的研究包含了一份综合症状清单，包括呼吸道症状、神经症状和与胃肠有关的症状(见补充表)。1)。在比较新冠肺炎阳性者和抗体阴性者的症状时，我们希望找出与感染相关的症状，以及与免疫状况相关的症状。与无症状者或有轻、中度症状的新冠肺炎阳性者相比，大多数抗体/抗原组合水平升高。对于积极的参与者来说，唯一的症状就是嗅觉丧失。在戴尔·埃拉等人的一项研究中。(2020)研究人员检查了一群意大利确诊新冠肺炎患者的味觉和嗅觉丧失情况。34。他们发现，70%的人口经历了味觉或嗅觉的丧失。根据我们的发现，Menni等人。(2020)表明，在10种常见的新冠肺炎症状中，嗅觉和味觉丧失是阳性检测结果的最佳预测因素。35。据报道，失去味觉和气味可能是感染的最早迹象，因此，可能是病毒脱落的标志，也是感染的可靠预测因素。

我们发现，新冠肺炎阳性症状患者的平均IgG抗体效价明显高于抗体阳性的无症状者。因此，无症状和症状性新冠肺炎阳性者对SARS-CoV-2可能表现出不同的免疫反应.无症状的参与者更有可能只检测IgM阳性。有趣的是，没有一位无症状的参与者对IgA呈阳性反应，症状被归类为中重度的参与者RBDIgA的滴度明显高于后者。IgA是包括粘液上皮、肠道和呼吸道在内的分泌物中的主要抗体，主要起中和抗体的作用，在感染开始前消除病原体。36。中和抗体，如IgA，通常阻断病毒与细胞表面受体的结合，并阻止受体与病毒的相互作用。此外，据报道，循环IgA可能参与了增强促炎细胞因子信号的免疫复合物的形成。36。最近的几项研究发现，新冠肺炎患者血清中高水平的RBDIgA水平与症状严重程度显著相关。37,38。IGA可能在SARS-CoV-2感染的黏膜和全身反应中起着关键作用，而滴度水平可能提供症状严重程度和疾病进展的早期指示。进一步的研究应集中在描述新冠肺炎中重度症状患者的IgA反应.

本研究存在若干局限性。首先，样本规模相对较小，人口大多是年轻和健康的。本研究的参与者也没有经过PCR检测来确认SARS-CoV-2感染，尽管化学发光检测在另一组患者中得到了验证。此外，血清学检测仅在一个时间点进行，从症状开始有不同的持续时间。今后的研究应包括更大的样本规模，通过聚合酶链反应(PCR)确认SARS-CoV-2感染，在从症状开始持续时间一致的多个时间点测量滴度，以及更多关注具有中-重度新冠肺炎症状的参与者群体。尽管如此，所提供的数据对于识别独特的新冠肺炎症状和描述对SARS-CoV-2的免疫反应是有价值的。我们的发现证实了先前的研究，并提供了关于症状性和无症状患者免疫反应的见解。

总之，本文提供的数据表明，在血清学检测结果阳性的患者症状过程中，IgM抗体水平较早升高，而IgG水平升高的时间往往长于IgM。症状出现后30天，IGM似乎低于阳性检测水平。新冠肺炎阳性症状者的平均IgG抗体效价明显高于无症状者。新冠肺炎阳性者IgG免疫反应较强，无症状者IgM反应较强。我们的数据进一步表明，升高的IgA水平可能与症状严重程度的增加有关。这些发现有助于区分更广泛人群中的个体免疫反应，以便进行跟踪。