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宿主免疫调节微生物移植治疗艰难梭菌感染

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发表时间:2021-02-03 14:07作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

粪便微生物移植(FMT)是治疗复发性疾病的一种成功的治疗策略。艰难梭菌感染。尽管疗效显著,但FMT治疗效果有限,其作用机制尚不清楚。在这里,我们演示了免疫系统在用小鼠支持fmt方面的关键作用。艰难梭菌感染系统。继FMT之后,Rag1杂合子小鼠艰难梭菌少而少Rag1−/−老鼠没能清除感染。针对适应性免疫细胞亚群的靶向消融揭示了CD4的必要作用+Foxp 3+T-调节细胞,而不是B细胞或CD8+T细胞,在fmt介导下艰难梭菌感染。Fmt无反应小鼠表现为炎症加重,fmt细菌群落植入受损,大肠中共生细菌衍生的次生胆汁酸代谢物修复失败。这些数据表明宿主的炎症免疫状态限制了微生物学治疗的有效性。艰难梭菌感染。

导言

这种微生物由生活在哺乳动物宿主体内的细菌、病毒、真菌和原生动物组成,可影响对癌症、糖尿病、过敏、肥胖和感染等多种疾病的易感性。1,2,3,4。在所有这些疾病状态中都观察到一种改变或失调的肠道微生物区系,这表明用来自健康个体的细菌组成的肠道微生物群可以治疗疾病。5,6。这一理论得到了动物研究的支持,这些研究表明,通过将细菌移植到患病的宿主肠道,可以减轻疾病。7,8,9,10,11,12。在确定微生物物种群落方面取得了重大进展,这些微生物物种在支持人类健康方面具有重要意义。11,12,13,14,15,16,17,18。然而,将这些发现转化为可行的微生物区系疗法在临床上取得的成功有限,而且还没有被认为是治疗受微生物失调影响的大多数疾病的一种选择。19。一个值得注意的例外是利用粪便微生物移植(Fmt)治疗复发性疾病。艰难梭菌感染20。FMT治疗艰难梭菌感染是临床上第一种以微生物为基础的治疗方法。21。在这些治疗策略得以广泛实施之前,需要阐明决定微生物学治疗成功的基本原则。

艰难梭菌目前,一种革兰氏阳性、孢子形成、专性厌氧菌是住院病人最常见的医院感染,仅在美国每年就有近50万病人感染,估计每年有13,000至30,000人死亡。22,23,24。这种机会病原体感染大肠后,肠道微生物区系的扰动。万古霉素或菲他霉素是第一种有效针对植物形态的治疗方案。艰难梭菌,但未能解决导致感染的潜在条件,这是一种失调的微生物群。25。复发艰难梭菌据估计,反复失败的抗生素治疗造成的感染高达25-35%,并可能导致致命的暴发性结肠炎。22,26,27。标准抗生素治疗后的高复发率促进了FMT等新治疗方法的发展。2013年,第一项对照双盲研究报告了fmt治疗复发性疾病的疗效优于抗生素。艰难梭菌感染21。随后的研究表明,fmt在个人中的治愈率为80-90%,目前在欧洲和美国,这种治疗方案已被纳入复发性疾病的标准护理中。28,29,30.

肠异位症艰难梭菌感染的病人的特征是细菌多样性的丧失和微生物来源的肠道代谢产物的改变。31,32。成功的fmt恢复了肠道微生物群落和代谢物的稳态。33,34。例如,在fmt之后,将宿主来源的初级(1°)胆汁酸转化为二次胆汁酸(2°)的共生菌重新植入大肠,2°胆汁酸池恢复到健康个体观察到的水平。35。2°胆汁酸转化菌的存在增强了对该菌的定植抗性艰难梭菌132°胆汁酸池的修复与复发性FMT的成功相关。艰难梭菌-感染病人34,35,36。这些报告提供了证据,证明fmt的有效性取决于细菌联合成功地移植到受感染宿主的肠道,从而使肠道微环境恢复到感染前的状态,并创造一个不适宜居住的环境。艰难梭菌。宿主免疫因子在支持FMT植入及清除FMT中的作用艰难梭菌尚未得到探讨,也是本报告的重点。

在本研究中,我们发现多种免疫缺陷小鼠均缺乏CD4。+Foxp 3+T-管制(T)雷格)细胞,与免疫能力强的小鼠相比,持续感染时肠道炎症增加。艰难梭菌FMT后未能解决感染问题。FMT接种物的移植菌不能完全移植到FMT无反应小鼠的大肠内,肠道代谢物谱未恢复到感染前的水平。这些数据揭示了宿主免疫系统在支持细菌植入和随后的解决中的重要作用。艰难梭菌感染。

结果

FMT介导的清除艰难梭菌感染可解决肠道炎症

粪便微生物移植是治疗复发性疾病的有效方法艰难梭菌37然而,宿主的免疫系统是否对fmt介导的艰难梭菌是未知的。为了解决这个问题,我们首先建立了一个小鼠模型艰难梭菌感染后进行FMT治疗(见图)。1A)。类似于以前关于老鼠和人类的报道7,21,38,FMT减少艰难梭菌持续感染C57BL/6小鼠大肠中的负荷和毒素水平低于检测范围,而假PBS治疗无影响。艰难梭菌负担(附图)1A,B)。到fmt后第10天,接受治疗的小鼠已经解决了。艰难梭菌感染驱动的肠道炎症的特点是免疫细胞浸润,粘膜下层水肿(补充图。1C),大肠隐窝伸长(附图。1D),以及近端结肠内促炎基因mRNA的表达(附图)。1E)。这些数据证明fmt可以通过分解间接影响肠道免疫平衡。艰难梭菌感染和进一步探讨免疫系统在支持fmt介导中的作用艰难梭菌决议。

图1:免疫缺陷Rag1−/−小鼠分辨力受损艰难梭菌FMT后感染。

a抗生素(ABX)治疗原理图,艰难梭菌感染和FMT。b抗生素治疗下感染后体重减轻抹布HET (n=6)和Rag1−/− (n=5)小鼠。数据是三个独立实验的代表。数据以平均值±扫描电镜表示。c 艰难梭菌负担和d粪便颗粒中毒素B的含量Rag1−/− (n=10)和Rag1HET (n(14)FMT后小鼠。数据是三个独立实验的组合。统计显着性是由双面不成对计算的。t-测试。***p < 0.0001. Data are presented as mean values ± SEM. e盲肠组织切片及f从天真到平均的地窖长度,艰难梭菌-治疗感染的PBS,或艰难梭菌-感染FMT-治疗Rag1HETRag1−/−老鼠。n=3天真Rag1HETRag1−/−小鼠;n=3艰难梭菌-感染PBS治疗Rag1HET小鼠;n=4艰难梭菌-感染PBS治疗Rag1−/−小鼠;n=6艰难梭菌-感染FMT-治疗Rag1HET小鼠;n=4艰难梭菌-感染FMT-治疗Rag1−/−老鼠。标度棒=100μm,数据是两个独立实验的代表。统计显着性是用一个双边的未配对的Mann-Whitney检验来计算的;*p0.0 1数据为平均值±SEM。B.D.探测不到。

免疫缺陷Rag1 −/−小鼠分辨力受损艰难梭菌FMT后感染

如果fmt解决艰难梭菌与宿主免疫系统无关的感染,FMT治疗在免疫缺陷宿主中应同样成功。检验这一无效假设,并开始剖析免疫系统在支持FMT、T和B细胞缺陷方面的作用。Rag1−/−老鼠和小白鼠控制,Rag1杂合子小鼠(Rag1HET)使用我们的艰难梭菌感染后为FMT实验系统。1A)。与以前的报告一致39,40,41, Rag1HET和合住Rag1−/−小鼠急性体重恢复情况相似。艰难梭菌疾病(图1.1B),这两个小组都建立了一个可比较的持久性艰难梭菌大肠感染(附图)2A)。在持续感染之后,Rag1HETRag1−/−小鼠接受fmt治疗,在fmt后分别被隔离在单独的笼子中,以防止微生物交叉污染。艰难梭菌在粪便中进行了监测。Rag1HET小鼠解药艰难梭菌FMT后感染,无发现艰难梭菌存在于盲肠中的毒素。1C,d)。相反,艰难梭菌FMT治疗后大肠中的负荷和毒素滴度持续存在Rag1−/−因此,老鼠反驳了我们的无效假设(图1)。1C,d)。盲肠组织学检查艰难梭菌-感染Rag1HETRag1−/−小鼠粘膜下水肿、细胞浸润及隐窝延长。Rag1−/−小鼠相比较Rag1HET老鼠(图1.1E)。在fmt后,肠道炎症在Rag1HET小鼠但不接受fmt治疗Rag1−/−老鼠(图1.1E,f)。这些观察表明,FMT受体的免疫状态是FMT治疗最终成功与否的重要决定因素。

这一观察的两个潜在的混淆因素是fmt后不同的微生物暴露,这是由于在fmt后单独容纳受鼠以及fmt对小鼠的毒性。艰难梭菌使用的菌株。因此,我们评估了fmt在野生型c57bl/6和Rag1−/−在整个实验过程中,使用CD 196和高致病性VPI 10463的小鼠仍处于合住状态。艰难梭菌菌株42。尽管fmt处理的c57bl/6小鼠同居并连续接触微生物,但fmt处理过。Rag1−/−小鼠表现出明显的高水平艰难梭菌负担(附图)2B,D)和粪便中的毒素滴度(附图)。2C,E)与C57BL/6小鼠在CD 196株感染的背景下进行比较(附图)。2B、C)或VPI 10463株感染(附图)。2D,E)。这些数据表明,fmt在野生型和Rag1−/−小鼠独立于艰难梭菌应变或协调条件。

艰难梭菌-感染Rag1 −/−与对照组相比,小鼠肠道炎症加重。Rag1 HET尽管有相似的微生物成分

其次,我们分析了肠道微生物区系组成。Rag1HETRag1−/−小鼠粪便细菌16S rRNA标记基因谱分析Rag1HETRag1−/−小鼠在抗生素治疗前、感染日及持续感染建立后(感染后第36天[P.I.])。的微生物群落没有差异的假设Rag1HETRag1−/−对小鼠进行测试,以确定微生物区系的内在差异是否能解释FMT后的差异结果。未加权分析(图1.2A),加权(附图。3A)UniFrac或Bray-Curtis(附图.3B)样品之间的距离并没有显示出细菌组成的β多样性差异。Rag1HETRag1−/−在第36天,尽管抗生素治疗后和随后两组的微生物组成发生了显著变化艰难梭菌感染。16S rRNA细菌群落分布的比较Rag1HETRag1−/−按相对细菌属丰度计算的小鼠(见图。2B和补充图。3C,d)、UniFrac距离(图1.2C和补充图。3E-G)和无监督的层次聚类(如图所示。二维空间和补充图。3H)不要导致我们拒绝无效假设,即群体间没有微生物群落水平的差异。对UniFrac距离进行的PERMANOVA检验表明,其微生物区系间的差异有统计学意义。Rag1HETRag1−/−像以前报道的那样,老鼠在服用抗生素之前43,但社区差异在以后的时间点上没有统计学意义(补充表)1)。第二批验证人群16S rRNA细菌基因谱分析艰难梭菌感染Rag1HETRag1−/−FMT时的小鼠(第32天P.I.)也没有拒绝由未加权的UniFrac距离确定的空假设(补充图)。4A),加权UniFrac距离(补充图。4B),组间距离的大小(附图)。4C、E)、无监督层次聚类和组间UniFrac距离的PERMANOVA检验(附图)。4D、F和补充表2).

图2:艰难梭菌-感染Rag1−/−Rag1HET小鼠有较强的促炎免疫应答基因的诱导作用。

a大便颗粒16S细菌rRNA ASV的非加权UniFrac主坐标分析图Rag1−/−Rag1HET小鼠在ABX治疗前,感染第0天,第36天-艰难梭菌感染或ABX-单独治疗。椭圆代表不同的实验组。b15种细菌ASV的相对丰度艰难梭菌-感染Rag1−/−Rag1HET第36天的老鼠。条形图显示在属级,但表示ASV对齐的橙色条除外。艰难梭菌. c非加权UniFrac距离比较微生物区系β多样性在内部和之间的差异艰难梭菌-感染Rag1−/−Rag1HET第36天分组。进行单因素方差分析,进行统计学比较。方框代表中位数,第一和第三四分位数。晶须延伸到最高和最低的数据点。d的肠道微生物群落的树状图表示艰难梭菌-感染Rag1−/−Rag1HET第36天的老鼠。利用非加权UniFrac距离的无监督层次聚类来识别样本间的相似性。e用qRT-PCR方法检测全结肠组织促炎免疫应答基因mRNA的表达.基因表达与abx治疗的关系Rag1HET老鼠和归一化为HPRT。统计显着性是由双面不成对计算的。t-测试。*p < 0.05, **p < 0.01. Data are presented as mean values ± SEM. f盲肠组织匀浆中促炎细胞因子和趋化因子的水平。统计显着性是由双面不成对计算的。t-测试。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Data are presented as mean values ± SEM. g粪便颗粒中蛋白质细菌和γ-蛋白酶的相对丰度Rag1−/−Rag1HET第36天的老鼠。统计显着性是由双面不成对计算的。t测试一下。数据以平均值±扫描电镜表示。图中的数据代表了三个独立的实验。ABX治疗前(n=10Rag1−/−; n=12Rag1HET小鼠),感染第0天(n=6Rag1−/−; n=5Rag1HET(老鼠),36天后-艰难梭菌(n=5Rag1−/−Rag1HET或单用ABX治疗(n=2Rag1−/−Rag1HET老鼠)。

16 SrRNA标记基因图谱不能获得微生物群落一致的物种级分辨率。44,因此可能不会揭示导致fmt后不同结果的微生物差异。艰难梭菌-感染Rag1HETRag1−/−老鼠。为了解决fmt发生时物种级别的差异是否会导致fmt在艰难梭菌感染小鼠独立于宿主的免疫状态,盲肠内容物艰难梭菌-感染C57BL/6或Rag1−/−小鼠被转移到抗生素治疗中Rag1−/−Rag1HET受体小鼠,分别(补充图。5A)。受体小鼠艰难梭菌感染来源于供体移植,从最初的疾病发病率中恢复,然后接受天真的C57BL/6小鼠供体的FMT(补充图1)。5A). Rag1HET老鼠从艰难梭菌感染Rag1−/−老鼠还能分辨艰难梭菌FMT后感染(附图)5B-D)。相反Rag1−/−老鼠从艰难梭菌感染C57BL/6小鼠未能清除艰难梭菌后续FMT(附图)5B-D)。接下来,无菌(GF)C57BL/6小鼠与Rag1−/−Rag1HET小鼠,随后用抗生素治疗,感染艰难梭菌然后进行FMT(补充图)。5E). 艰难梭菌感染前GF小鼠Rag1−/−Rag1HET感染前小鼠同样有能力分解艰难梭菌感染(附图)5F)。这一实验结果表明,这种微生物区系来源于朴素。Rag1−/−小鼠在免疫能力强的小鼠中并不固有地影响FMT的失败。综合起来,这些数据提供了证据,证明微生物组成在本质上不足以防止Rag1−/−老鼠从分解艰难梭菌FMT后感染。

其次,肠道炎症环境Rag1HETRag1−/−小鼠在FMT时进行评估。艰难梭菌-感染Rag1−/−小鼠结肠内促炎免疫反应基因表达增高(IL 22,CXCL 1,Cxcl 2,TNFa,NOS 2,Reg3g,和第3b条)与艰难梭菌-感染Rag1HET老鼠(图1.2E)。缺乏T细胞和B细胞Rag1−/−小鼠可以将对整个结肠组织mRNA转录本定量的解释混为一谈。因此,测量总蛋白水平,以评估这些促炎细胞因子和趋化因子的体内浓度,而不考虑细胞成分的贡献。与基因转录表达一致,艰难梭菌-感染Rag1−/−与FMT相比,小鼠小肠内促炎细胞因子和趋化因子的蛋白水平升高。艰难梭菌-感染Rag1HET老鼠(图1.2F)。胃肠道感染引起的炎症与肠内的旁观者γ蛋白细菌开花有关。45,46。事实上,16 SrRNA标记基因图谱显示出一种趋势,虽然没有统计上的显著意义,但趋向于更多的γ-蛋白质细菌。艰难梭菌感染Rag1−/−老鼠(图1.2G)。这些数据支持了fmt失效的假设。Rag1−/−小鼠在FMT植入时受宿主免疫塑造肠道环境的驱动。

CD4+T细胞支持fmt介导的艰难梭菌感染

无能力Rag1−/−小鼠解药艰难梭菌Fmt后的感染提示适应性免疫对于fmt介导的对fmt的解决非常重要。艰难梭菌感染。为了确定支持FMT的适应性免疫系统的细胞成分,小鼠缺乏B细胞(μMT)−/−(小鼠),CD8+T细胞(β)2M−/−(小鼠)或CD4+T细胞(MHC类-II)−/−(小鼠)艰难梭菌感染对照C57BL/6小鼠。四组小鼠急性后均表现出相似的发病率和死亡率。艰难梭菌感染并表现为持续性艰难梭菌殖民(附图)6A-C,47)。遵循FMT,C57BL/6,μMT−/−、β2M−/−小鼠解药艰难梭菌感染(图1.3A)而MHC第二类−/−(C-II)−/−)小鼠未能清除艰难梭菌(无花果)3B)并在盲肠中保持较高的毒素水平(见图)。3C)。这些数据表明CD4+T细胞而非B细胞或CD8+T细胞是支持fmt介导的解决方案所必需的。艰难梭菌感染。

图3:CD4+T细胞支持fmt介导的艰难梭菌感染。

aC57BL/6,μMT−/−、β2M−/−小鼠感染艰难梭菌并对FMT后粪便颗粒中的细菌负荷进行了评估。n=5 C57BL/6;n=4β2M−/−; n=5μMT−/−老鼠。数据是两个独立实验的代表。b 艰难梭菌C57BL/6(n=11)和C-II−/− (n(14)FMT后小鼠。数据是三个独立实验的组合。统计显着性是由双面不成对计算的。t-测试。***p < 0.0001. Data are presented as mean values ± SEM. cFMT后第15天盲肠内容物的毒素滴度。n=4只小鼠/组。用双边Mann-Whitney检验计算统计学显着性。*p=0.029。数据以平均值±扫描电镜表示。df从大肠固有层分离的单细胞悬液,艰难梭菌受感染,或艰难梭菌-感染FMT处理的C57BL/6小鼠,在BFA存在下用PMA/Ionomycin进行体内外刺激,并评估细胞因子的产生。d的频率和总数e伊-17a或fIL-22活性CD4+T细胞现场直播的FACS地块,CD 45+,CD3ε+,CD4+细胞。门控策略如图所示。13. gi从大肠固有层分离细胞的核内转录因子染色,艰难梭菌受感染,或艰难梭菌-感染FMT的C57BL6小鼠。g的频率和总数hFoxp 3+iFoxp 3+RORγt+CD4+T细胞现场直播的FACS地块,CD 45+,CD3ε+,CD4+细胞。数据di是两个独立实验的代表。统计显着性是由双面不成对计算的。t-测试。n=5只小鼠/组。e(nv.)C.差异 *p=0.014;N对fmt*p=0.011。f,N对FMT*p=0.007。h、Nv.C.差异 *p=0.003;N对fmt*p=0.021。iN对。C.差异 *p=0.004;N对fmt*p0.028)数据为平均值±扫描电镜。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. b.d. below detection.

肠道免疫平衡在一定程度上是由CD4平衡调节的。+T调节细胞(T)雷格)和T助手17(T)H17)细胞与肠道微环境中的信号相互反应和相互作用48,49. 艰难梭菌感染引起的频率显著增加(如图所示)。三维空间)和IL-17a的总数+有能力的(如图所示)3E)和IL-22+有能力的(如图所示)3F)CD4+大肠固有层T细胞。此外,在FMT的十天后H17细胞数量仍然显着高于天真的老鼠,尽管解决了艰难梭菌感染在这个时间点(如图所示)。三维空间)。测试T的潜在作用H在支持fmt的17个细胞中,我们从基因上清除了这个T细胞亚群(IL-17a或IL-22)的标志性效应分子,并评估fmt介导的以下解决方案:艰难梭菌感染。双管齐下IL17A−/−(补充图。7A)和IL 22−/−小鼠(附图)7b)显示出同等的能力来减少艰难梭菌与野生型小鼠相比,FMT后的负担更重。T-打赌不足(Tbx 21−/−)缺乏T能力的小鼠H1细胞分化也能分解。艰难梭菌FMT后感染(附图)7C)。这些数据表明fmt对艰难梭菌感染可以独立于TH17和TH1 CD4+T细胞系。

CD4耗竭+T-调节细胞损害fmt介导的对.艰难梭菌感染

与T平行H17细胞扩张,Foxp 3+和Foxp 3+RORγt+ T雷格随后大肠固有层细胞显著增加。艰难梭菌与未感染小鼠相比,FMT后感染和持续升高(图1)。3G-I)。直接测试T的作用雷格FMT介导的细胞艰难梭菌Foxp 3DTRKnockin小鼠系统50被用来选择性地消耗T雷格中的单元格艰难梭菌感染小鼠之前,FMT(图)。4A)。白喉毒素(DT)的持续使用提高了这些小鼠的全身免疫能力和死亡率。50,因此,dt或pbs只在感染后第8和第9天,在感染急性期恢复期间,暂时删除T。雷格细胞。注射白喉毒素后,体重暂时减少10-15%。艰难梭菌受感染的老鼠(图1.4B),但抗生素治疗后,未受感染的小鼠体重减轻最少(补充图。7D),意味着T的丢失。雷格细胞结合艰难梭菌感染引起肠道炎症。DT治疗Foxp 3DTR老鼠没有改变艰难梭菌与pbs治疗相比,fmt前的负担Foxp 3DTR老鼠(图1.4C)。然而,在fmt之后,dt处理过。Foxp 3DTR小鼠表现出明显延迟的分辨力艰难梭菌感染与pbs治疗比较Foxp 3DTR老鼠(图1.4C)。小肠T细胞短暂消融雷格DT给药于第12天证实。(无花果)4D-f),并与上一次报告一致51,T雷格第21天细胞数量开始回升。(FMT日;图。4D,g)。尽管有可比的总数,但T的相对比例雷格细胞与T细胞比较H17和TH1 CD4+T细胞亚群在dt处理中仍然减少。Foxp 3DTR老鼠(图1.4H)。再填充T雷格细胞室不足以将肠道炎症限制为T的绝对数目。H17、TH1 CD4+T细胞、浸润性炎症单核细胞和中性粒细胞艰难梭菌-感染DT-治疗Foxp 3DTR小鼠相比较艰难梭菌-感染的PBS-治疗Foxp 3DTR老鼠(图1.4I)。此外,艰难梭菌-感染DT-治疗Foxp 3DTR第21天时,小鼠结肠内促炎免疫防御基因表达显著升高。相比较艰难梭菌-感染的PBS-治疗Foxp 3DTR老鼠(图1.4J),类似于艰难梭菌感染Rag1−/−小鼠在FMT之前(图1)。2E)。这些结果表明T的耗尽雷格细胞促进炎症免疫防御基因的表达。艰难梭菌感染,足以损害FMT介导的解决。

图4:t雷格细胞耗竭损害fmt介导的对艰难梭菌感染。

a图解艰难梭菌感染,T雷格细胞耗竭与FMTFoxp 3DTR老鼠。b体重减轻艰难梭菌感染Foxp 3DTR小鼠跟踪DT(n=7)或PBS(n=7)管理。数据以平均值±扫描电镜表示。c 艰难梭菌粪便中的负担Foxp 3DTR小鼠服用DT或PBS及FMT。n=9只小鼠/组。数据是三个独立实验的组合。统计显着性是由双面不成对计算的。t-测试。*p=0.015,**p=0.001,*p < 0.0001. dFoxp 3频率+CD4+大肠固有层T细胞Foxp 3DTR第12天的老鼠。(第4天-DT后治疗)或第21天P.I.(FMT日)。n=4~6只小鼠/组。现场直播的FACS地块,CD 45+,CD3ε+,CD4+细胞。门控策略如图所示。13. eFoxp 3总数+CD4+T细胞和fCD4相对比例+第12天时大肠固有层T细胞亚群。(第4天,术后第4天治疗)。n=4 PBS-经过处理Foxp 3DTR小鼠;n=5 dt-经过处理Foxp 3DTR老鼠。用双边Mann-Whitney检验计算统计学显着性。***p < 0.0001. Data are presented as mean values ± SEM. gFoxp 3总数+CD4+T细胞和hCD4相对比例+21d时大肠固有层T细胞亚群。(FMT日)。n=6 PBS&DT处理Foxp 3DTR老鼠。统计显着性采用双边非配对Mann-Whitney检验。数据以平均值±扫描电镜表示。i总T数H17细胞,T细胞H1第21天时大肠固有层中的细胞、炎性单核细胞和中性粒细胞。(FMT日)。n=10个未感染的PBS-处理Foxp 3DTR小鼠;n=8未感染的DT-治疗Foxp 3DTR小鼠;n=10艰难梭菌感染pbs-治疗Foxp 3DTR小鼠;n=10艰难梭菌感染DTFoxp 3DTR老鼠通过三个独立的实验进行了检查。统计学意义用双面不成对法计算。t-测试。*p=0.013,**p0.002数据为平均值±扫描电镜。j用qRT-PCR方法检测全结肠组织促炎免疫应答基因mRNA的表达.基因表达与abx治疗、未感染相关Foxp 3DTR老鼠和归一化为HPRT. n=10个未感染的PBS-处理Foxp 3DTR小鼠;n=8未感染的DT-治疗Foxp 3DTR小鼠;n=10艰难梭菌感染pbs-治疗Foxp 3DTR小鼠;n=9艰难梭菌感染DTFoxp 3DTR老鼠通过三个独立的实验进行了检查。统计学意义用双面不成对法计算。t-测试。*p < 0.05, **p < 0.01. Data are presented as mean values ± SEM.

继续通过fmt进行DT管理也损害了对艰难梭菌感染(附图)7E),虽然DT治疗在紧接fmt之前开始并没有改变艰难梭菌决议(补编)无花果7F)。这些结果表明T下游的免疫激活雷格细胞耗竭是需要重新塑造肠道环境,使之成为一种对fmt不敏感的状态。综合起来,提供的数据支持CD4的作用。+ T雷格细胞促进FMT治疗的成功。

FMT移植失败艰难梭菌感染无反应小鼠

为了更好地了解fmt失败的病因,在fmt后进行了肠道微生物群落分析。艰难梭菌感染Rag1−/−和C-II−/−小鼠与抹布HETC57BL/6小鼠。微生物区系艰难梭菌感染FMT-治疗Rag1HET(无花果)5A-d)或艰难梭菌感染FMT治疗的C57BL/6小鼠。5e-h)移行到表型上类似于FMT接种物的组成,通过证明FMT植入成功。相反,微生物区系艰难梭菌感染FMT-治疗Rag1−/−(无花果)5A-d)或艰难梭菌感染FMT治疗的C-II型−/−老鼠(图1.5e-h)与FMT接种量保持明显差异。加权UniFrac分析(附图)8A,e),或Bray-Curtis(附图)。8B、F)确定的FMT植入距离Rag1HETC57BL/6小鼠。相反,艰难梭菌感染FMT-治疗Rag1−/−和C-II−/−小鼠移植FMT疫苗失败。由相对细菌属丰度分析微生物群落分布(图1.5B,f)、相对于FMT的未加权或加权UniFrac距离(如图所示)。5C,g和补充图。8C,G),无监督的层次聚类(如图所示)。5D,H和补充图。8D,h)及PERMANOVA测验(补充表)3)与FMT无应答小鼠相比,FMT应答小鼠的微生物区系更接近FMT接种量。艰难梭菌感染Rag1HETRag1−/−用PBS代替FMT的小鼠没有表现出明显的微生物成分变化(附图)。9A,B),并与艰难梭菌(补充图。9C).

图5:艰难梭菌-感染Rag1−/−和C-II−/−小鼠FMT植入受损。

艰难梭菌-感染(ad) Rag1−/−Rag1HET老鼠或(eh)C57BL/6和C-II−/−给小鼠注射FMT,并对其微生物成分进行分析。aFMT接种物中16S细菌rRNA ASV的非加权UniFrac主坐标分析图艰难梭菌感染Rag1−/−Rag1HET小鼠FMT时,盲肠内容物Rag1−/−Rag1HET小鼠在FMT后第21天。b的微生物区系中前15位细菌ASV的相对丰度艰难梭菌-感染的FMT-治疗Rag1−/−Rag1HET老鼠(第21天后fmt)的条形图显示在属的水平,除了橙色的条状图,这些条代表着对齐的ASV。艰难梭菌. c不同微生物区系β多样性的非加权UniFrac距离比较Rag1−/−Rag1HET各组接种FMT。n=9C.diff。Rag1HET; n=8C.diff。Rag1−/−; n=6 FMTRag1HET; n=4 FMTRag1−/−老鼠。用Dunnett法进行多重比较调整,采用单因素方差分析方法计算统计学显着性.***p < 0.0001. Boxes represent median, first and third quartile. Whiskers extend to the highest and lowest data point. dFMT接种菌肠道微生物群落的树状图表征Rag1−/−Rag1HET使用未加权UniFrac距离的无监督层次聚类来识别样本之间的相似性。eFMT接种物及粪便颗粒16S细菌rRNA ASV的非加权UniFrac主坐标分析艰难梭菌感染C57BL/6和C-II−/−小鼠在FMT时和第15天-FMT后.f的微生物区系中前15位细菌ASV的相对丰度艰难梭菌-感染的FMT-经C57BL/6和C-II处理−/−小鼠(FMT后第15天)。条形图显示在属级,但表示ASV对齐的橙色条除外。艰难梭菌. gC57BL/6和C-II微生物区系β多样性的非加权UniFrac距离比较−/−各组接种FMT。n=4只小鼠/组。用Dunnett法进行多重比较调整,采用单因素方差分析方法计算统计学显着性.***p < 0.0001. Boxes represent median, first and third quartile. Whiskers extend to the highest and lowest data point. hFMT接种量、C57BL/6和C-II肠道微生物群落的树状图表征−/−使用未加权UniFrac距离的无监督层次聚类来识别样本之间的相似性。数据以平均值±扫描电镜表示。***p < 0.001.

为了鉴别fmt反应小鼠与非应答小鼠移植差异的微生物种类,从艰难梭菌感染Rag1HETRag1−/−对FMT前后小鼠进行了符合以下标准的扩增序列变异(Asv)分析:(1)在fmt接种中存在,(2)不存在。艰难梭菌感染Rag1HET艰难梭菌感染Rag1−/−小鼠FMT前,(3)艰难梭菌感染pbs-治疗Rag1HETRag1−/−老鼠,(4)艰难梭菌感染FMT-治疗Rag1−/−老鼠,和(5)存在于艰难梭菌感染FMT-治疗Rag1HET老鼠。尽管有这些标准,279辆ASV满足了所有五种条件,大多数ASV在物种级别上无法区分(补充图)。10).

要求FMT拒绝艰难梭菌-由ABX引起的炎症,经治疗,未受感染。Rag1−/−小鼠(附图)11A)成功地移植了由相对细菌属丰度决定的FMT接种物(附图)。11B)未加权的(如图所示。11C),加权(附图。第11d)UniFrac距离,β多样性与FMT(补充图)不同。11E、G),以及无监督的层次聚类(补充图。11F,H)。这些数据表明,宿主的免疫激活状态可以决定哪些细菌移植成功艰难梭菌-感染的宿主

FMT不能恢复肠代谢物艰难梭菌-感染的fmt无反应小鼠

复发性FMT治疗成功C.difficile感染的患者肠道代谢物的恢复与感染前的浓度有关。34,35。因此,对天真的盲肠内容进行了有针对性的代谢物分析,艰难梭菌-感染,和艰难梭菌-感染的FMT-治疗Rag1HETRag1−/−评估FMT细菌植入失败是否在功能上损害肠道代谢物的恢复。氨基酸52,53、短链脂肪酸(SCFA)54,55,初级和次级胆汁酸13,56,57,58,59,60代谢物是根据报告选出的艰难梭菌定植受肠道中这些代谢产物的可利用性的影响。盲肠中的代谢物成分明显地在天真和艰难梭菌受感染的老鼠(图1.6a,b)然而,两者之间没有显著差异。Rag1HETRag1−/−小鼠在FMT之前(图1)。6B和补充图。12A,B)。FMT后,氨基酸、SCFAs、1°和2°胆汁酸谱Rag1HET老鼠但不是Rag1−/−老鼠被恢复到和天真的老鼠相似的状态(如图所示)。6a,b)。这些数据表明,FMT细菌的植入失败导致代谢物水平的功能损伤。在FMT之后,2°胆汁酸衍生物在艰难梭菌感染FMT-治疗Rag1HET小鼠相比较艰难梭菌感染FMT-治疗Rag1−/−老鼠(图1.6C和补充图。12C)。具体而言,去氧胆酸、石胆酸、牛磺脱氧胆酸和omega-muricholic酸在盲肠中的浓度。艰难梭菌感染FMT-治疗Rag1HET所有的老鼠都恢复得和天真的老鼠相似(图中所示)。6d和补充图。8C)。相反,2°胆汁酸池在艰难梭菌感染FMT-治疗Rag1−/−老鼠(图1.6d和补充图。12C)虽然1°胆汁酸池仍比天真的小鼠高(补充图1)。12D,E)。这些数据与典型的2°胆汁酸转化菌种的观察结果一致,梭状芽孢杆菌,插进去艰难梭菌感染FMT-治疗Rag1HET老鼠但不是艰难梭菌感染FMT-治疗Rag1−/−小鼠(附图)1012F)。同样,艰难梭菌感染FMT治疗的C-II型−/−与FMT处理的C57BL/6小鼠相比,小鼠的盲肠脱氧胆酸和石胆酸水平明显降低(附图)。12g)。这些数据确定肠道代谢物组成,特别是2°胆汁酸,作为小鼠FMT植入失败的生物标志物,显示了免疫防御基因的高表达。综上所述,本报告表明宿主的免疫状态是决定fmt治疗成功与否的关键因素。艰难梭菌感染。

图6:fmt无响应Rag1−/−小鼠未能恢复肠道代谢物的轮廓,以达到感染前的状况。

艰难梭菌-感染Rag1−/−Rag1HET分别给予FMT或PBS,21d后处死小鼠,分析盲肠中氨基酸、短链脂肪酸(SCFA)、1°和2°胆汁酸库的变化。a盲肠中氨基酸、SCFA、1°和2°胆汁酸相对浓度的热图(英文)n=5),艰难梭菌-感染(n=6)或艰难梭菌-感染的FMT治疗(n=4Rag1−/−; n=6Rag1HET老鼠)。b比较盲肠代谢物分布的主坐标分析图,艰难梭菌-感染,和艰难梭菌-感染的FMT-治疗Rag1−/−Rag1HET老鼠。椭圆代表95%的置信区间。c盲肠内代谢物的火山图艰难梭菌-感染的FMT-治疗Rag1−/−Rag1HET老鼠。蓝色圆圈表示代谢物富集于Rag1HET老鼠。红色圆圈表示代谢物富集于Rag1−/−老鼠。在浓度的两倍变化和调整后设定的显着性阈值标准p-使用未配对的值为0.05t-测试并根据错误发现率进行调整。d个别2°胆汁酸的浓度。n=5天真Rag1−/−Rag1HET小鼠;n=6艰难梭菌-感染Rag1−/−Rag1HET小鼠;n=4艰难梭菌-感染的FMT-治疗Rag1−/−; n=6艰难梭菌-感染的FMT-治疗Rag1HET老鼠通过两个独立的实验进行了检查。用Dunnett法进行多重比较调整,用单向方差法计算统计学显着性.DCA*p < 0.0001, LCA *p=0.043,TDCA*p=0.014,ωMCA**p=0.002。方框代表中位数,第一和第三四分位数。晶须延伸到最高和最低的数据点。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. TCDCA taurochenodeoxycholic acid, αMCA alphamuricholic acid, βMCA betamuricholic acid, γMCA gammamuricholic acid, CDCA chenodeoxycholic acid, TCA taurocholic acid, CA cholic acid, TLCA taurolithocholic acid, TDCA taurodeoxycholic acid, GDCA glycodeoxycholic acid, LCA lithocholic acid, ωMCA omegamuricholic acid, DCA deoxycholic acid. b.d. below detection.

讨论

粪便移植治疗复发性疾病的临床疗效观察艰难梭菌这是治疗这种疾病以及其他与微生物区系失调有关的疾病的令人鼓舞的进展。移植的作用机制艰难梭菌假定感染是移植的细菌,直接改变肠道环境,使其不适于居住。艰难梭菌。在本报告中,我们发现移植细菌的成功植入依赖于受体的免疫状态,特别是缺乏CD4的免疫缺陷宿主。+Foxp 3+ T雷格细胞无法解析艰难梭菌FMT后感染。执着艰难梭菌感染Rag1−/−小鼠或Foxp 3+ T雷格与免疫活性白蚁相比,细胞耗竭的小鼠导致大肠炎症介质的诱导加剧。这些FMT无反应小鼠表现出供体细菌的植入受损。植入失败导致肠道代谢物无法恢复到感染前的浓度,最终无法解决。艰难梭菌感染。

Foxp 3+ T雷格细胞在限制宿主肠道炎症方面起着重要的平衡作用。未经检查,宿主产生的炎症介质可能抑制对分解艰难梭菌感染。宿主衍生的炎症副产品可以被病原体和旁观者共同使用,以促进它们的生长。61。例如,Baumler和他的同事观察到宿主产生活性氧和活性氮沙门氏菌感染可以支持病原体和共生体的扩展。肠球菌62,63同时限制了共济会的增长梭菌64。进一步的研究表明,炎症引起的乙醇胺、硝酸盐、甲酸盐和乳酸代谢物可以支持肠道中选择性细菌的生长。65,66,67,68。因此,存在一个潜在的正反馈回路,即感染诱导的炎症环境同时促进某些耐炎细菌的存活,并抑制移植的炎症敏感细菌的植入。在没有功能免疫调节机制(如T)的情况下,这个反馈回路可能会增强。雷格通常作为限制炎症耐受细菌扩张的检查点的细胞。例如,丁酸能在上皮细胞中驱动pPAR-γ信号,并增强肠道T。雷格细胞群最终剥夺了肠杆菌科氧电子受体的种类69。免疫调节机制缺陷的fmt非反应性宿主肠道产生的炎症副产物可能会建立一个防止炎症敏感细菌种植入的环境。事实上,在这份报告中,我们观察到279个独特的细菌ASV成功地植入其中。Rag1HET小鼠,但不能移植到Rag1−/−老鼠,支持这个概念。

本报告对已知具有调节作用的代谢产物进行了肠内氨基酸SCFA、1°和2°胆汁酸的有限筛选。艰难梭菌肠定植13,52,53,54,55,56,57,58,59,60。FMT无反应小鼠未能恢复盲肠2°胆汁酸池。初级和二级胆汁酸水平与艰难梭菌易感性70,71。宿主来源的初级胆汁酸是艰难梭菌孢子72,73当选择能将1°胆汁酸转化为2°胆汁酸的共生菌时,可抑制艰难梭菌生长13,56,57,58,59,60。结果表明,2°胆汁酸可作为FMT植入成功的生物标志物,并为2°胆汁酸的修复提供支持,这是促进FMT溶解的可能机制之一。艰难梭菌。在本研究中进行的代谢物筛选在范围上是有限的。需要对肠道代谢体进行更广泛的描述,以了解细菌来源的代谢产物在FMT成功中的相对贡献,以及它们是如何由宿主的免疫系统形成的。

最近有三篇报道观察到二级胆汁酸衍生物能促进T雷格T细胞直接信号在结肠中的发育雷格树突状细胞上的细胞或间接信号,而树突状细胞又促进T雷格细胞发育74,75,76。我们的数据显示低到缺乏2°胆汁酸池艰难梭菌FMT前感染小鼠提示2°胆汁酸对外周T的促进作用雷格FMT时细胞发育。然而,FMT后,2°胆汁酸的恢复可以促进T的形成。雷格细胞的扩张和驱动一个前馈循环,进一步减少肠道炎症,并使炎症敏感的共生细菌重新繁殖。在dss-结肠炎小鼠模型中,fmt曾被证明通过促进IL-10的产生来促进抗炎特性的诱导。77。这个潜在的2°胆汁酸-T的时间和背景雷格细胞前馈机制在促进细菌植入方面还需要进一步的研究。

本报告评估了FMT细菌组分的移植物和溶解能力。艰难梭菌不同免疫状态的宿主感染。移植物噬菌体在FMT中的相对贡献艰难梭菌未评估感染情况。最近的一项研究发现,供体来源的噬菌体群与fmt成功相关。78。噬菌体可能直接作用于艰难梭菌通过溶解过程79,80或刺激肠道内免疫细胞的活化81。细菌和噬菌体在与免疫系统相互作用和支持中的相对贡献艰难梭菌FMT后的决议将需要今后的探索。

由于对不良反应的担忧,FMT治疗在免疫功能低下患者中的应用仍然有限。82。令人鼓舞的是,一些案例报告描述了经常性的解决办法。艰难梭菌艾滋病毒+移植受体和癌症患者83。多中心回顾性研究发现FMT治疗复发性的成功率艰难梭菌在ibd患者中,接受免疫抑制治疗的患者的成功率与无ibd报告的fmt成功率相当。艰难梭菌患者虽然持续植入了移植的细菌,但没有进行评估。84。随后的一项研究发现,免疫功能低下的造血干细胞受体的微生物群随着时间的推移而远离fmt接种。85而无明显免疫缺陷的受者在fmt后表现出长期植入。86。综上所述,这些报告表明,基于微生物群的治疗免疫功能低下的患者是可能的,然而,哪些免疫途径是可有可无的,将需要进一步的研究,并可能因疾病的治疗而有所不同。例如,本报告发现B细胞的免疫缺陷,CD8。+T细胞H17和TH当T细胞缺陷时,1个细胞间隔没有影响FMT的成功。雷格细胞间隔受损FMT介导的艰难梭菌感染。与减少器官移植排斥风险的免疫抑制干预策略类似,确定和定位决定微生物移植成败的特定免疫途径对于开发更知情的临床方法非常重要,这些方法可以利用微生物来塑造宿主生理和减轻疾病。


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