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Eomes和IL-10调节T调节型CD4的抗肿瘤活性+T细胞在慢性淋巴细胞白血病中的作用

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发表时间:2021-02-02 11:10作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

转录因子eomesodermin促进CD4中白细胞介素-10的表达+T细胞,它与免疫抑制和细胞毒性有关。我们检测了细胞毒性,程序性细胞死亡蛋白-1(pd-1)和eomes共表达的CD4。+慢性淋巴细胞白血病(CLL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤淋巴结T细胞(LNS)。转录组和流式细胞仪分析表明,Eomes不仅驱动IL-10的表达,而且控制着CD4中独特的转录信号。+T细胞,在典型的T调节型1(T)基因中富集。R1)细胞。TR1这些CD4的细胞特性+T细胞受干扰素γ和IL-10的表达以及Pd-1等抑制性受体的支持。T型R1具有细胞毒能力的细胞也在发生CLL样疾病的E-TCL 1小鼠体内积累.而野生型CD4+T细胞控制白细胞过继转移后TCL 1白血病的发展拉格2−/小鼠,Eomes-缺乏CD4+T细胞未能做到这一点。我们进一步证明了TR1细胞介导的对tcl 1白血病的控制需要IL-10受体(IL-10 R)信号,如Il10rb-CD4缺乏+T细胞抗白血病活性减弱。总之,我们的数据表明,Eomes对于IL-10表达的细胞毒性T的发展是不可或缺的。R1细胞在CLL患者LNS中积累,并以IL-10R-依赖的方式控制TCL 1白血病。

导言

尽管CD4有丰富的表型数据+T细胞在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中的作用及其在疾病发展中的作用是有争议的,也是鲜为人知的。1]。除了著名的T辅助(Th)细胞亚群[1,白细胞介素(IL-)10-产生,FOXP 3CD4+T细胞,命名为T调节型1(T)R1)细胞,最近在慢性炎症性疾病和癌症中引起了人们的注意[2,3,4,5]。T型R1细胞被描述为IL-10诱导的细胞,产生IL-10并具有细胞毒活性,但也表达多种共抑制受体,如程序性细胞死亡蛋白-1(pd-1)。5].

Pd-1在血源CD4中的表达增加+T细胞已被报道为CLL[1, 6,7,8]和其他B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL),包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)[9, 10]。然而,这些pd-1的作用+CD4+未对CLL中的T细胞进行研究。阻断pd-1及其配体pd-L1,增强CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫,对E-TCL 1小鼠模型有较好的应答率[11, 12]。然而,针对PD-1/PD-L1轴的免疫检查点抑制剂的临床试验导致了令人失望的结果。其中没有一名CLL患者在接受治疗后获得缓解,只有一组患者(NCT 02332980)受益于这种治疗,他们中有更积极的Richter的转变。(NCT 02332980)[13]。据推测,pd-1阻滞在CLL中的临床疗效不佳是由于肿瘤浸润的T细胞相对于包括dlbcl在内的其他B-NHL实体有较低的pd-1表达所致。10]。在DLBCL中,pd-1的表达与较好的生存期有关。14, 15]。然而,免疫检查点阻断导致DLBCL患者的总有效率仅为10%左右(NCT 02038933)[16].

近年来,转录因子eomesodermin(Eomes)被证明能促进IL-10的产生。R1细胞和其他因素,如PR结构域锌指蛋白1(BLIMP 1),在小鼠和人类中都是如此[2,3,4]。Eomes属于T-box转录因子家族,在包括免疫系统在内的许多器官中都有表达。17]。Eomes通过其副戒律T-BET,已被证明能促进干扰素γ(IFNγ)的产生,并促进自然杀伤(NK)细胞的细胞毒性。18,19,20],CD8+[19,20,21]和CD4+T细胞[2, 3, 19, 22, 23]。Eomes在促进经典NK细胞成熟方面也具有非冗余的作用。24,以及在中央存储器的积累中[20, 25]和精疲力竭,pd-1-表达CD8。+T细胞[26]。CD8中pd-1与Eomes的共表达+我们最近在CLL的E-TCL 1过继转移(TCL 1 AT)小鼠模型中发现了T细胞[27].

与NK细胞和CD8形成对比+T淋巴细胞,非常少的CD4+T细胞在不受免疫刺激的情况下表达Eomes。然而,我们和其他人已经证明,Eomes可以在CD4中被上调。+T细胞活化后,影响分化为辅助细胞系[28]。此外,Eomes促进Th1 T细胞表达干扰素γ[29,30,31]并抑制Th17的分化[3, 31, 32]和FOXP 3+调节性T细胞(Treg)[28].

在这里,我们观察到了表达pd-1的eomes的积累。+CD4+CLL患者及小鼠模型中T细胞亚群的研究R1细胞。我们进一步证明,这些细胞具有细胞毒性作用,并能以依从性的方式控制小鼠白血病的发展。

方法

病人样本

根据赫尔辛基宣言,在地方伦理委员会批准研究规程后,从大学乌尔姆诊所的第三内科、海德堡大学诊所的第五医学部和巴塞罗那医院诊所,并在获得病人的知情同意后,获得了病人样本。患者分别符合CLL和DLBCL的标准诊断标准。补充表中提供了病人的特征,如年龄、突变状态和比内阶段。13。健康,年龄匹配的对照者在知情同意后从Biomex GmbH(德国海德堡)获得.

肿瘤模型与CD4过继性+T细胞转移

采用免疫组化法进行小鼠白血病细胞过继转移。或者静脉注射。1~2×10移植7Eμ-TCL 1脾细胞分为6~8周龄C57BL/6N或J野生型雌性动物。CD4+共转移实验,女性拉格2−/−6~8周龄小鼠腹腔注射。2×10移植5CD4+T细胞或PBS作为对照。第二天,1×106纯化的TCL 1白血病细胞经腹腔注射。变成接受者。

幼稚CD4过继转移+T单元按前面描述的方式执行[28]。总之,拉格2−/−受体小鼠4×105流式细胞术分类CD4+CD45RBT细胞。注射。移植后3周处死小鼠,进行脾脏分析。本研究中使用的抗体清单可在补充表中查阅。4.

所有动物实验都是根据地方当局批准的机构和政府准则进行的(Regierungspr sidium Karlsruhe,许可证编号:G36/14、G98/16、G 123/14和Regierungspr sidium Freiburg,许可证编号:35-9185.81/G-13/73)。

统计分析

样本大小是根据读数的预期方差来确定的。没有样品或动物被排除在分析之外。动物研究中没有采用随机或盲目的方法。图图中显示了对每个数据集使用的统计测试。采用非参数Mann-Whitney检验对各组样本进行比较。采用Wilcoxon配对符号秩检验对匹配样本进行比较。值.的值p < 0.05 were considered statistically significant. All graphs show means ± standard error of the mean (SEM), unless otherwise indicated.

结果

细胞毒性小体+Pd-1+ TR1样CD4+CLL患者淋巴结中T细胞的积聚

根据公布的数据[1, 6, 8,9,10, 33,34,35],我们观察到pd-1-表达的pd-1积聚。+CLL或DLBCL患者血液中T细胞与健康对照组(HC)比较(附图)1A-E),随后旨在对这些细胞进行表征。因为pd-1已被证明是由T表示的。R1个细胞[5],我们研究了Eomes和pd-1共表达T的频率。R在CLL患者和对照组的血液中观察到这些细胞的频率没有差异(补充图)。1F)。当然,Eomes的频率没有实质性的变化。+Pd-1+ TR在5年以上CLL患者的连续血样中观察到1-样细胞(附图)。1g)。自TR1细胞发挥细胞毒性作用[5我们分析了pd-1细胞毒分子颗粒酶B(GzmB)、脱颗粒标记CD107a和干扰素γ。+对pd-1CD4+T细胞这清楚地表明pd-1+与pd-1相比,细胞具有更高的细胞毒能力。CLL患者和对照组的细胞(补充图。2A-F)证实pd-1-表达CD4。+T细胞具有细胞毒能力,在CLL中也有。

正如我们和其他人最近强调的那样,外周血T细胞的表型与CLL中的LNS有明显差异,T细胞激活和衰竭的表型仅在组织中存在,而在血液中则不存在。34, 36],我们研究了Eomes的丰度和频率。+Pd-1+ TR患者次级淋巴器官(SLO)中的1样细胞。有趣的是,我们检测到更多的CD4+与配对血样相比,LNS中每个CLL细胞的T细胞(补充图)。2G),而T的频率明显较高。RLNS中的1-样细胞(图1.1A在CD 69和HLA-DR表达的基础上表现出更高的活化状态(补充图)。2H)。这些结果表明TR1样细胞在CLL患者SLO中具有病理意义.

图1:Eomes+Pd-1+ TR具有细胞毒性功能的1-样细胞在CLL淋巴结中积聚。

A采用流式细胞术对CLL患者的PBB和淋巴结(LN)进行分析。具有代表性的点图以及Eomes的频率+Pd-1+TR1样细胞。B对CLL患者的Ln标本进行体外PMA/离体霉素刺激。CD107a的nMFI和干扰素γ的频率+Pd-1细胞+或PD-1CD4+T细胞C具有代表性的等高线图和Eomes的频率+Pd-1+ TRCD4中的1样细胞+反应性、非致病性淋巴结(RLN)和CLL患者LN标本中的T细胞。每个点代表单个病人的数据。由成对样本导出的数据由一条线连接。在(C),描述了数据的中位数。用Mann-Whitney检验进行统计学分析。用Wilcoxon配对符号秩检验对匹配样本进行比较。p < 0.05. nMFI = normalized median fluorescence intensity.

我们进一步分析了干扰素调节因子4(IRF 4)和碱性亮氨酸拉链ATF样转录因子(Batf)在T细胞中的作用。R1个细胞[5],在CLL患者的配对血和LN样本中。我们观察到iRF 4和batf在pd-1中的高表达。+CD4+LN中T细胞与血液的比较(附图)。2I,J),支持T频率增加的结果。RCLL患者SLO中的1样细胞。通过对T细胞毒性程度的分析,我们观察到pd-1细胞中CD107a和IFNγ的高表达。+与pd-1相比LN中的细胞(如图所示)。1(B),这与我们在血液中的观察和我们关于T的病理相关性的假设是一致的。R1样细胞。

最终,我们的目标是比较T的频率。R反应性、非恶性LNS(RLNS)中的1样细胞与CLL和DLBCL LNS比较。我们检测到很大一部分TR1样细胞均为CLL(中位数:12.90%)和DLBCL(中位数:14.75%)。相反,大多数rLN的频率较低(中位数:4.85%)。1C和补充图。2K).

因此,TR1样CD4+T细胞在CLL和DLBCL患者的LNS中表现出细胞毒性,并在LNS中积累,使其在这些恶性肿瘤中的潜在病理累及可能性很大。

Eomes控制TR1细胞特异性基因标记,包括CD4中的抑制性受体。+T细胞

为了了解Eomes在T中的作用R1细胞,我们转向动物模型,并利用埃梅斯-绿色荧光蛋白记者老鼠(埃梅斯+/GFP)其中埃梅斯-表达CD4+T细胞可鉴定为绿色荧光蛋白阳性细胞[37]。正如我们之前所证明的那样,收养性转移的幼稚CD4+T细胞进入淋巴细胞拉格2−/−宿主导致Eomes的积累+Pd-1+T细胞R1表型[28,我们转移了CD4+T细胞埃梅斯-绿色荧光蛋白记者老鼠拉格2−/−小鼠,3周后,分类gfp阳性和gfp阴性CD4。+这些小鼠的T细胞进行RNA测序。这使我们能够识别1,048个基因的转录特征,其中568个基因被上调,480个基因被下调。埃梅斯-绿色荧光蛋白-阳性与阳性埃梅斯-绿色荧光蛋白-CD4阴性+T细胞(图1.2A、比较1和补充表56)。正如预期的那样,其中一个顶级的上调基因是埃梅斯验证我们的实验方法。在gfp中的最上层上调基因中+细胞,我们鉴定了几个与T相关的分子R1小鼠和男性的表型,如IL 10, Il10ra, Pdcd 1(编码PD-1),LAG 3, 蒂吉特,和CD 27(补充表)6) [5]。这支持Eomes作为T标记的有效性。R1细胞。GFP中下调基因中的顶级基因之一+细胞,我们检测到Foxp 3(补充表)6),这与我们先前发现的一种对立关系是一致的。埃梅斯Foxp 3 [28].

图2:Eomes控制TR1细胞特异性基因标记,包括CD4中的抑制性受体。+T细胞

幼稚CD 25CD45RBCD4+T细胞Eomes-GFP记者老鼠(埃梅斯+/GFP),以及具有T细胞特异性缺失的小鼠。埃梅斯与一名全球计划生育组织的记者(埃梅斯ΔT/GFP)转移到拉格2−/−老鼠。过继转移后3周,已分离的脾GFP的RNA序列测定+和绿色伙伴关系方案CD4+进行T细胞亚群。A分析策略:比较1揭示GFP之间的转录差异。+ TR1细胞和绿色荧光蛋白CD4+T细胞埃梅斯+/GFP供体小鼠;比较2显示Eomes-熟练者之间的差异基因表达(埃梅斯+/GFP)和Eomes-缺陷(埃梅斯ΔT/GFP)绿色伙伴关系+CD4+T细胞B对数2基因表达的热图(比较2)。热图中排除T细胞受体转录本。粗体字体显示的基因也是差异表达的比较1。红色突出感兴趣的基因。CPd-1和LAG 3表达的代表RNA-seq轨迹和流式细胞仪分析埃梅斯-绿色荧光蛋白+埃梅斯-绿色荧光蛋白CD4+T细胞,pd-1或LAG 3在GFP中的表达率+或GFP细胞。每个点表示单个鼠标的数据。Eomes的线路链接数据和埃梅斯+来自同一动物的细胞。配对样本的统计分析C)采用Wilcoxon配对签名秩检验。***p < 0.001; ****p < 0.0001.

Eomes调控T的相关性分析R1细胞身份,我们包括一个埃梅斯敲除小鼠模型(EomesΔT/绿色伙伴关系),其中一个等位基因为埃梅斯基因被gfp敲入破坏,而第二个等位基因缺乏编码eomes的dna结合域的第2-5外显子。这一秒的截短mRNA和蛋白质埃梅斯等位基因在这些小鼠中表达并可检测到(补充图)。3A),但Eomes功能失调,不能诱导靶基因[38]。因此,gfp在这些小鼠中的表达可以识别具有活性的细胞。埃梅斯转录,但缺乏Eomes的活性。我们使用了同样的CD4过继转移方法。+T细胞拉格2−/−如上文所述,并对已排序的gfp进行rna测序。+和绿色伙伴关系方案CD4+T细胞移植后3周。这使得我们可以比较eomes熟练和eomes缺乏的cd4的基因表达谱。+T细胞活化埃梅斯转录,从而确定哪些基因是由Eomes转录调控的(如图所示)。2A,比较2)。这些比较分析的结果表明,109个基因依赖于Eomes的转录活性,其中71个基因在Eomes缺陷细胞中的表达较低,因此最有可能是Eomes的直接转录靶点,而38个基因在Eomes缺陷细胞中的表达较高(图1)。2B和补充表6)。尽管差异表达基因的数量较少,但eomes缺乏gfp。+两个生物复制体的细胞分别与Eomes-熟练的gfp聚集在一起。+多维标度图上的样本(附图)3B)。这表明Eomes的转录能力确实需要表达一个特定的转录程序。正如预期的那样,两种基因型的绿色荧光蛋白阴性样本没有很好地分离。

在这109个基因中,61个基因也有差异表达,其中1个代表T的转录特征。R1细胞(附图)3C;基因在图中以粗体突出显示。2(B),表示TR1表型部分由Eomes驱动。

Eomes以前曾与T细胞衰竭有关,抑制性受体的大量表达是T的一个特征。R1个细胞[5]。与此相一致,我们观察到一些抑制性受体基因的表达,如CTLA 4, Pdcd 1, Cd300lf,和蒂吉特,取决于eomes,以及耗竭相关转录因子的表达。毒理 [39, 40(基因以红色突出显示,如图所示。2B;读对齐Pdcd 1LAG 3在图中。2c)。我们进一步验证了+细胞中pd-1和lg 3的蛋白表达水平高于eomes。细胞(图1.2C)。通过对比较1和2中差异表达基因的独创性路径分析,我们发现“神经炎症信号”和“T细胞衰竭信号”是gfp中最重要的解除管制途径。+由Eomes控制的细胞(附图)。三维空间)。总之,我们的结果表明,Eomes通过它在T中的相关性R1细胞,参与炎症疾病的发病,也可能是癌症,包括CLL。

为了解决这个问题,Eomes是只促进少数特定基因(例如抑制性受体)的转录,还是作为T的驱动因素?R1细胞,我们开发了流式细胞术的标记组合,使我们可以为Eomes进行富集。+CD4+中的T细胞拉格2−/−过继转移模型我们观察到+细胞中含有大部分pd-1。+CD 44罗氏这些小鼠的细胞(补充图。3E)。有趣的是,收养转移埃梅斯-缺乏幼稚CD4+T细胞产生pd-1的数量显著减少。+CD 44罗氏CD4+T细胞比较埃梅斯-熟练的细胞,这一效果在两种情况下都保留了下来。埃梅斯-熟练的和缺乏的T细胞被共同转移到相同的细胞中。拉格2−/−接受者(附图)3F)。这些结果表明,Eomes不仅激活了多个靶基因的表达,而且还控制了这种特定CD4的积累。+T细胞亚群。而标记组合pd-1+CD 44罗氏适合于鉴定伊梅斯+CD4+T细胞在T细胞转移实验中的应用拉格2−/−在老年小鼠中不能检测到相应的细胞群(补充图)。3E),这与这种标记组合对于识别T的一般适用性是有争议的。R1细胞。

总之,我们的转录组分析确定了一个TR1细胞特异性基因标记,包含多个抑制性受体,并对关键T基因进行富集。R1-相关途径和标记物。我们进一步证明了这个特征的一部分是由Eomes驱动的。

Eomes驱动IL-10在人T中的表达和丰富的基因。R1签名

进一步研究T中Eomes控制的途径R1细胞,进行KEGG通路分析。最重要的路径图是“细胞因子-细胞因子受体相互作用”,其次是细胞因子在其中起着重要作用的几条途径(补充图)。4A)。这表明Eomes对T细胞因子和细胞因子受体具有调节作用。R1细胞。沿着这条路线,我们在gfp中发现了上调基因。+依赖于Eomes存在的细胞,TR1标志细胞因子IL 10(无花果)2B和补充图。4B),与以前的报告一致[2,3,4]。T细胞移植拉格2/−小鼠证实大部分产生白细胞介素-10的CD4。+T细胞共表达Eomes(图1.3A)。重要的是,大多数产生白细胞介素10的细胞也共同表达干扰素γ。3B),与先前发表的T相一致。R1份说明[3, 41]。IL-10/IFN-γ共表达依赖于eome,而不是微环境中的非细胞自治因子。埃梅斯-CD4缺乏+T细胞不产生IL-10,无论它们是单独转移还是与埃梅斯-熟练,CD4+T细胞(图1.3B).

图3:表达CD4的Eomes+T细胞表达IL-10及用T表达MAPR1细胞。

用于分析的细胞如图所述。2. A脾小体产生IL-10的代表点图及定量+和埃梅斯CD4+T细胞移植3周后拉格2−/−体外用PMA/离体霉素刺激宿主,用细胞内流式细胞仪进行分析。B同源标记的Eomes-熟练(控制)或Eomes缺陷(KO)CD4+T细胞被转移到单独的,或相同的。拉格2−/−3周后用流式细胞仪分析脾细胞。点图显示IL-10和IFN-γ有代表性表达.白细胞介素-10产生CD4的定量研究+在单迁移和共传输实验中,T单元在底部被描述.C基因集富集分析图显示Eomes依赖于TR1个基因(图2比较2)。2A)富含人的T。R1个标志性基因[3]。每个点表示单个鼠标的数据。行(A)Eomes的链接数据和埃梅斯+来自同一只老鼠的细胞;在(B)显示中值。用Mann-Whitney检验进行统计学分析。用Wilcoxon匹配对符号秩检验对共转移设定条件下的匹配样本进行比较.*p < 0.05, **p < 0.01.

最后,我们进行了基因集富集分析,结果表明,在gfp中,已鉴定出的Eomes依赖转录本。+细胞(比较2)在已发表的人类T细胞中富集。R1基因标记(图1)。3c)。除了强调人类和老鼠之间的相似性R1细胞,这些结果证实了一小部分依赖于Eomes的基因对T是至关重要的。R1细胞身份。

E-TCL 1小鼠模型中白血病的发生与细胞毒性T的积累有关R1个细胞

探讨T的作用R1个细胞(定义为Eomes)+Pd-1+)在CLL中,我们首先分析了它们在CLL小鼠模型中的存在。与年龄和性别匹配的TCL 1小鼠和WT小鼠相比,T的丰度较高。R1 TCL 1小鼠脾脏中的细胞。4A,补充图中的选通策略。5A)。这些人中的大多数+Pd-1+细胞也表达LAG 3(补充图)。5B),我们以前已经证明它依赖于Eomes。为克服CLL小鼠模型中CLL发育的较长潜伏期,将TCL 1小鼠的白血病脾细胞过继转移到同基因WT小鼠(TCL1AT)中。34, 42, 43]。在tcl1at模型的白血病发展过程中,我们观察到一种抗原体验的CD4的积累。+T细胞(附图)5C)以CD 69的表达来表示激活的迹象(补充图)。5D)。此外,T的频率较高R1 CD4+检测T细胞。4A),表现出较高的LAG 3(补充图3)的共同表达率。5B)。有趣的是,T的频率R1衰老E-TCL 1小鼠的细胞数明显高于年龄较小的TCL1AT小鼠(图1)。4A),这与我们之前观察到的Eomes是一致的。+CD4+T细胞随年龄增加[28].

图4:PD-1+CD4+共表达Eomes的T细胞在CLL的E-TCL 1小鼠模型中富集.

A采用流式细胞仪对E-TCL 1白血病小鼠和对照组65周龄小鼠和同种野生型(WT)小鼠移植E-TCL 1白血病细胞后的脾脏进行分析。代表点图和T的频率R1细胞(Eomes)+Pd-1+)CD4+E-TCL 1和TCL1AT小鼠的T细胞及其对照组。B FIR × 老虎用E-TCL 1白血病脾细胞移植小鼠脾PD-1细胞及IL-10-GFP的表达+CD4+流式细胞术分析T细胞。具有代表性的点图以及CD4中IL-10表达细胞的百分比+WT与TCL1AT中的T细胞FIR × 老虎老鼠。所有图形均为均值±扫描电镜。每个点表示单个鼠标的数据。用Mann-Whitney检验进行统计学分析。**p < 0.01; ***p < 0.001.

T的功能研究R1 TCL1AT小鼠的细胞证实了CLL患者所观察到的表型,诱导的IL-10表达随着时间的推移而增加(如图1所示)。4B和补充图。5E)和更高水平的干扰素γ,CD107a,和GzmB(补充图。5F,G),作为细胞毒性的标志,在这些细胞中。这些数据表明TR1细胞在CLL小鼠模型中积累,产生IL-10,并具有细胞毒性。

为了研究这种细胞类型对CLL进展的影响,我们转移了CD4。+T细胞拉格2−/−缺乏成熟B细胞和T细胞的小鼠[44不包括CD8的贡献+T细胞与白血病对照。接下来,如前面所述,用TCL 1白血病细胞移植小鼠[34, 42, 43]。正如之前在其他小鼠模型中所报道的,我们检测到了CD4的扩张。+T细胞拉格2−/有和不转移白血病细胞的小鼠(附图)。6A)。有趣的是,CD4+T细胞控制白血病的进展,表现为脾脏重量和每脾白血病细胞含量低于未转移T细胞的小鼠(补充图)。6B,C)。令人感兴趣的CD4+白血病脾T细胞拉格2−/小鼠T基因频率较高R1细胞(附图)6d)与非白血病对照小鼠比较,LAG 3在这些细胞上有较高的共同表达(补充图)。6E)。动物白血病刺激后T细胞增殖率增高R1细胞与非疾病小鼠比较(附图)。6f)。相反,T的细胞毒性能力R1细胞在TCL 1白血病发展过程中未发生改变(附图)。6g,H).

接下来,我们聚集了FOXP 3CD4+采用T分布随机近邻嵌入法(T-SNE),流式细胞仪检测T细胞的Eomes、PD-1、LAG 3和Ki-67的表达,推断CLL的发育是否改变了该细胞的表型。根据先前的分析,如预期的那样,TR1细胞聚集相似,无论小鼠是否受到白血病细胞的攻击(补充图)。6I),提示TCL 1白血病并不改变该细胞的表型,而是诱导其增殖。

总之,细胞毒性T的积累R1细胞建议研究他们在控制CLL进展中的作用。

Eomes对T是不可缺少的R1细胞调控TCL1AT小鼠白血病的发生发展

分析T的作用R1细胞控制CLL进展,我们使用条件埃梅斯击倒(埃梅斯−/−)小鼠,正如我们所表明的,Eomes对生成功能性T是必不可少的。R1个细胞,与以前的报告一致[2]。WT或埃梅斯−/−CD4+T细胞移植到拉格2−/−小鼠继之TCL 1白血病细胞过继转移。对这些小鼠CLL进展的分析表明:埃梅斯−/−CD4+T细胞未能控制CLL的发展,CD5的增多就证明了这一点。+CD 19+血液中的CLL细胞和较高的脾脏重量。5A)。我们进一步监测了CD4+随着时间的推移,这些小鼠的T细胞增多,并观察到受体小鼠血液中T细胞数量增加。埃梅斯−/−CD4+T细胞与WT T细胞的比较(图1)。5B)。然而,在这些动物的脾脏中,CD4的绝对数量较低。+脾T细胞和CLL细胞埃梅斯−/−与WT组比较(图1)。5c)。与此相一致,埃梅斯−/−根据Ki-67染色,脾脏T细胞的增殖率低于WT T细胞(图1)。5D),这表明Eomes对于T的膨胀是很重要的。R1细胞。我们的数据显示T的富集和更高的激活状态R1 CLL患者淋巴器官中的细胞,我们随后对这些小鼠的脾脏T细胞进行T分析。R1-相关分子。与RNA测序结果一致的是,与WT T细胞相比,Eomes缺乏导致LAG 3的表达降低(图1)。5e)。此外,Eomes对于IL-10的生产是不可或缺的。5F)和细胞毒性功能,我们观察到干扰素γ的表达降低,CD107a略有下降,Eomes缺陷的T细胞中GzmB的产量显著降低(见图)。5G).

图5:Eomes对T是至关重要的R1细胞介导的CLL对照。

拉格2−/−小鼠移植静脉注射。PBS或CD4+野生型T细胞(WT)或埃梅斯/E-TCL 1小鼠白血病脾细胞起源于第1天和第2天。用流式细胞仪在指定的时间点对血液和脾脏标本进行分析。ACD5绝对数+CD 19+移植白血病细胞后4周,外周血CLL细胞随时间和脾脏重量变化而变化。BCD4绝对数+外周血T细胞随时间的变化而变化。CCD4数+脾脏T细胞和CD4细胞数+T细胞/CD5+CD 19+显示CLL细胞。D占KI-67的百分比+脾外CD4细胞+T细胞ELAG 3所占百分比+脾pd-1细胞+CD4+T细胞FIL-10-GFP在脾Pd-1中的表达+CD4+T细胞显示为有代表性的直方图和量化数据。G用PMA/离体霉素体外刺激脾细胞,细胞内流式细胞仪检测细胞因子的表达。干扰素γ频率+Pd-1细胞+CD4+T细胞,pd-1的CD107a和GzmB的nMFI+CD4+T细胞所有图形均为均值±扫描电镜。每个点表示单个鼠标的数据。用Mann-Whitney检验进行统计学分析。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Tx = transplantation, nMFI =   normalized median fluorescence intensity.

总之,Eomes对控制小鼠CLL的进展是非常重要的,因为它介导了CD4的扩张和细胞毒性。+T细胞

IL-10R信号维持细胞毒性TR1个单元,并允许它们控制CLL。

独创性路径分析埃梅斯-依赖基因IL 10STAT 3作为最有潜力的上游调整器(补充表)7)。在线上,IL-10R信号已经被证明对T是必不可少的。R1功能[45]。因此,我们决定研究IL-10R介导的信号在T细胞中的作用。R1细胞及其对TCL 1白血病控制的影响。任一Il10rb+/+(WT)或Il10rb−/−CD4+T细胞拉格2−/−小鼠后移植TCL 1白血病。令人感兴趣,Il10rb-CD4缺乏+T细胞对CD5升高的CLL的抑制作用+CD 19+TCL1AT后4周,CLL随时间和脾脏重量增加而计数,与接受WT T细胞的对照组比较(图1)。6A)。评估是否减少了Il10rb−/−CD4+T细胞参与了CLL控制的减少,随着时间的推移,血液中T细胞计数被监测.白血病细胞转移后3周和4周,较高数量的白血病细胞Il10Rb−/−对WT CD4+血中可见T细胞。6B)。CD4+脾脏T细胞计数呈增加趋势。Il10rb−/−CD4+T细胞与WT脾T细胞的比较(附图)。7A),这很可能反映了Il10rb−/组,作为CD4的数量+与WT组相比,这些小鼠每只CLL细胞的T细胞减少。6B)。然而,CD4的增殖+用Ki-67测得的T细胞在两组间没有显着性差异(图二)。6C)。因此,IL-10 R介导的信号在CD4中起作用。+T细胞对CLL的有效控制是必需的,而这并不主要是由于T细胞的扩张。

图6:il-10R信号通过维护功能T来控制cll的发展R1细胞。

拉格2−/−小鼠移植静脉注射。PBS或CD4+野生型T细胞(WT)或Il10rb−/−E-TCL 1小鼠白血病脾细胞起源于第1天和第2天。用流式细胞仪对血液和脾脏标本进行分析。ACD5绝对数+CD 19+移植白血病细胞后4周,外周血CLL细胞随时间和脾脏重量变化而变化。BCD4绝对数+随着时间的推移,外周血中的T细胞和CD4的数量都有变化。+T细胞/CD5+CD 19+显示CLL细胞。C占KI-67的百分比+脾外CD4细胞+T细胞DEomes频率+Pd-1+脾外CD4细胞+T细胞E串联脾WT T的T-SNE图R1个细胞和Il10rb−/−埃梅斯+Pd-1+CD4+T细胞基于流式细胞术检测PD-1、Eomes、LAG 3和Ki-67的表达(上段)。两种细胞类型在深蓝色和浅蓝色与WT FOXP 3的叠加CD4+T细胞在灰色(较低的地块)。F用PMA/离体霉素体外刺激脾细胞,细胞内流式细胞仪检测细胞因子的表达。干扰素γ频率+Pd-1细胞+CD4+T细胞,pd-1的CD107a和GzmB的nMFI+CD4+T细胞所有图形均为均值±扫描电镜。每个点表示单个鼠标的数据。用Mann-Whitney进行统计学分析。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. nMFI = normalized median fluorescence intensity.

IL-10Rα信号对T细胞的分化是不可缺少的。R1个细胞,但不是这种细胞类型的功能[45]。同样,我们调查了Il10Rb对于TR1细胞。如Il10rb−/−CD4+T细胞表现出较高的T细胞频率。R1细胞比WT T细胞(图1)。6d),我们聚集了FOXP 3CD4+WT和T细胞Il10Rb−/−用流式细胞仪检测其Eomes、PD-1、LAG 3和Ki-67的表达,采用t-SNE算法进行比较分析。有趣的是,埃梅斯+Pd-1+CD4+TR1-样细胞Il10Rb−/−WT T的起源聚类R1个细胞(图1)。6E和补充图。7b),很可能是由pd-1的高表达所驱动。这表明IL-10R信号对于维持T是至关重要的。R1细胞表型。这一发现进一步得到了细胞毒性功能降低的支持。Il10rb−/−埃梅斯+Pd-1+CD4+T细胞与WT T细胞的比较R1个细胞(图1)。6f),认为这些细胞在白细胞介素-10R缺乏时会产生不同的表型。

综上所述,我们的数据表明,Eomes对于细胞毒性T的积累是不可或缺的。R1细胞,一种细胞类型,其功能依赖于IL-10R信号,这限制了CLL的进展.

讨论

CD4改变的频率+B-NHL患者T细胞亚群被广泛描述[9, 35, 42, 46,但它们的功能和病理相关性尚不清楚。1]。因此,我们旨在阐明pd-1在pd-1表达中的作用。+这些恶性肿瘤中的T细胞。通过对cll和dlbcl患者血样的分析,我们观察到pd-1表达的比例较高。+两组患者的T细胞与HC相比,证实了已发表的数据[6,7,8,9,10]。此外,我们注意到pd-1的一个子集。+细胞共表达的Eomes,这已经被观察到T。R1细胞。类似pd-1表达的CD8+T细胞[34, 36]、TRCLL患者LN标本中1-样T细胞富集,恶性B细胞与T细胞紧密相互作用的部位及其增殖47, 48],并在成对血样中表现出比相应细胞更高的活性。我们进一步观察到,这些细胞具有细胞毒性能力,这与公布的CD4数据一致。+B-NHL患者血T细胞的测定[49,50,51]。有趣的是,这些CD4+T细胞被证明可以杀死自体B细胞,不管它们是从CLL患者还是HC中分离出来的。49].

TR1细胞不构成性表达FOXP 3,产生免疫抑制因子IL-10,表达pd-1或LAG 3等共抑制受体,产生细胞毒性分子。5]。Eomes最近被证明对T的产生很重要R1个细胞[2, 3并调节IL-10在这些细胞中的表达[2, 3, 52]。此外,Eomes对产生CD4细胞毒性分子的重要性+T细胞描述得很好22, 23, 53]。通过对小鼠T细胞进行rna测序和表型分析,我们证实了Eomes的重叠。+Pd-1+CD4+人T细胞研究中的T细胞分析R1细胞,证明Eomes参与了它们的产生,并对其功能起着不可或缺的作用。重要的是,Eomes只控制了一个小的基因集,这些基因在先前描述的T基因中得到了丰富。R1细胞,如IL-10、PD-1和LAG 3。在这些基因中还有几个整合素,它们可能参与T细胞的迁移和归巢,因此与熟练的CD4相比,Eomes缺陷的数量更多。+T细胞转移后留在血液中拉格2−/−CLL小鼠。

有趣的是,利用小鼠的cll模型,我们证明了eomes对于CD4是必不可少的。+T细胞介导的CLL调控拉格2−/−老鼠。在这些老鼠体内,CD4+T细胞增殖并获得细胞毒活性,与小鼠黑色素瘤模型相似[54].

由于IL-10驱动的信号通过p38 MAPK被证明是维持IL-10在T中产生的重要途径。R1个细胞[45],我们研究了IL-10R信号在T细胞中的作用。R1细胞与控制白血病进展。有趣的是,Il10rb−/−CD4+T细胞在pd-1和Eomes高表达的同时,表现出较低的cll调控,与WT T的表达不同。R1细胞。Pd-1和eomes表达的增加伴随着干扰素γ的产生减少,这表明IL-10 R信号对维持细胞毒性T是重要的。R1个子集。这与公布的CD8结果是一致的。+T细胞,表明Eomes的过度表达导致耗竭分子的表达增加,例如CD 244, 哈弗克2,和Il10ra,提示IL-10介导的信号在调节T细胞衰竭中的作用[55]。小鼠和人肿瘤感染模型的研究表明pd-1在CD8中的表达水平。+T细胞决定其耗尽状态和PD-1阻断恢复活力的可能性[56]。沿着这条线,我们观察到IL-10介导的信号维持着CD8的一个子集。+具有中间Pd-1表达的T细胞,并具有较高的调控CLL的能力。57]。这表明,IL-10介导的信号对维持效应细胞的功能非常重要,而不仅仅是在CD8中。+T细胞,也包括T细胞R1细胞。

全基因组关联研究表明,单核苷酸多态性(SNPs)与埃梅斯基因与患CLL的风险较高有关(Rs 9880772)[58, 59],DLBCL(Rs6773363)[60和霍奇金淋巴瘤(Rs3806624)[61]。携带这些SNPs的个体产生B-NHL的可能性较高,这被认为是由免疫功能放松引起的,正如我们的研究所示,这至少可以部分地解释为CLL发展控制的减少。同时,小鼠模型的临床前数据[62第一阶段试验(NCT 02009449)中使用聚乙二醇化的IL-10治疗实体癌的数据表明,IL-10有助于维持CD8。+T细胞介导的肿瘤控制和改善患者对PD-1阻断的反应[63].


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