细胞毒性小体 + Pd-1 + TR 1样CD4 + CLL患者淋巴结中T细胞的积聚 根据公布的数据[ 1 , 6 , 8 ,9 ,10 , 33 ,34 ,35 ]，我们观察到pd-1-表达的pd-1积聚。 + CLL或DLBCL患者血液中T细胞与健康对照组(HC)比较(附图) 1A-E )，随后旨在对这些细胞进行表征。因为pd-1已被证明是由T表示的。 R 1个细胞[ 5 ]，我们研究了Eomes和pd-1共表达T的频率。 R 在CLL患者和对照组的血液中观察到这些细胞的频率没有差异(补充图)。 1F )。当然，Eomes的频率没有实质性的变化。 + Pd-1 + TR 在5年以上CLL患者的连续血样中观察到1-样细胞(附图)。 1g )。自T R 1细胞发挥细胞毒性作用[ 5 我们分析了pd-1细胞毒分子颗粒酶B(GzmB)、脱颗粒标记CD107a和干扰素γ。 + 对pd-1 − CD4 + T细胞这清楚地表明pd-1 + 与pd-1相比，细胞具有更高的细胞毒能力。 − CLL患者和对照组的细胞(补充图。 2A-F )证实pd-1-表达CD4。 + T细胞具有细胞毒能力，在CLL中也有。
正如我们和其他人最近强调的那样，外周血T细胞的表型与CLL中的LNS有明显差异，T细胞激活和衰竭的表型仅在组织中存在，而在血液中则不存在。 34 , 36 ]，我们研究了Eomes的丰度和频率。 + Pd-1 + TR 患者次级淋巴器官(SLO)中的1样细胞。有趣的是，我们检测到更多的CD4 + 与配对血样相比，LNS中每个CLL细胞的T细胞(补充图)。 2G )，而T的频率明显较高。 R LNS中的1-样细胞(图1. 1A 在CD 69和HLA-DR表达的基础上表现出更高的活化状态(补充图)。 2H )。这些结果表明T R 1样细胞在CLL患者SLO中具有病理意义.
图1：Eomes + Pd-1 + TR 具有细胞毒性功能的1-样细胞在CLL淋巴结中积聚。 A 采用流式细胞术对CLL患者的PBB和淋巴结(LN)进行分析。具有代表性的点图以及Eomes的频率 + Pd-1 + TR 1样细胞。 B 对CLL患者的Ln标本进行体外PMA/离体霉素刺激。CD107a的nMFI和干扰素γ的频率 + Pd-1细胞 + 或PD-1 − CD4 + T细胞 C 具有代表性的等高线图和Eomes的频率 + Pd-1 + TR CD4中的1样细胞 + 反应性、非致病性淋巴结(RLN)和CLL患者LN标本中的T细胞。每个点代表单个病人的数据。由成对样本导出的数据由一条线连接。在(C )，描述了数据的中位数。用Mann-Whitney检验进行统计学分析。用Wilcoxon配对符号秩检验对匹配样本进行比较。 p < 0.05. nMFI = normalized median fluorescence intensity.
我们进一步分析了干扰素调节因子4(IRF 4)和碱性亮氨酸拉链ATF样转录因子(Batf)在T细胞中的作用。 R 1个细胞[ 5 ]，在CLL患者的配对血和LN样本中。我们观察到iRF 4和batf在pd-1中的高表达。 + CD4 + LN中T细胞与血液的比较(附图)。 2I，J )，支持T频率增加的结果。 R CLL患者SLO中的1样细胞。通过对T细胞毒性程度的分析，我们观察到pd-1细胞中CD107a和IFNγ的高表达。 + 与pd-1相比 − LN中的细胞(如图所示)。 1 (B)，这与我们在血液中的观察和我们关于T的病理相关性的假设是一致的。 R 1样细胞。
最终，我们的目标是比较T的频率。 R 反应性、非恶性LNS(RLNS)中的1样细胞与CLL和DLBCL LNS比较。我们检测到很大一部分T R 1样细胞均为CLL(中位数：12.90%)和DLBCL(中位数：14.75%)。相反，大多数rLN的频率较低(中位数：4.85%)。 1C 和补充图。 2K ).
因此，T R 1样CD4 + T细胞在CLL和DLBCL患者的LNS中表现出细胞毒性，并在LNS中积累，使其在这些恶性肿瘤中的潜在病理累及可能性很大。
Eomes控制T R 1细胞特异性基因标记，包括CD4中的抑制性受体。 + T细胞 为了了解Eomes在T中的作用 R 1细胞，我们转向动物模型，并利用 埃梅斯- 绿色荧光蛋白 记者老鼠( 埃梅斯 +/GFP )其中 埃梅斯 -表达CD4 + T细胞可鉴定为绿色荧光蛋白阳性细胞[ 37 ]。正如我们之前所证明的那样，收养性转移的幼稚CD4 + T细胞进入淋巴细胞 拉格2 −/− 宿主导致Eomes的积累 + Pd-1 + T细胞 R 1表型[ 28 ，我们转移了CD4 + T细胞 埃梅斯- 绿色荧光蛋白 记者老鼠 拉格2 −/− 小鼠，3周后，分类gfp阳性和gfp阴性CD4。 + 这些小鼠的T细胞进行RNA测序。这使我们能够识别1,048个基因的转录特征，其中568个基因被上调，480个基因被下调。 埃梅斯- 绿色荧光蛋白-阳性与阳性 埃梅斯- 绿色荧光蛋白 -CD4阴性 + T细胞(图1. 2A 、比较1和补充表 5 和 6 )。正如预期的那样，其中一个顶级的上调基因是 埃梅斯 验证我们的实验方法。在gfp中的最上层上调基因中 + 细胞，我们鉴定了几个与T相关的分子 R 1小鼠和男性的表型，如 IL 10 , Il10ra , Pdcd 1 (编码PD-1)， LAG 3 , 蒂吉特 ，和 CD 27 (补充表) 6 ) [5 ]。这支持Eomes作为T标记的有效性。 R 1细胞。GFP中下调基因中的顶级基因之一 + 细胞，我们检测到 Foxp 3 (补充表) 6 )，这与我们先前发现的一种对立关系是一致的。 埃梅斯 和 Foxp 3 [28 ].
图2：Eomes控制T R 1细胞特异性基因标记，包括CD4中的抑制性受体。 + T细胞 幼稚CD 25 − CD45RB 高 CD4 + T细胞 Eomes-GFP 记者老鼠( 埃梅斯 +/GFP )，以及具有T细胞特异性缺失的小鼠。 埃梅斯 与一名全球计划生育组织的记者( 埃梅斯 ΔT/GFP )转移到 拉格2 −/− 老鼠。过继转移后3周，已分离的脾GFP的RNA序列测定 + 和绿色伙伴关系方案 − CD4 + 进行T细胞亚群。 A 分析策略：比较1揭示GFP之间的转录差异。 + TR 1细胞和绿色荧光蛋白 − CD4 + T细胞 埃梅斯 +/GFP 供体小鼠；比较2显示Eomes-熟练者之间的差异基因表达( 埃梅斯 +/GFP )和Eomes-缺陷( 埃梅斯 ΔT/GFP )绿色伙伴关系 + CD4 + T细胞 B 对数2基因表达的热图(比较2)。热图中排除T细胞受体转录本。粗体字体显示的基因也是差异表达的比较1。红色突出感兴趣的基因。 C Pd-1和LAG 3表达的代表RNA-seq轨迹和流式细胞仪分析 埃梅斯- 绿色荧光蛋白 + 和 埃梅斯- 绿色荧光蛋白 − CD4 + T细胞，pd-1或LAG 3在GFP中的表达率 + 或GFP − 细胞。每个点表示单个鼠标的数据。Eomes的线路链接数据− 和埃梅斯 + 来自同一动物的细胞。配对样本的统计分析 C )采用Wilcoxon配对签名秩检验。*** p < 0.001; ****p < 0.0001.
Eomes调控T的相关性分析 R 1细胞身份，我们包括一个 埃梅斯 敲除小鼠模型 (Eomes ΔT /绿色伙伴关系 )，其中一个等位基因为 埃梅斯 基因被gfp敲入破坏，而第二个等位基因缺乏编码eomes的dna结合域的第2-5外显子。这一秒的截短mRNA和蛋白质 埃梅斯 等位基因在这些小鼠中表达并可检测到(补充图)。 3A )，但Eomes功能失调，不能诱导靶基因[ 38 ]。因此，gfp在这些小鼠中的表达可以识别具有活性的细胞。 埃梅斯 转录，但缺乏Eomes的活性。我们使用了同样的CD4过继转移方法。 + T细胞 拉格2 −/− 如上文所述，并对已排序的gfp进行rna测序。 + 和绿色伙伴关系方案 − CD4 + T细胞移植后3周。这使得我们可以比较eomes熟练和eomes缺乏的cd4的基因表达谱。 + T细胞活化 埃梅斯 转录，从而确定哪些基因是由Eomes转录调控的(如图所示)。 2A ，比较2)。这些比较分析的结果表明，109个基因依赖于Eomes的转录活性，其中71个基因在Eomes缺陷细胞中的表达较低，因此最有可能是Eomes的直接转录靶点，而38个基因在Eomes缺陷细胞中的表达较高(图1)。 2B 和补充表 6 )。尽管差异表达基因的数量较少，但eomes缺乏gfp。 + 两个生物复制体的细胞分别与Eomes-熟练的gfp聚集在一起。 + 多维标度图上的样本(附图) 3B )。这表明Eomes的转录能力确实需要表达一个特定的转录程序。正如预期的那样，两种基因型的绿色荧光蛋白阴性样本没有很好地分离。
在这109个基因中，61个基因也有差异表达，其中1个代表T的转录特征。 R 1细胞(附图) 3C ；基因在图中以粗体突出显示。 2 (B)，表示T R 1表型部分由Eomes驱动。
Eomes以前曾与T细胞衰竭有关，抑制性受体的大量表达是T的一个特征。 R 1个细胞[ 5 ]。与此相一致，我们观察到一些抑制性受体基因的表达，如 CTLA 4 , Pdcd 1 , Cd300lf ，和 蒂吉特 ，取决于eomes，以及耗竭相关转录因子的表达。 毒理 [39 , 40 (基因以红色突出显示，如图所示。 2 B；读对齐 Pdcd 1 和 LAG 3 在图中。 2 c)。我们进一步验证了 + 细胞中pd-1和lg 3的蛋白表达水平高于eomes。 − 细胞(图1. 2C )。通过对比较1和2中差异表达基因的独创性路径分析，我们发现“神经炎症信号”和“T细胞衰竭信号”是gfp中最重要的解除管制途径。 + 由Eomes控制的细胞(附图)。 三维空间 )。总之，我们的结果表明，Eomes通过它在T中的相关性 R 1细胞，参与炎症疾病的发病，也可能是癌症，包括CLL。
为了解决这个问题，Eomes是只促进少数特定基因(例如抑制性受体)的转录，还是作为T的驱动因素？ R 1细胞，我们开发了流式细胞术的标记组合，使我们可以为Eomes进行富集。 + CD4 + 中的T细胞 拉格2 −/− 过继转移模型我们观察到 + 细胞中含有大部分pd-1。 + CD 44 罗氏 这些小鼠的细胞(补充图。 3E )。有趣的是，收养转移 埃梅斯 -缺乏幼稚CD4 + T细胞产生pd-1的数量显著减少。 + CD 44 罗氏 CD4 + T细胞比较 埃梅斯 -熟练的细胞，这一效果在两种情况下都保留了下来。 埃梅斯 -熟练的和缺乏的T细胞被共同转移到相同的细胞中。 拉格2 −/− 接受者(附图) 3F )。这些结果表明，Eomes不仅激活了多个靶基因的表达，而且还控制了这种特定CD4的积累。 + T细胞亚群。而标记组合pd-1 + CD 44 罗氏 适合于鉴定伊梅斯 + CD4 + T细胞在T细胞转移实验中的应用 拉格2 −/− 在老年小鼠中不能检测到相应的细胞群(补充图)。 3E )，这与这种标记组合对于识别T的一般适用性是有争议的。 R 1细胞。
总之，我们的转录组分析确定了一个T R 1细胞特异性基因标记，包含多个抑制性受体，并对关键T基因进行富集。 R 1-相关途径和标记物。我们进一步证明了这个特征的一部分是由Eomes驱动的。
Eomes驱动IL-10在人T中的表达和丰富的基因。 R 1签名 进一步研究T中Eomes控制的途径 R 1细胞，进行KEGG通路分析。最重要的路径图是“细胞因子-细胞因子受体相互作用”，其次是细胞因子在其中起着重要作用的几条途径(补充图)。 4A )。这表明Eomes对T细胞因子和细胞因子受体具有调节作用。 R 1细胞。沿着这条路线，我们在gfp中发现了上调基因。 + 依赖于Eomes存在的细胞，T R 1标志细胞因子 IL 10 (无花果) 2B 和补充图。 4B )，与以前的报告一致[ 2 ,3 ,4 ]。T细胞移植 拉格2 − /− 小鼠证实大部分产生白细胞介素-10的CD4。 + T细胞共表达Eomes(图1. 3A )。重要的是，大多数产生白细胞介素10的细胞也共同表达干扰素γ。 3B )，与先前发表的T相一致。 R 1份说明[ 3 , 41 ]。IL-10/IFN-γ共表达依赖于eome，而不是微环境中的非细胞自治因子。 埃梅斯 -CD4缺乏 + T细胞不产生IL-10，无论它们是单独转移还是与 埃梅斯 -熟练，CD4 + T细胞(图1. 3B ).
图3：表达CD4的Eomes + T细胞表达IL-10及用T表达MAP R 1细胞。 用于分析的细胞如图所述。 2 . A 脾小体产生IL-10的代表点图及定量 + 和埃梅斯 − CD4 + T细胞移植3周后 拉格2 −/− 体外用PMA/离体霉素刺激宿主，用细胞内流式细胞仪进行分析。 B 同源标记的Eomes-熟练(控制)或Eomes缺陷(KO)CD4 + T细胞被转移到单独的，或相同的。 拉格2 −/− 3周后用流式细胞仪分析脾细胞。点图显示IL-10和IFN-γ有代表性表达.白细胞介素-10产生CD4的定量研究 + 在单迁移和共传输实验中，T单元在底部被描述. C 基因集富集分析图显示Eomes依赖于T R 1个基因(图2比较2)。 2A )富含人的T。 R 1个标志性基因[ 3 ]。每个点表示单个鼠标的数据。行(A )Eomes的链接数据 − 和埃梅斯 + 来自同一只老鼠的细胞；在( B )显示中值。用Mann-Whitney检验进行统计学分析。用Wilcoxon匹配对符号秩检验对共转移设定条件下的匹配样本进行比较.* p < 0.05, **p < 0.01.
最后，我们进行了基因集富集分析，结果表明，在gfp中，已鉴定出的Eomes依赖转录本。 + 细胞(比较2)在已发表的人类T细胞中富集。 R 1基因标记(图1)。 3 c)。除了强调人类和老鼠之间的相似性 R 1细胞，这些结果证实了一小部分依赖于Eomes的基因对T是至关重要的。 R 1细胞身份。
E-TCL 1小鼠模型中白血病的发生与细胞毒性T的积累有关 R 1个细胞 探讨T的作用 R 1个细胞(定义为Eomes) + Pd-1 + )在CLL中，我们首先分析了它们在CLL小鼠模型中的存在。与年龄和性别匹配的TCL 1小鼠和WT小鼠相比，T的丰度较高。 R 1 TCL 1小鼠脾脏中的细胞。 4A ，补充图中的选通策略。 5A )。这些人中的大多数 + Pd-1 + 细胞也表达LAG 3(补充图)。 5B )，我们以前已经证明它依赖于Eomes。为克服CLL小鼠模型中CLL发育的较长潜伏期，将TCL 1小鼠的白血病脾细胞过继转移到同基因WT小鼠(TCL1AT)中。 34 , 42 , 43 ]。在tcl1at模型的白血病发展过程中，我们观察到一种抗原体验的CD4的积累。 + T细胞(附图) 5C )以CD 69的表达来表示激活的迹象(补充图)。 5D )。此外，T的频率较高 R 1 CD4 + 检测T细胞。 4A )，表现出较高的LAG 3(补充图3)的共同表达率。 5B )。有趣的是，T的频率 R 1衰老E-TCL 1小鼠的细胞数明显高于年龄较小的TCL1AT小鼠(图1)。 4A )，这与我们之前观察到的Eomes是一致的。 + CD4 + T细胞随年龄增加[ 28 ].
图4：PD-1 + CD4 + 共表达Eomes的T细胞在CLL的E-TCL 1小鼠模型中富集. A 采用流式细胞仪对E-TCL 1白血病小鼠和对照组65周龄小鼠和同种野生型(WT)小鼠移植E-TCL 1白血病细胞后的脾脏进行分析。代表点图和T的频率 R 1细胞(Eomes) + Pd-1 + )CD4 + E-TCL 1和TCL1AT小鼠的T细胞及其对照组。 B FIR × 老虎 用E-TCL 1白血病脾细胞移植小鼠脾PD-1细胞及IL-10-GFP的表达 + CD4 + 流式细胞术分析T细胞。具有代表性的点图以及CD4中IL-10表达细胞的百分比 + WT与TCL1AT中的T细胞 FIR × 老虎 老鼠。所有图形均为均值±扫描电镜。每个点表示单个鼠标的数据。用Mann-Whitney检验进行统计学分析。**p < 0.01; ***p < 0.001.
T的功能研究 R 1 TCL1AT小鼠的细胞证实了CLL患者所观察到的表型，诱导的IL-10表达随着时间的推移而增加(如图1所示)。 4 B和补充图。 5E )和更高水平的干扰素γ，CD107a，和GzmB(补充图。 5F，G )，作为细胞毒性的标志，在这些细胞中。这些数据表明T R 1细胞在CLL小鼠模型中积累，产生IL-10，并具有细胞毒性。
为了研究这种细胞类型对CLL进展的影响，我们转移了CD4。 + T细胞 拉格2 −/− 缺乏成熟B细胞和T细胞的小鼠[ 44 不包括CD8的贡献 + T细胞与白血病对照。接下来，如前面所述，用TCL 1白血病细胞移植小鼠[ 34 , 42 , 43 ]。正如之前在其他小鼠模型中所报道的，我们检测到了CD4的扩张。 + T细胞 拉格2 −/ − 有和不转移白血病细胞的小鼠(附图)。 6A )。有趣的是，CD4 + T细胞控制白血病的进展，表现为脾脏重量和每脾白血病细胞含量低于未转移T细胞的小鼠(补充图)。 6B，C )。令人感兴趣的CD4 + 白血病脾T细胞 拉格2 −/ − 小鼠T基因频率较高 R 1细胞(附图) 6d )与非白血病对照小鼠比较，LAG 3在这些细胞上有较高的共同表达(补充图)。 6E )。动物白血病刺激后T细胞增殖率增高 R 1细胞与非疾病小鼠比较(附图)。 6f )。相反，T的细胞毒性能力 R 1细胞在TCL 1白血病发展过程中未发生改变(附图)。 6g，H ).
接下来，我们聚集了FOXP 3 − CD4 + 采用T分布随机近邻嵌入法(T-SNE)，流式细胞仪检测T细胞的Eomes、PD-1、LAG 3和Ki-67的表达，推断CLL的发育是否改变了该细胞的表型。根据先前的分析，如预期的那样，T R 1细胞聚集相似，无论小鼠是否受到白血病细胞的攻击(补充图)。 6I )，提示TCL 1白血病并不改变该细胞的表型，而是诱导其增殖。
总之，细胞毒性T的积累 R 1细胞建议研究他们在控制CLL进展中的作用。
Eomes对T是不可缺少的 R 1细胞调控TCL1AT小鼠白血病的发生发展 分析T的作用 R 1细胞控制CLL进展，我们使用条件 埃梅斯 击倒( 埃梅斯 −/− )小鼠，正如我们所表明的，Eomes对生成功能性T是必不可少的。 R 1个细胞，与以前的报告一致[ 2 ]。WT或 埃梅斯 −/− CD4 + T细胞移植到 拉格2 −/− 小鼠继之TCL 1白血病细胞过继转移。对这些小鼠CLL进展的分析表明： 埃梅斯 −/− CD4 + T细胞未能控制CLL的发展，CD5的增多就证明了这一点。 + CD 19 + 血液中的CLL细胞和较高的脾脏重量。 5A )。我们进一步监测了CD4 + 随着时间的推移，这些小鼠的T细胞增多，并观察到受体小鼠血液中T细胞数量增加。 埃梅斯 −/− CD4 + T细胞与WT T细胞的比较(图1)。 5B )。然而，在这些动物的脾脏中，CD4的绝对数量较低。 + 脾T细胞和CLL细胞 埃梅斯 −/− 与WT组比较(图1)。 5 c)。与此相一致， 埃梅斯 −/− 根据Ki-67染色，脾脏T细胞的增殖率低于WT T细胞(图1)。 5D )，这表明Eomes对于T的膨胀是很重要的。 R 1细胞。我们的数据显示T的富集和更高的激活状态 R 1 CLL患者淋巴器官中的细胞，我们随后对这些小鼠的脾脏T细胞进行T分析。 R 1-相关分子。与RNA测序结果一致的是，与WT T细胞相比，Eomes缺乏导致LAG 3的表达降低(图1)。 5 e)。此外，Eomes对于IL-10的生产是不可或缺的。 5F )和细胞毒性功能，我们观察到干扰素γ的表达降低，CD107a略有下降，Eomes缺陷的T细胞中GzmB的产量显著降低(见图)。 5G ).
图5：Eomes对T是至关重要的 R 1细胞介导的CLL对照。 拉格2 −/− 小鼠移植静脉注射。PBS或CD4 + 野生型T细胞(WT)或 埃梅斯 − / − E-TCL 1小鼠白血病脾细胞起源于第1天和第2天。用流式细胞仪在指定的时间点对血液和脾脏标本进行分析。 A CD5绝对数 + CD 19 + 移植白血病细胞后4周，外周血CLL细胞随时间和脾脏重量变化而变化。 B CD4绝对数 + 外周血T细胞随时间的变化而变化。 C CD4数 + 脾脏T细胞和CD4细胞数 + T细胞/CD5 + CD 19 + 显示CLL细胞。 D 占KI-67的百分比 + 脾外CD4细胞 + T细胞 E LAG 3所占百分比 + 脾pd-1细胞 + CD4 + T细胞 F IL-10-GFP在脾Pd-1中的表达 + CD4 + T细胞显示为有代表性的直方图和量化数据。 G 用PMA/离体霉素体外刺激脾细胞，细胞内流式细胞仪检测细胞因子的表达。干扰素γ频率 + Pd-1细胞 + CD4 + T细胞，pd-1的CD107a和GzmB的nMFI + CD4 + T细胞所有图形均为均值±扫描电镜。每个点表示单个鼠标的数据。用Mann-Whitney检验进行统计学分析。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. Tx = transplantation, nMFI = normalized median fluorescence intensity.
总之，Eomes对控制小鼠CLL的进展是非常重要的，因为它介导了CD4的扩张和细胞毒性。 + T细胞
IL-10R信号维持细胞毒性T R 1个单元，并允许它们控制CLL。 独创性路径分析 埃梅斯 -依赖基因 IL 10 和 STAT 3 作为最有潜力的上游调整器(补充表) 7 )。在线上，IL-10R信号已经被证明对T是必不可少的。 R 1功能[ 45 ]。因此，我们决定研究IL-10R介导的信号在T细胞中的作用。 R 1细胞及其对TCL 1白血病控制的影响。任一 Il10rb +/+ (WT)或 Il10rb −/− CD4 + T细胞 拉格2 −/− 小鼠后移植TCL 1白血病。令人感兴趣， Il10rb -CD4缺乏 + T细胞对CD5升高的CLL的抑制作用 + CD 19 + TCL1AT后4周，CLL随时间和脾脏重量增加而计数，与接受WT T细胞的对照组比较(图1)。 6A )。评估是否减少了 Il10rb −/− CD4 + T细胞参与了CLL控制的减少，随着时间的推移，血液中T细胞计数被监测.白血病细胞转移后3周和4周，较高数量的白血病细胞 Il10Rb −/− 对WT CD4 + 血中可见T细胞。 6B )。CD4 + 脾脏T细胞计数呈增加趋势。 Il10rb −/− CD4 + T细胞与WT脾T细胞的比较(附图)。 7A )，这很可能反映了 Il10rb −/ − 组，作为CD4的数量 + 与WT组相比，这些小鼠每只CLL细胞的T细胞减少。 6B )。然而，CD4的增殖 + 用Ki-67测得的T细胞在两组间没有显着性差异(图二)。 6C )。因此，IL-10 R介导的信号在CD4中起作用。 + T细胞对CLL的有效控制是必需的，而这并不主要是由于T细胞的扩张。
图6：il-10R信号通过维护功能T来控制cll的发展 R 1细胞。 拉格2 −/− 小鼠移植静脉注射。PBS或CD4 + 野生型T细胞(WT)或 Il10rb −/− E-TCL 1小鼠白血病脾细胞起源于第1天和第2天。用流式细胞仪对血液和脾脏标本进行分析。 A CD5绝对数 + CD 19 + 移植白血病细胞后4周，外周血CLL细胞随时间和脾脏重量变化而变化。 B CD4绝对数 + 随着时间的推移，外周血中的T细胞和CD4的数量都有变化。 + T细胞/CD5 + CD 19 + 显示CLL细胞。 C 占KI-67的百分比 + 脾外CD4细胞 + T细胞 D Eomes频率 + Pd-1 + 脾外CD4细胞 + T细胞 E 串联脾WT T的T-SNE图 R 1个细胞和 Il10rb −/− 埃梅斯 + Pd-1 + CD4 + T细胞基于流式细胞术检测PD-1、Eomes、LAG 3和Ki-67的表达(上段)。两种细胞类型在深蓝色和浅蓝色与WT FOXP 3的叠加 − CD4 + T细胞在灰色(较低的地块)。 F 用PMA/离体霉素体外刺激脾细胞，细胞内流式细胞仪检测细胞因子的表达。干扰素γ频率 + Pd-1细胞 + CD4 + T细胞，pd-1的CD107a和GzmB的nMFI + CD4 + T细胞所有图形均为均值±扫描电镜。每个点表示单个鼠标的数据。用Mann-Whitney进行统计学分析。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. nMFI = normalized median fluorescence intensity.
IL-10Rα信号对T细胞的分化是不可缺少的。 R 1个细胞，但不是这种细胞类型的功能[ 45 ]。同样，我们调查了 Il10Rb 对于T R 1细胞。如 Il10rb −/− CD4 + T细胞表现出较高的T细胞频率。 R 1细胞比WT T细胞(图1)。 6d )，我们聚集了FOXP 3 − CD4 + WT和T细胞 Il10Rb −/− 用流式细胞仪检测其Eomes、PD-1、LAG 3和Ki-67的表达，采用t-SNE算法进行比较分析。有趣的是，埃梅斯 + Pd-1 + CD4 + TR 1-样细胞 Il10Rb −/− WT T的起源聚类 R 1个细胞(图1)。 6E 和补充图。 7b )，很可能是由pd-1的高表达所驱动。这表明IL-10R信号对于维持T是至关重要的。 R 1细胞表型。这一发现进一步得到了细胞毒性功能降低的支持。 Il10rb −/− 埃梅斯 + Pd-1 + CD4 + T细胞与WT T细胞的比较 R 1个细胞(图1)。 6f )，认为这些细胞在白细胞介素-10R缺乏时会产生不同的表型。
综上所述，我们的数据表明，Eomes对于细胞毒性T的积累是不可或缺的。 R 1细胞，一种细胞类型，其功能依赖于IL-10R信号，这限制了CLL的进展.
