VacDZ嵌合登革/寨卡病毒感染性克隆的构建 我们构建了我们的嵌合登革热/寨卡病毒VacDZ的感染性克隆。 1 )，通过修改我们现有的DENV2-16681传染性克隆 35 。VacDZ的感染性克隆，称为pVacDZ，是利用传统的分子克隆技术(附图)构建的。 1 ).
DENV2的16681株是PDK-53的亲本菌株。虽然pdk-53与亲本野生型denv 2-16681有几个突变，但只有三个突变对pdk-53：5‘UTR-c57t、ns1-g53d和ns3-e250v的衰减是必要和足够的。 9 ,10 ,11 ,29 。因此，我们只将这三个弱突变引入到我们的感染性克隆中来构建pVacDZ(图1)。 1 ，补充数字 1 )。我们还将PRM信号序列、PRM蛋白和Env蛋白的编码区域替换为ZIKV菌株PRVABC 59的对应序列。 1B )。在衣壳-prm连接处的prm信号序列被替换，因为先前对登革热/西尼罗河病毒嵌合体的研究表明prm蛋白需要上游的同源信号序列才能正确处理。 11 。还显示了Env-NS1结处的信号序列(图1)。 1C ).
Flavivirus感染性克隆质粒可能高度不稳定，这种不稳定性可以阻止嵌合疫苗感染性克隆的构建。 10 ,19 。因此，为了稳定pVacDZ感染克隆，我们采取了两种策略。首先，我们利用一个可诱导的cmv启动子(ter-mincmv)来稳定黄病毒感染的克隆。 35 ,36 。其次，我们将一个内含子序列克隆到ns1编码区。 37
我们还构建了一个vacdz的Δgdd突变体，作为dna疫苗研究的对照(补充图)。 2 )。Vacdz-Δgdd有一个致命的删除‘甘氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸’催化三位一体的NS5核糖核酸依赖的rdp(Rdp)。 4 。VacDZ-Δgdd可以表达少量病毒蛋白，但不能进入病毒复制周期的指数型RNA复制和蛋白表达阶段。
利用DNA发射拯救VacDZ 我们的感染克隆的病毒拯救是通过dna发射进行的，感染的克隆质粒与ptet-off高级辅助质粒共转染。 35 ,36 。转染后，辅助性质粒激活感染克隆的Tre-minCMV启动子，再由宿主核机械转录病毒RNA。病毒RNA最终被加工成一个功能强大的病毒基因组，可以建立正常的病毒复制周期。VacDZ在BHK-21细胞中被dna发射救出，生产种子。利用病毒在BHK-21细胞中传代扩增VacDZ种子，产生工作细胞，再用菌斑法测定其效价。
VacDZ表达ZIKV包膜蛋白 我们首先验证了VacDZ是否表达ZIKV Env蛋白。BHK-21细胞感染VacDZ或亲本DENV2-16681或ZIKV.以模拟感染细胞作为对照。然后固定细胞，用免疫荧光法分析病毒蛋白的表达。感染vacdz、denv 2-16681或zIKV的细胞被发现表达黄病毒ns1蛋白，而模拟感染的细胞则不表达黄病毒ns1蛋白(补充图)。 3 )。感染vacdz或zkv的细胞也能表达zkv env蛋白，而模拟感染细胞和deviv 2-16681感染细胞则不表达zkv env蛋白(补充图)。 3 )。这表明VacDZ表达ZIKV Env蛋白的目的是正确的。
Vacdz保留pdk-53的小斑块表型。 为了验证vacdz的潜在安全性，我们研究了vacdz是否保留了denv 2-pdk-53疫苗株衰减的关键标志，即小菌斑表型、温度敏感性、哺乳小鼠神经毒性的衰减以及AG 129小鼠的致病性减弱。 9 ,10 ,11 ,19 ,29
我们首先调查VacDZ是否保留小斑块表型。通过对BHK-21细胞进行空斑分析，比较了VacDZ与亲本野生型DENV2-16681的斑块形成表型。VacDZ形成的斑块明显小于DENV2-16681(图1)。 2 A，b)，证实VacDZ保留小斑块表型。
图2：斑块形成及温度敏感性测定。 对VacDZ在细胞培养中的衰减标志进行了研究。 a 用VacDZ和亲本DENV2-16681对BHK-21细胞进行空斑形成实验，研究小斑块表型。两种病毒的孵育时间为6天。用结晶紫染色显示斑块。 b VacDZ和亲本DENV2-16681的平均斑块大小比较，用像素宽度测量。数据表示10个斑块的平均数。采用单因素方差分析方法进行统计学分析。统计意义：* P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001. Temperature sensitivity assay for c VacDZ d DENV2-16681 e 比较37°C和39°C(黑线和洋红线)对BHK-21细胞病毒复制动力学的影响。用菌斑法分析病毒复制滴度。温度敏感性定义为病毒滴度(PFU/ml)在39°C时相对于37°C的下降(PFU/ml)。
VacDZ复制动力学与温度敏感性 其次，我们研究了VacDZ与亲本野生型DENV2-16681和ZIKV的复制动力学。我们还研究了vacdz是否保持了温度敏感性表型，这是一种衰减标记，定义为在39°C时，1-log或更高的病毒滴度相对于37°C降低。 11
我们比较了这四种病毒在黄病毒研究中的生长动力学：bhk-21小仓鼠肾细胞、Vero非洲绿猴肾细胞、huh-7人肝癌细胞和c6/36细胞。 埃及伊蚊 蚊子细胞。细胞感染VacDZ、DENV2-16681或ZIKV.感染后，每日取上清，用菌斑法测定细胞外病毒滴度。对BHK-21细胞的温度敏感性进行了研究。
在BHK-21细胞中，ZIKV的滴度最高，其次为VacDZ，其次为DENV2-16681(3.33×10)。 7 ，1.30×10 6 ，和3.53×10 5 (分别为PFU/ml)(图1。 2 (c-e)VacDZ和ZIKV均对温度敏感，而DENV2-16681则不敏感。 2 (c-e)
在Vero细胞中，DENV2-16681的峰滴度最高，其次是ZIKV，其次是VacDZ(2.00×10)。 6 ，1.93×10 6 ，以及1.90×10 6 (分别为PFU/毫升)(补充数字) 4A )。在Huh-7细胞中，ZIKV的滴度最高，其次为VacDZ，其次为DENV2-16681(4.33×10)。 6 ，1.13×10 6 ，和4.63×10 5 (分别为PFU/毫升)(补充数字) 4B )。对于病毒在哺乳动物细胞中的复制，VacDZ似乎通常是复制到与亲本DENV2-16681和ZIKV中间的病毒。在C6/36蚊细胞中，ZIKV的滴度最高，其次为DENV2-16681，其次为VacDZ(7.33×10)。 7 ，2.30×10 7 ，和2.53×10 5 (分别为PFU/毫升)(补充数字) 4C )。这表明vacdz在蚊子细胞中具有衰减的复制动力学，是蚊子传播能力降低的预测指标。 11 。这是非常理想的，因为疫苗株不应该被蚊子传染。 11
VacDZ基因稳定 VacDZ的潜在安全性取决于其3种衰减突变：5‘UTR-C57t、NS1-G53D和NS3-E250V。这些减毒突变对于tk-003活登革热疫苗的组成病毒是稳定的，该疫苗也利用了deviv 2-pdk-53的主干。 19 ,30 。因此，我们研究了这些衰减突变是否在VacDZ中也是稳定的。我们在BHK-21细胞中连续传代VacDZ。在第10章中，我们提取了病毒RNA，并利用下一代测序(OmicsDrivePteLtd)分析了衰减突变的逆转率。所有三种衰减突变的逆转率均小于1%(补充表) 1 )。这种程度的遗传稳定性类似于DENV2-PDK-53和其他DENV2-PDK-53衍生嵌合体。 19 。这表明VacDZ在基因上是稳定的，具有较低的回归风险。
VacDZ对乳鼠神经毒性的抑制作用 我们用两种不同的小鼠模型对VacDZ的体内安全性和有效性进行了评价。我们用哺乳小鼠模型来评估神经毒性的衰减，而干扰素缺乏的AG 129小鼠模型则用来评估vacdz的整体衰减和免疫原性。 9 ,10 ,11 ,19
在出生后24h内，用不同剂量的VacDZ、DENV2-16681、ZIKV或PBS车辆对照对新生的白ICR小鼠进行颅内接种。然后每天观察小鼠的临床症状，为期4周(如图所示)。 3A ，补充表 2 ).
图3：小鼠神经毒性和致病性研究的存活曲线。 a 哺乳小鼠神经毒性研究。用不同剂量的VacDZ、DENV2-16681或ZIKV对新生的白ICR小鼠进行颅内接种。将小鼠饲养4周，每天观察临床症状，并在达到人道终点时处死。组号：PBS控制， n =6；VacDZ， n =11适用于所有产权；DENV2， n =12%；ZIKV-100 PFU， n =14；ZIKV-10 PFU， n =7；ZIKV-1 PFU， n =10。 b 成年AG 129小鼠致病性研究。5~8周龄AG 129小鼠腹腔接种VacDZ、ZIKV或PBS对照。指示剂量为每只老鼠。组号 n =5用于ZIKV挑战，以及 n =6用于VacDZ或PBS挑战。将小鼠饲养4周，每天观察临床症状，并在达到人道终点时处死。
在受ZIKV或DENV2-16681攻击的小鼠中常见的临床症状是体重减轻、步态摆动、肢体无力或拖拉、瘫痪、驼背或活动不动。1、10、100 pfu/只小鼠的死亡率分别为80%、100%和100%。每只小鼠10只或100只DENV2-16681 PFU小鼠死亡率分别为66.7%和75%。相比之下，每只老鼠用1、10或100 pfu的VacDZ或PBS车辆控制的小鼠的死亡率为0%。与亲本DENV2-16681和ZIKV相比，VacDZ对哺乳小鼠的神经毒性明显减弱。
VacDZ对AG 129小鼠致病性减弱 我们对VacDZ在干扰素缺乏的AG 129小鼠模型中的安全性和有效性进行了评价。AG 129小鼠通常用于黄病毒疫苗的研究，因为它们对致命的黄病毒挑战高度敏感，但保留了产生适应性免疫应答的能力。 10 ,38 ,39
ZIKV株PRVABC 59(ZIKV-PRVABC 59)已知对AG 129小鼠具有致死性，而DENV2-16681对AG 129小鼠无致命性。 38 ,40 。我们首先对ZIKV-PRVABC 59在AG 129中的致病性进行了研究，以便为后续的致死性攻击研究确定合适的剂量。由于VacDZ编码ZIKV-PRVABC 59的PRM和Env蛋白，我们还研究了这些ZIKV蛋白的表达是否能提高VacDZ的致病性。
AG 129小鼠腹腔接种不同剂量的VacDZ、ZIKV或PBS载体对照。然后每天观察小鼠的临床症状，为期4周(如图所示)。 3B )。10只小鼠 3 或10 4 ZIKV小鼠的PFU死亡率为100%。在接受ZIKV攻击的小鼠中，最常见的临床症状是体重减轻，大多数小鼠达到了相对于初始体重累计减轻20%体重的人道终点。相比之下，被挑战的老鼠有10只 6 VacDZ的PFU每只鼠或与PBS车辆对照，死亡率为0%。鼠标重量的变化如附图所示 5 。这说明VacDZ对AG 129小鼠也有较弱的致病性。
VacDZ对AG 129小鼠的免疫原性 接下来，我们研究了VacDZ疫苗是否能以中和抗体或辅助T细胞反应的形式诱导对ZIKV的免疫反应。
我们测试了VacDZ作为活病毒疫苗(LiveVacDZ)和DNA启动疫苗(DNA启动VacDZ)。Dna启动的疫苗本质上是一种替代的传递方法，即在体内转染pvacdz感染性克隆，然后在体内产生活vacdz。 32 ,33 。这个活的，DNA启动的VacDZ然后可以继续建立一个正常的病毒复制周期.
目前报道的大多数dna启动的黄病毒疫苗都使用电穿孔进行体内转染。 32 ,33 。为了简化我们的DNA疫苗接种方案，我们使用了体内JetPEI转染试剂(Polyplus转染)，因为它不需要电穿孔来传递。
对于活的Vacdz，接种疫苗或增强疫苗的剂量为10。 4 每只小鼠使用VacDZ的PFU和PBS作为车辆控制。对于dna启动的VacDZ，rdp缺陷对照用80μg的pVacDZ和20μg的pTet-off高级剂，pVacDZ-Δgdd突变体80μg和pTet-off高级剂20μg作为载体对照。
AG 129小鼠首次用VacDZ、DNA启动的VacDZ或其各自的对照小鼠腹腔接种。免疫后4周，小鼠分别接种相同剂量的疫苗或对照疫苗。四个星期后，老鼠被杀死，他们的血液和器官被收获。
为了研究免疫小鼠是否存在中和抗体，我们用菌斑减少中和试验(PRNT)分析了它们的血清。接种活VacDZ或DNA启动的VacDZ的AG 129小鼠均有抗ZIKV的中和抗体(血清转化率100%)，而VacDZ能诱导更强的应答，但这种差异没有显着性(图1)。 4 ，补充表 3 )。相比之下，接种PBS载体对照、5%葡萄糖溶液对照或pVacDZ-Δgdd突变对照的AG 129小鼠血清转化率均为0%。 4 ，补充表 3 ).
图4：ZIKV中和抗体滴度对AG 129小鼠的影响。 5~8周龄AG 129小鼠腹腔接种所指示的疫苗或对照，4周后用相应剂量的疫苗或对照进行增强。4周后取小鼠血清。用PRNT法测定了ZIKV中和抗体滴度，并将其定义为在三个技术复制中将ZIKV菌斑计数降低至少50%的最高血清稀释度。每一点代表一只老鼠的中和抗体滴度。 a 接种活VacDZ疫苗的AG 129小鼠PRNT(每只小鼠10,000 PFU) n =8)或PBS车辆管制( n =6)。 b 用DNA启动的VacDZ免疫AG 129小鼠(pVacDZ，80μg的pVacDZ和20μg的pTet-off Advanceder， n =5)，5%葡萄糖溶液车辆控制(葡萄糖， n 或pVacDZ-Δgdd复制缺陷突变体(Δgdd，80μg pVacDZ-Δgdd和20μg pTet-off Advanceder)， n =4)。统计分析采用单因素方差分析，后专案分析采用Tukey HSD法。统计意义：* P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001.
活疫苗接种小鼠的抗ZIKVPRNT滴度为1：640~1：20480(几何平均滴度为3044.37)。 4A )。经dna启动的VacDZ小鼠抗ZIKVPRNT滴度为1：640~1：1280(几何平均滴度为1114.3)。 4B ).
为了研究免疫小鼠中是否存在1型或2型T辅助细胞(Th1或Th2)应答，我们分别用干扰素γ法和IL-4ELISPOT法对其脾细胞进行了分析。小鼠脾细胞在MOI为0.5时用ZIKV激活，或以添加2%FCS的RPMI培养基作为对照。接种VacDZ活疫苗的AG 129小鼠产生了明显的Th1和Th2反应(图1和2)。 5 a，b)。然而，Th1反应比Th2反应强。接种VacDZ的小鼠Th1反应比PBS对照组高10.2倍，而Th2反应仅高2倍。
图5：ELISPOT辅助细胞反应试验。 5~8周龄AG 129小鼠腹腔接种所指示的疫苗或对照，4周后用相应剂量的疫苗或对照进行增强。4周后取小鼠脾细胞。用干扰素γ-ELISPOT分析Th1反应，用IL-4ELISPOT分析Th2反应。每个点代表一个鼠标，是三个技术复制的平均点形成单元(SFU)计数。洋红色圆圈：用ZIKV激活，黑色方块：用RPMI介质控制激活。 a , b 用IFNγ和IL-4 ELISPOT法分别对接种VacDZ的AG 129小鼠(每只小鼠10,000 pfu)进行检测。 n =8)或PBS车辆管制( n =6)。 c , d 分别用pVacDZ、80μg pVacDZ和20μg pTet-off高级疫苗接种AG 129小鼠，进行IFN、IL-4ELISPOT试验。 n =5)，5%葡萄糖溶液车辆控制(葡萄糖， n 或pVacDZ-Δgdd复制缺陷突变体(Δgdd，80μg pVacDZ-Δgdd和20μg pTet-off Advanceder)， n =4)。统计分析采用单因素方差分析，后专案分析采用Tukey HSD法。统计意义：* P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001.
用dna启动的vacdz疫苗接种的小鼠产生了显著的Th1反应，但没有明显的Th2反应(图1)。 5 C和 d )。正如预期的那样，接种Δgdd突变对照的小鼠与5%葡萄糖溶液对照相比，没有出现任何明显的Th1或Th2反应(图1)。 5 C和 d )。用DNA启动的VacDZ免疫小鼠，Th1反应比5%葡萄糖溶液对照组高12.2倍。
这表明VacDZ和DNA启动的VacDZ都能以中和抗体和Th1反应的形式对ZIKV产生免疫应答。这种Th1偏倚反应和相关的干扰素γ反应是有利的，因为它们与对黄病毒的保护性免疫以及在黄病毒感染期间较轻的疾病结局有关。 41 ,42 ,43
VacDZ提供对致命ZIKV攻击的保护性免疫 最后，我们研究了VacDZ疫苗是否对致死性ZIKV攻击具有保护性免疫。在保护性免疫研究中，我们采用了一种不涉及任何增强的单一剂量方案：小鼠接种一剂疫苗或控制疫苗，然后用ZIKV进行攻击。
AG 129小鼠接种VacDZ、DNA启动的VacDZ或其各自的对照，使用上述相同剂量进行免疫原性研究。接种疫苗4周后，小鼠被注射致命剂量的ZIKV(10只)。 5 每只老鼠的PFU)。然后每天观察小鼠的临床症状，为期4周。在致命攻击四周后，小鼠被杀死，他们的血液和器官被采集。
接种PBS或5%葡萄糖溶液对照的小鼠在受到ZIKV攻击时的存活率为0%。 6 ，补充表 4 )。用复制缺陷的pVacDZ-Δgdd突变对照接种小鼠，当受到ZIKV的攻击时，存活率为20%。 6B ，补充表 4 )。相比之下，接种活的VacDZ或DNA启动的VacDZ的小鼠在受到ZIKV攻击时的存活率分别为100%和80%(如图所示)。 6 ，补充表 4 )。鼠标重量如附图所示 6 。这说明VacDZ和DNA启动的VacDZ对ZIKV都有保护作用，而VacDZ对ZIKV有较好的保护作用。
图6：AG 129小鼠保护性免疫研究的存活曲线。 5~8周龄AG 129小鼠腹腔接种所指示的疫苗或对照。接种疫苗四周后，他们被注射致死剂量为10。 5 每只小鼠ZIKV的PFU。然后将小鼠饲养4周，每天观察临床症状，并在达到人道终点时处死。 a AG 129小鼠接种VacDZ(每只小鼠10,000 PFU) n =11)或PBS车辆管制( n =10)。 b AG 129小鼠接种dna启动的VacDZ(pVacDZ，80μg的pVacDZ和20μg的pTet-off Advanceder)， n =5)，5%葡萄糖溶液车辆控制(葡萄糖， n 或pVacDZ-Δgdd复制缺陷突变体(Δgdd，80μg pVacDZ-Δgdd和20g ptet-off高级小鼠， n =5)。
其次，为了研究在存活小鼠中是否存在中和抗体，我们用PRNT分析了它们的血清。所有存活的小鼠均有抗ZIKV的中和抗体(存活小鼠血清转化率为100%)(图)。 7 ，补充表 4 )。接种VacDZ的小鼠抗ZIKVPRNT滴度为1：640~1：20480(几何平均滴度为2726.51)。存活的dna启动的VacDZ小鼠抗ZIKVPRNT滴度为1：1280~1：10240(几何平均滴度为3620.39)。
图7：免疫AG 129小鼠后ZIKV中和抗体滴度。 5~8周龄的AG 129小鼠腹腔注射单剂量的指示疫苗(或其各自的对照)。接种疫苗四周后，他们被注射致死剂量为10。 5 每只小鼠ZIKV的PFU。将小鼠饲养4周，每天观察临床症状，并在达到人道终点时处死。致死性攻击后4周，取存活小鼠血清。用PRNT法测定了ZIKV中和抗体滴度，并将其定义为在三个技术复制中将ZIKV菌斑计数降低至少50%的最高血清稀释度。每一点代表一只老鼠的中和抗体滴度。N个数字是指在致命攻击后4周存活的老鼠的数量。活VacDZ剂量为每只小鼠10,000 pfu，n=11。pVacDZ：dna发射VacDZ，pVacDZ 80μg，pTet-off高级小鼠20μg， n =4.Δgdd：pVacDZ-Δgdd复制缺陷突变体，剂量为80μg的pVacDZ-Δgdd和20μg的pTet-off高级小鼠。 n =1。
奇怪的是，被用作RDRP缺陷阴性对照的pVacDZ-Δgdd突变体似乎对ZIKV有很弱的保护作用。在AG 129小鼠的免疫原性研究中，pVacDZ-Δgdd免疫组的Th1反应最强，弱的Th1反应高于用dna启动的VacDZ免疫组的Th1反应最弱(干扰素γ-ELISPOT的平均点形成数分别为215.0和201.7)(图)。 5C )。然而，pVacDZ-Δgdd疫苗并没有诱导任何中和抗体的ZIKV，即使是疫苗接种和促进制度(图一)。 4B )。因此，我们推测pVacDZ-Δgdd能够诱导少数小鼠产生保护性T细胞反应。这可能使pVacDZ-Δgdd免疫组中的一只小鼠能够在ZIKV的致命攻击中存活下来(如图所示)。 6B )，在此过程中，老鼠也能够进行血清转换(图一)。 7 ).
